3 E RGEBNISSE SOWIE DEREN D ISKUSSION
3.2 Algorithmen und Software
3.2.4 Software zur automatisierten Auswertung
3.2.4.6 Charakterisierung der Quantifizierungsergebnisse
Die Ergebnisse der Quantifizierung werden hinsichtlich ihrer Gültigkeit und Vertrauenswür-digkeit auf der Ebene der Proben sowie auf der Ebene der Analyse charakterisiert. Die Charakterisierung resultiert im Programm in der Zuweisung eines Fehler- oder Statuswer-tes. Zu diesem Zeitpunkt in der Auswertung sind die Amplifikationskurven der selektierten Proben berechnet und korrigiert. Jede Probe besitzt einen Statuswert, der angibt, ob die berechnete Amplifikationskurve einen gültigen exponentiellen Bereich besitzt.
Zunächst wird versucht, anhand der selektierten Standards und der Angaben über den Schwellenwert die Kalibriergerade zu berechnen. Im Rahmen dieser Berechnungen wird ei-ne Reihe von Tests zur Eignung der selektierten Standards durchgeführt, die in Abb. 3-29 schematisch dargestellt ist.
Algorithmen und Software Kapitel 3.2 Wenn mehr als zwei Standards selektiert sind, werden zunächst die Standards einzeln auf ihre Eignung geprüft. Ein Standard ist dann geeignet, wenn seine definierte Konzentration größer ist als Null und die Amplifikationskurve eine erkennbare exponentielle Phase besitzt.
Sind alle selektierten Standards nach diesen Kriterien verwendbar, wird überprüft, ob die Standards mindestens zwei unterschiedliche Konzentrationen repräsentieren und ein ge-meinsamer Überlappungsbereich ihrer bestimmten exponentiellen Phasen existiert. Ist dies der Fall, werden die CT-Werte der Standards berechnet und in der Folge auch die Kalib-riergerade ermittelt, sofern für jeden Standard auch ein CT-Wert berechnet werden konnte.
Wenn die automatische Bestimmung des Schwellenwerts ausgeschaltet ist, kann es vor-kommen, dass der aktuelle Schwellenwert außerhalb der bestimmten exponentiellen Phase eines Standards liegt und damit die korrekte Berechnung eines CT-Wertes für diese Probe nicht möglich ist. Nach der Bestimmung der Parameter der Kalibriergeraden werden schließlich noch die apparenten Amplifikationseffizienzen der Standards anhand ihrer ex-ponentiellen Phasen ermittelt. Ist der Unterschied zwischen der minimalen und maximalen berechneten Effizienz der selektierten Standards größer als 0.3, wird ein Statuswert zurück-gegeben, welcher vor möglichen Unstimmigkeiten wie z. B. verhältnismäßig schlecht amplifizierten Standards warnt.
weniger als 2 Standards
unerlaubte
Konzentrations-angabe
zu wenige Standards
ungültige Konzentration
Standard nicht auswertbar zwei oder
mehr Standards
keine exp.Phase
weniger als 2 unterschiedliche Konzentrationen
unerlaubter
Konzentrations-bereich Einzeltests
Gruppentests
ansonsten
kein Überlappungs-bereich aller exp. Phasen
keine gemeinsame exp.
Phase
ansonsten
CT-Werte der Standards
ermitteln
Schwellenwert außerhalb der exp. Phase
Ungültiger Schwellenwert
ansonsten Prüfung der Anz.
selektierter Standards
Kalibrierkurve ok weniger als
2 Standards
unerlaubte
Konzentrations-angabe
zu wenige Standards
ungültige Konzentration
Standard nicht auswertbar zwei oder
mehr Standards
keine exp.Phase
weniger als 2 unterschiedliche Konzentrationen
unerlaubter
Konzentrations-bereich Einzeltests
Gruppentests
ansonsten
kein Überlappungs-bereich aller exp. Phasen
keine gemeinsame exp.
Phase
ansonsten
CT-Werte der Standards
ermitteln
Schwellenwert außerhalb der exp. Phase
Ungültiger Schwellenwert
ansonsten Prüfung der Anz.
selektierter Standards
Kalibrierkurve ok
Abb. 3-29 Entscheidungsdiagramm zur Bestimmung des Fehlerwerts der quantitativen A-nalyse. Erklärung siehe Text.
