Neue Metabolite aus Strobilurus tenacellus

Für die Hauptproduktion wurden die Experimente daher in vier Liter-Ansätzen und über einen Zeitraum von neun Tagen vorgenommen, um beide Produktionsanstiege zu erfassen (siehe Kapitel III 3.2 Abb.11). Für die Fütterungen wurden täglich 3 mmol/L der jeweiligen Benzoesäure vom 2. – 8. Tag der Fermentation in einem Intervall von 12 Stunden zugegeben.

Parallel wurden über den gleichen Zeitraum insgesamt drei Massenprozent des Salzes hinzugefügt. Die Aufarbeitung erfolgte wie bei den Fluor-Derivaten mittels Säulenchromatographie und HPLC. Aus den Experimenten mit 3-Hydroxybenzoesäure und den Halogensalzen konnten über HPLC mehrere Metabolite erkannt werden. Jedoch waren die Ausbeuten der verschiedenen Derivate zu gering, um eine Strukturaufklärung vorzunehmen. Diese lagen zum Teil weit unter 0.2 mg/L. Der erhoffte Effekt, die Ausbeute durch Zusatz von Benzoesäure zu steigern, blieb aus.

Ein anderes Bild zeigte sich bei den Fütterungen von 4-Hydroxybenzoesäure und Halogensalzen. Nach Aufarbeitung konnte man im Dünnschichtchromatogramm jeweils zwei

O H

1

3

6 10 8

11

1 17 18

19

20 21

24

26

27 28

23

Strobilurine bei der Zugabe mit Kaliumfluorid und Kaliumchlorid erkennen. Bei der gleichzeitigen Zugabe von Kaliumbromid waren drei Derivate und unter Verwendung von Kaliumiodid sogar vier verschiedene Strobilurine nachzuweisen. Aufgrund der Lichtempfindlichkeit der Strobilurine konnten aber nicht alle Substanzen isoliert und aufgeklärt werden. In vielen Fällen haben sich die Derivate zersetzt. Neben Strobilurin A wurden drei weitere Strobilurin-Derivate, sowie ein auffälliger Spot aufgereinigt, deren Strukturaufklärung nun folgen soll.

Ergosterol (23)

In allen Experimenten war ein stark UV-Löschender und mit Anis dunkel violett anfärbender Spot auf dem Dünnschichtchromatogramm zu sehen. Die Substanz konnte als weißer Feststoff isoliert werden. Sie löst sich gut in Chloroform und DMSO, jedoch kaum in Methanol. Der Schmelzpunkt beträgt 168 °C. Im EI-Massenspektrum konnte der Peak höchster Masse mit m/z = 396 bestimmt werden. Aus dem ¹H-NMR-Spektrum konnten 44 Protonen und aus dem ¹³C-NMR-Spektrum 28 Kohlenstoffatome abgeleitet werden.

Die Anzahl der Doppelbindungsäquivalente wurde zu sieben bestimmt, von denen drei durch Doppelbindungen, ersichtlich in den NMR-Spektren, eingenommen werden. Demnach muss die Struktur vier Ringe aufweisen. Eine Struktursuche in Antibase und anschließender Literaturvergleich führte zu Ergosterol (23).

Strobilurin B (13)

Das Experiment 4 führte zu 6,9 mg eines farblosen Öles. Die Substanz färbte mit Anisaldehyd/H2SO4 blau an. Dem EI-Massenspektrum konnte eine Masse von 322 g/mol entnommen werden. Ein weiterer Peak mit einer um 2 Masseneinheiten höhere Masse (m/z = 324), dessen Intensität 33 % entspricht, deutete auf ein Isotopensignal hin. In der Literatur ist [M+2]^+. ≥ 33% M^+. für Chlorisotopensignale beschrieben. Daraus folgte, dass in der Substanz ein Chlor-Atom enthalten ist.

Dem ¹H-NMR-Spektrum waren 17 Protonen zu entnehmen, von denen drei aromatischen Ursprungs sind. Die chemischen Verschiebungen zeigten eine hohe Ähnlichkeit zu 5. Das

13C-NMR-Spektrum wies 17 Kohlenstoffatome aus, von denen fünf der Acrylateinheit zuzuordnen waren. Ein anschließender Abgleich mit Literaturdaten führte zu der Identifizierung von Strobilurin B (13).

