Bisherige Ergebnisse anderer Arbeitsgruppen 1. Untersuchungen in Prag

Erste Untersuchungen zur Biosynthese von 5 wurden unter „Biosynthesis of Mucidin…“ im Jahre 1982 von V. Musilek et. al. veröffentlicht.⁷⁷ Die Untersuchungen wurden am Stamm Oudemansiella mucidia aus der Gruppe der Basidiomyceten durchgeführt, aus dem die Arbeitsgruppe Ende der 60´er Jahre 5 isolierte. Die Fütterungen mit ¹⁴C-markierten Vorläufern erfolgten während des sechsten Tags der Fermentation, am siebten Tag wurde aufgearbeitet. Die Fütterungen ¹³C-markierter Vorläufern erfolgten vom sechsten bis zum neunten Tag der Fermentation im Abstand von 24 Stunden, am zehnten Tag wurde geerntet.

Aus diesen Experimenten ergab sich das in Abbildung 6 dargestellte Einbaumuster mit den genannten Einbauraten.

Atom Chem.Verschiebung

(ppm) [1-¹³C]Acetat [2-¹³C]Acetat [1-¹³C]Benzoesäure

C-13 167.3 2.0 % --- ---

Abb. 6: Einbaumuster der Fütterungsexperimente in Prag und die spezifischen Einbauraten⁷⁷ Aufgrund des beobachteten Einbaus von Phenylalanin und Benzoesäure wird davon ausgegangen, dass der Aufbau des aromatischen Systems auf dem Shikimat-Weg erfolgt. Eine Erklärung für den Aufbau der Seitenkette gestaltete sich schwieriger. Aus dem Einbaumuster der [1-¹³C]Acetat Fütterungen ergab sich, dass zwei ¹³C markierte Kohlenstoffatome im Molekül nebeneinander liegen, für die keine Kopplung beobachtet werden konnte. Ein Erklärungsansatz ist, dass es sich bei C-13 um einen Vorläufer mit einem C-Atom handelt und die Seitenkette ansonsten durch die Kondensation von Acetateinheiten entsteht. Nicht nur

CH₃ [DL-C²H₃]Methionin

dieser Sachverhalt ist kritisch zu betrachten, sondern auch die angebenden Einbauraten aus den ¹³C-Acetat Experimenten. Die sind zumeist schwach, was die Ursache für nicht beobachtbare Kopplungen zwischen C-13 und C-12 sein kann.

2.2. Untersuchungen in Bristol

„Biosynthetic Studies of Strobilurin“ ist der Titel der zweiten Arbeit, die sich mit der Biosynthese von 5 beschäftigt.⁷⁸ Zur Durchführung der Biosynthese-Experimente diente der Stamm Bolinea lutea, welcher zur Gruppe der Ascomyceten gehört. Grundlage für die ersten Versuche waren die Arbeiten aus Prag. Die ersten Experimente mit [1,2-¹³C2]Acetat wurden unter verschiedenen Bedingungen durchgeführt. So wurden einzelne Fütterungen an Tag 4, 5 und 6 mit jeweils 50 mg/L sowie eine weitere Fütterung jeweils Tag 3, 4, 5 und 6 der Fermentation mit insgesamt 50 mg/L [1,2-¹³C2]Acetat durchgeführt. Lediglich das Experiment über mehrere Tage führte zu einem schwachen Einbau. Weitere Experimente mit Benzoesäure und Zimtsäure, die jeweils in der ortho-, meta- oder para-Stellung mit Fluor markiert waren, wurden auch über den langen Fütterungszeitraum durchgeführt. Alle Experimente führten entweder zu wenig aussagekräftigen oder keinen Ergebnissen. Das gleiche Bild zeigte sich bei einem Experiment mit 4-Fluorphenylalanin. Bei dem Experiment mit 3-Fluorphenylalanin konnte jedoch ein Einbau von 19% ermittelt werden, für den in Abbildung 7 folgender Mechanismus formuliert wird.

Abb. 7: Mechanismus zur Bildung von 3-Fluorstrobilurin A (12) ausgehend von 3-Fluorphenylalanin⁷⁸

Die Ergebnisse ließen vermuten, dass die Vorläufer nicht membrangängig sind und dem Organismus für die Biosynthese somit nicht zur Verfügung stehen. Man entschloss sich daher, die Vorläufer in Form von SNAC-Thioestern einzusetzen. Erwartet wurde mit N-Acetylcysteamin eine Steigerung der Akzeptanz des Vorläufers zu erreichen.