Algorithmen und Software Kapitel 3.2
ungültiger Schwellenwert
negativ
ok kein CT-Wert
keine exp. Phase
∆ε < −0.3
∆ε > +0.3
unbekannte Probe
Konz. > cmax
Konz. < cmin
ansonsten
Effizienz zu niedrig Effizienz zu
hoch Konzentration
zu hoch Konzentration
zu niedrig positiv
positiv positiv ansonsten
ansonsten
ansonsten Kalibrierung
ok
ungültiger Schwellenwert
negativ
ok kein CT-Wert
keine exp. Phase
∆ε < −0.3
∆ε > +0.3
unbekannte Probe
Konz. > cmax
Konz. < cmin
ansonsten
Effizienz zu niedrig Effizienz zu
hoch Konzentration
zu hoch Konzentration
zu niedrig positiv
positiv positiv ansonsten
ansonsten
ansonsten Kalibrierung
ok
Abb. 3-30 Entscheidungsdiagramm zur Charakterisierung der Ergebnisse der Quantifizie-rung der selektierten Proben. ∆ε ist der Unterschied der berechneten Effizienz aus der exponentiellen Phase der jeweiligen Amplifikationskurve zur mittleren Effizienz aller selektierten Proben mit auswertbarer exponentieller Phase, cmax und cmin sind die größte bzw. kleinste Konzentration der selektierten Standards. Erklärung siehe Text.
Die abschließende Charakterisierung aller Proben im Einzelnen erfolgt im Anschluss an die Konzentrationsbestimmungen. Das Entscheidungsdiagramm dazu ist in Abb. 3-30 darge-stellt. Während der Berechnung der Amplifikationskurven aus den Rohdaten wurde bereits für jede Probe festgestellt, ob eine erkennbare bzw. auswertbare exponentielle Phase exis-tiert. Konnte für die Probe keine exponentielle Phase ermittelt werden, wird sie als negativ eingestuft.
Besitzt die Amplifikationskurve eine exponentielle Phase, konnte aber für den aktuellen Schwellenwert kein CT-Wert ermittelt werden, schneidet der Schwellenwert die Kurve nicht innerhalb ihrer exponentiellen Phase, was als ungültiger Schwellenwert bezeichnet wird.
Besitzt die Probe eine erkennbare exponentielle Phase und konnte ein CT-Wert berechnet werden, wird die Probe als positiv gewertet. Wenn es sich bei der betreffenden Probe um eine Unbekannte handelt und die Kalibrierung erfolgreich war, wird zusätzlich festgestellt, ob die berechnete Konzentration der Probe innerhalb des durch die Standards abgedeck-ten Konzentrationsbereichs liegt. Ist das nicht der Fall, wird ein entsprechender Statuswert zurückgegeben.
Die Charakterisierung der Quantifizierungsergebnisse für die Proben wird zur Anzeige des Status in den Ergebnissen in Abhängigkeit vom jeweiligen Probentyp interpretiert. Die Ein-stufung als „positiv“ sollte z. B. im Falle einer Negativkontrolle mit einer Warnung
gekenn-Algorithmen und Software Kapitel 3.2 zeichnet werden, wohingegen dieselbe Einstufung bei einer Positivkontrolle keine Warnung auslösen sollte. Die möglichen Ergebnisse mit den Symbolen zur Kennzeichnung der Ein-stufung sind in Tab. 3-2 aufgeführt.
Tab. 3-2 Interpretation der Charakterisierung und Symbole zur Darstellung. Grüne Sym-bole zeigen an, dass bei der Charakterisierung und Interpretation der Ergebnisse dieser Probe keine Auffälligkeiten aufgetreten sind. Gelbe Symbole warnen vor möglicherweise fehlerhaften Ergebnissen, rote Symbole zeigen an, dass ein Standard nicht verwendet werden kann oder dass die Kontrolle als falsch-positiv oder falsch-negativ charakteri-siert wurde.
Symbol Bedeutung Standards
Positiv: Gültiger Standard. Bei einer gültigen Kalibriergeraden ist auch die Konzentration dieses Standards anhand der Kalibriergerade sowie der Variationskoeffizient als prozentuale Abweichung der berechneten von der angegebenen Konzentration ermittelt.
Ungültiger Schwellenwert. Der Schwellenwert befindet sich damit in jedem Falle außerhalb der Überlappungsbereichs der exponentiellen Phasen der selektierten Standards. Eine Kalibriergerade kann für diesen Schwellenwert nicht berechnet werden.