Strobilurin H (15)

Insgesamt konnten 1.7 mg eines farblosen Öles aus Experiment 6 isoliert werden. Auch diese Substanz färbte mit Anisaldehyd/H2SO4 blau an. Im EI-Massenspektrum war der Peak höchster Masse bei m/z = 288. Neben dem für Strobilurin typischen Signal im ¹ H-NMR-Spektrum konnte aufgrund der Aufspaltung der aromatischen Protonen eine 1,3-di- Substitution angenommen werden.

Zudem waren im Spektrum drei Methoxygruppen zu erkennen. Dem ¹³C-NMR-Spektrum konnten 17 Kohlenstoffatome entnommen werden. Hier waren die typischen Signale für die Acrylateinheit zu erkennen. Die Vermutung, dass es sich um Strobilurin H handelt, konnte durch Abgleich mit Literaturdaten bestätigt werden. Strobilurin H wurde bisher nur aus Bolinea lutea isoliert.⁷⁸

CH₃

4-Deschlor-4-brom-strobilurin B (24)

Aus dem Experiment 5 konnten 6,3 mg eines farblosen Öles isoliert werden. In der Wärme färbte die Substanz mit Anisaldehyd/H2SO4 ebenfalls blau an. Aus dem EI-Massenspektrum war eine Masse von 366 g/mol sowie ein weiterer Peak mit [M+2]^+. ≥ 98 % M^+. (s. Abb. 29) zu entnehmen, was erneut auf ein Isotopensignal schließen lässt. Die Intensität ist ein Hinweis auf Brom. Das Isotopensignal ist auch bei den Fragmenten m/z = 309 und 229 zu sehen.

Abb. 29: EI-Massenspektrum von 24

Dem ¹H-NMR Spektrum waren 19 Protonen zu entnehmen. Von denen konnten neun drei Methoxygruppen und drei einer Methylgruppe zugeordnet werden. Auch das für Strobilurine typische Singulett für 12-H bei δH = 7.40 konnte identifiziert werden. Der Tieffeldbereich ist gekennzeichnet durch die Signale dreier aromatischer sowie drei olefinischer Protonen. Das Aufspaltungsmuster der aromatischen Protonen impliziert eine 1,3,4-Substitution. Im Vergleich mit Strobilurin A waren zwei aromatische Protonensignale zu höherem Feld sowie das Proton 5-H zu tieferem Feld verschoben.

Dem ¹³C-NMR-Spektrum waren 17 Kohlenstoffatome zu entnehmen. Ausgehend von Strobilurin A kann die gleiche ungesättigte Seitenkette angenommen werden. Der ehemalige Phenylring wurde durch zwei Substituenten erweitert. Die chemische Verschiebung des Signals bei δC = 157.4 zeigt eine aromatische Methoxygruppe an. Über die Signallage bei δC = 111.0 und das Massenspektrum kann auf einen Bromsubstituenten geschlossen werden.

CH₃

O CH₃ C O

H₃

O Br

C O H₃

24

Über die mesomeren und induktiven Effekte des Halogens erklären sich auch die Hoch- und Tieffeldverschiebungen der aromatischen Protonen. Eine eindeutige Klärung der Position von Brom- und der Methoxysubstituent am Aromaten konnte durch Messung eines 2D-NOE-NMR-Spektrum vorgenommen werden (s. Abb. 30).

Abb. 30: NOE-Experiment zur Bestimmung der Position von Brom

Es konnte eine Kopplung über den Raum des bei δH = 6.90 Singuletts (2-H) auf die Protonen der Methoxygruppe (δH = 3.83) beobachtet werden. Dies ist nur möglich, wenn die Methoxygruppe in ortho-Stellung zum 2-H steht. Daraus kann die 4-Position für Brom und die 3-Position für die Methoxygruppe als bewiesen angesehen werden. Bei dem isolierten Strobilurin-Derivat handelt es sich somit um 4-Dechloro-4-bromo-strobilurin B, das bisher in der Literatur nicht beschrieben wurde.

2-H