NH₂

Einige Ergebnisse der verschiedenen Experimente unter diesem Gesichtspunkt sind in Tabelle 2 zusammengefasst.

Vorläufer

Strobilurin A Einbau [%]

Strobilurin B Einbau [%]

[1,2-¹³C2]Acetat --- ---

[7-¹³C]Benzoesäure Thioester 28 10

2-Fluorbenzoesäure Thioester 44 ---

3-Fluorbenzoesäure Thioester 45 ---

4-Fluorbenzoesäure Thioester 30 ---

2-Fluorzimtsäure Thioester 62 ---

3-Fluorzimtsäure Thioester 67 ---

4-Fluorzimtsäure Thioester 78 ---

3-Fluor-4-methoxybenzoesäure Thioester --- 54 3-Fluor-4-methylbenzoesäure Thioester --- 22 Tabelle 2: Einbauraten aus den verschiedenen Fütterungsexperimenten in Bristol ⁷⁸

Auffällig ist, dass erneut kein Einbau von [1,2-¹³C2]Acetat in der Seitenkette beobachtet wurde. Alle anderen Experimente verliefen positiv. Die hohen Einbauraten der verschiedenen Fluorzimtsäure Vorläufer bei Strobilurin A mit weit über 50 % lassen darauf schließen, dass Zimtsäure ein Intermediat während der Biosynthese ist. Auch könnte Zimtsäure die Startereinheit sein. Erstaunlich sind auch die hohen Einbauraten bei den analogen Versuchen mit fluormarkierter Benzoesäure als Thioester, die zwischen 30 und 45 Prozent liegen.

Benzoesäure kann somit auch als Startereinheit in Betracht gezogen werden. Die Frage nach der Startereinheit sowie nach dem Aufbau der Seitenkette wird in dieser Arbeit jedoch nicht eindeutig geklärt. Eine Veröffentlichung der Ergebnisse wurde nicht vorgenommen, da es nicht gelungen war, die fluormarkierten Strobilurine von den nicht markierten zu trennen. Die oben genannten Einbauraten wurden daher aus den Massenspektren der Gemische beider Verbindungen ermittelt.

Dennoch wurde anhand der vorliegenden Versuchsergebnisse, sowie unter Berücksichtigung der Ergebnisse aus Prag, ein möglicher Biosyntheseweg aufgezeichnet, der in Abbildung 5 dargestellt ist.

Abb. 8: Hypothetischer Biosyntheseweg für den Aufbau der Seitenkette von 5⁷⁸

Aufgrund des in Prag beobachteten Acetat-Einbaus wird angenommen, dass der Seitenkette drei Einheiten zugrunde liegen. Die Methylgruppen sollten daher zu verschiedenen Zeiten aus SAM (S-Adenosyl-Methionin) kommen. Als Startereinheit fungiert in Abbildung 8 Benzoesäure jedoch kommt auch Zimtsäure, wie in Abbildung 7 gezeigt in Betracht.

SR

Im Falle der Zimtsäure würde dann die Seitenkette im weiteren Verlauf nur um zwei Acetat-Einheiten verlängert werden. Im Zuge einer Umlagerung entsteht 5 (Abbildung 9).

Abb. 9: Hypothetische Umlagerung die zur Bildung von 5 führt⁷⁸

Im ersten Schritt der Umlagerung wird eine Epoxid Bildung postuliert. Anschließend erfolgt eine säurekatalysierte Ringöffnung des Epoxid, dem sich eine Pinacol ähnliche Umlagerung anschließt. Eine Keto/Enol-Tautomerie führt zum Vinylalkohol, der durch Methylierung das Strobilurin A (5) ergibt.

Ein möglicher Biosyntheseweg für Strobilurin B (13) wurde ebenfalls aufgezeigt.⁷⁸ Der Weg beruht auf der Annahme, dass 13 aus 5 hervorgeht. Die vermuteten Intermediate Strobilurin F1 (14) und Strobilurin H (15) sind beide aus dem Stamm isoliert worden.

Abb. 10: Hypothetische Bildung von 13 ausgehend von 5⁷⁸

C

Strobilurin F₁ (14) Strobilurin H (15)