ε
Effizienz zu hoch. Das Ergebnis der gesamten Quantifizierung könnte fehlerhaft sein.ε
Effizienz zu niedrig. Das Ergebnis der gesamten Quantifizierung könnte fehlerhaft sein.Die Amplifikationskurve des Standards hat keine erkennbare exponentielle Phase (negativ). Solange dieser Standard selektiert ist, kann keine Kalibriergerade berechnet werden.
Unbekannte
Positiv: Ein CT-Wert ist berechnet, bei einer gültigen Kalibriergeraden auch die Konzentration dieser Probe.
Negativ.
Konzentration zu hoch: Die berechnete Konzentration ist nicht innerhalb des durch die selektierten Standards abgedeckten Konzentrationsbereichs.
Konzentration zu niedrig: Die berechnete Konzentration ist nicht innerhalb des durch die selektierten Standards abgedeckten Konzentrationsbereichs.
Ungültiger Schwellenwert: Es ist kein CT-Wertberechnet, die Probe ist aber positiv, d. h.
die Amplifikationskurve besitzt eine erkennbare exponentielle Phase.
ε
Effizienz zu hoch: Der ermittelte CT-Wertund die bei gültiger Kalibriergerade berechnete Konzentration der Probe könnte falsch sein, weil beispielsweise ein falsches Produkt mit höherer Effizienz amplifiziert wurde.ε
Effizienz zu niedrig: Der ermittelte CT-Wert und die bei gültiger Kalibriergerade berechnete Konzentration der Probe könnte falsch sein, weil beispielsweise ein falsches Produkt mit geringerer Effizienz amplifiziert wurde.Algorithmen und Software Kapitel 3.2
Symbol Bedeutung Positivkontrollen
Positiv: Ein CT-Wert ist berechnet, bei einer gültigen Kalibriergeraden auch die Konzentration dieser Probe.
Ungültiger Schwellenwert: Es ist kein CT-Wert berechnet, die Probe ist aber positiv, d. h.
die Amplifikationskurve besitzt eine erkennbare exponentielle Phase.
ε
Effizienz zu hoch: Die Probe ist zwar positiv, jedoch ist möglicherweise ein falsches Produkt mit höherer Effizienz amplifiziert worden.ε
Effizienz zu niedrig. Die Probe ist zwar positiv, jedoch ist möglicherweise ein falsches Produkt mit geringerer Effizienz amplifiziert worden.Falsch negativ.
Negativkontrollen Negativ.
Ungültiger Schwellenwert: Es ist kein CT-Wert berechnet, die Probe ist aber falsch-positiv, d. h., die Amplifikationskurve besitzt eine erkennbare exponentielle Phase.
ε
Effizienz zu hoch: Die Probe ist zwar falsch-positiv, jedoch ist möglicherweise ein falsches Produkt mit höherer Effizienz amplifiziert worden.ε
Effizienz zu niedrig: Die Probe ist zwar falsch-positiv, jedoch ist möglicherweise ein falsches Produkt mit geringerer Effizienz amplifiziert worden.Falsch positiv. Ein CT-Wert ist berechnet, bei einer gültigen Kalibriergeraden auch die Konzentration dieser Probe.
Die vom Programm automatisch durchgeführten Charakterisierungen der Amplifikati-onskurven und deren Interpretation helfen dem Anwender, die erhaltenen Ergebnisse rich-tig zu werten. Zum einen wird dadurch sichergestellt, dass die Randbedingungen für eine quantitative Auswertung eingehalten werden, zum anderen werden Proben gekennzeichnet, die durch abweichende Amplifikationskurven auffallen. So ist z. B. die Konzentrationsbe-stimmung einer Probe mit einer Amplifikationskurve, deren exponentielle Phase nicht paral-lel (innerhalb gewisser Toleranzen) zu jenen der Standards verläuft, normalerweise nicht richtig. Die abweichende apparente Amplifikationseffizienz kann hier auf einen Fehler hin-weisen. Möglicherweise wird bei dieser Probe eine andere Sequenz als die Zielsequenz (co-)amplifiziert oder die Zusammensetzung bzw. die Menge der Komponenten des Reaktions-ansatzes sind fehlerhaft. Durch die entsprechende Warnung kann der Anwender auf solche möglichen Fehler aufmerksam gemacht werden und die Messung gegebenenfalls wieder-holen.