Acetat-Pool-Hypothese

Aufgrund der unterschiedlichen Einbauraten bei Fütterungen zum frühen und späten Zeitpunkt sollte herausgefunden werden, ob sich dieser Effekt auf eine „Speicherung von Acetat“ im Organismus zurückführen lässt. Zur Klärung dieser Frage wurden zwei weitere Fütterungsexperimente mit [1-¹³C] Acetat durchgeführt. Im ersten Experiment erfolgte die Fütterung vom zweiten bis zum sechsten Tag (langer Zeitraum) im Abstand von 24 Stunden.

Im zweiten Versuch wurden markiertes und unmarkiertes Acetat im Verhältnis 1:1 gemischt und dann vom zweiten auf den dritten Tag der Fermentation alle sechs Stunden zugegeben.

Die Auswertung der NMR-Daten zeigt Tabelle 7; zusätzlich ist noch das Ergebnis des Einbaus zum frühen Zeitpunkt aufgeführt.

Tabelle 7: Einbau an [1-¹³C] Acetat in 5 verschiedenen Fütterungsexperimenten

3.5.1. Diskussion

Aus den Experimenten zum frühen Zeitpunkt konnte ein Einbau von 23.53% erhalten werden.

Zudem war die Ausbeute an 5 höher als bei einer normalen Fermentation zu diesem Zeitpunkt. Die hohen Einbauraten beim frühen Fütterungszeitraum und die erhöhte Ausbeute können dadurch erklärt werden, dass Acetat in einem Pool für die Biosynthese bereitgestellt wird. Aufgrund der hohen Konzentration des markierten Vorläufers zu Beginn der Ausbildung des Acetat-Pools wird dieser überwiegend mit markiertem Acetat gefüllt. Somit kommt es zu hohen Einbauraten, wenn man die Fütterung zu einem frühen Zeitpunkt durchführt. Zudem wird durch Zugabe von Acetat zu einem früheren Zeitpunkt die Biosynthese von 5 gefördert, da der Pool rechtzeitig von außen gefüllt wird. Diese Befunde sprechen für eine Acetat-Pool-Bildung, bei der Acetat zunächst gespeichert, und dann aus diesem Speicher für die Biosynthese von 5 genutzt wird.

Ein weiteres Indiz für die Pool-Bildung sind die Ergebnisse aus den Fütterungen zum späteren Zeitpunkt der Biosynthese. Die Zugabe des Vorläufers erfolgte zu einem Zeitpunkt entsprechend dem Anstieg der Ausbeute gemäß dem Produktionsverlauf (Abb. 11) von 5.

Obwohl in der gleichen Konzentration wie beim ersten Versuch gefüttert, ist der Einbau wesentlich geringer. Das zugegebene Acetat wird mit nicht markiertem Acetat, welches der Pilz bereitstellt, gemischt. Dies lässt sich mit einer Acetat-Pool-Bildung gut erklären.

C-Atom

Aus diesen Überlegungen heraus, und um die Acetat-Pool-Bildungs Hypothese zu untermauern, wurden die weiteren Experimente durchgeführt. So ergab die Fütterung eines Gemisches von markiertem und unmarkiertem Acetat im Verhältnis von 1:1 zum frühen Zeitpunkt eine Einbaurate von 8.96 %. Demgegenüber steht ein spezifischer Einbau von 23.53 % bei der Fütterung von 100% markiertem Acetat zum gleichen Zeitpunkt. Zu erwarten gewesen wäre eine Einbaurate von ungefähr 12 %. Der etwas geringere Einbau kann darauf zurückzuführen sein, dass im Pool schon mehr Acetat enthalten war als im ersten Experiment.

Der spezifische Einbau von 26.7 % bei der Fütterung über mehrere Tage deutet ebenfalls auf eine Pool-Bildung hin. In dem Pool wäre demnach annähernd eine konstante Menge an markiertem Acetat, das zum Aufbau von 5 dient. Zu erwarten wäre ein Einbau, der dem des Fütterungsexperimentes zum frühen Zeitpunkt entspricht. Der etwas höhere Einbau kann dadurch erklärt werden, dass der Pool kontinuierlich mit einer hohen Konzentration von markiertem Acetat gefüllt wurde. Hierdurch wird während des Produktionsanstiegs mehr markiertes Acetat aus dem Pool zum Aufbau von 5 verwendet.

Zudem lässt sich die Acetat-Pool-Bildungs Hypothese aus den auftretenden statistischen Kopplungen erklären, die in Abbildung 16 gezeigt sind.

Abb. 16: Statistische Kopplungen zwischen C-11 in 5 in Abhängigkeit der gefütterten Konzentration an [1-¹³C]Acetat zum frühen Zeitpunkt (a. = 12 mmol/L; b. = 6 mmol/L).

Statistische Kopplungen sind selten zu beobachten, da die natürliche Häufigkeit von ¹³C bei 1.1 % liegt. Die auftretende Kopplung zwischen einem angereicherten Kern mit einem benachbarten Kern, der die natürliche Häufigkeit aufweist, ist daher sehr schwach (siehe Kapitel IV 3.2). Die in den vorgenommenen Fütterungen zu beobachtenden statistischen Kopplungen hingegen weisen eine gut sichtbare Aufspaltung zum Dublett auf. Dies lässt sich nur durch eine hohe Einbaurate am Anfang der Produktbildung erklären. Zu diesem Zeitpunkt tragen viele Moleküle in 5 eine Markierung an C-11 und C-13. Da die Umlagerung

78 Hz

78 Hz

a.) b.)

intramolekular läuft (s. Abb.15), ergibt sich in diesen Fällen die Kopplung. Bei später gebildeten Molekülen verdünnt sich die Markierung. Die tatsächlich gefundene Einbaurate ist gewissermaßen ein Mittelwert, der durch die Markierung in Molekülen mit unterschiedlicher Einbauqualität entsteht.

Führt man den Versuch zum frühen Zeitpunkt mit unmarkierten/markiertem Acetat in einem Verhältnis von 1:1 durch, so ist beim Vorliegen eines Acetat-Pools eine Abschwächung der Signalintensität um 50 % zu erwarten. Wie in Abbildung 16 gezeigt, konnte die vermutete Intensitätserniedrigung von ca. 50 % beobachtet werden.

3.6. Ausblick

Weitere Hinweise auf die Umlagerung zum Acrylat könnte eine Kultivierung des Stammes in einer ¹⁸O2-Atmosphäre liefern. Zu erwarten wäre ein Isotopenschift bei C- 12. Auch mit einer Kultivierung in D2O sollte ein Hinweis auf den Mechanismus der Umlagerung ergeben. Im EI-Massenspektrum von 5 wäre ein M+1 Peak zu beobachten, weil 12-H partiell durch Deuterium substituiert sein sollte. Zudem wäre im ¹H-NMR Spektrum eine Abschwächung des 12-H-Signals zu erwarten.

Eine Steigerung der Ausbeuten von 5 könnte eventuell erreicht werden, wenn dem Medium frühzeitig Acetat zugesetzt wird. Ausgehend von der Acetat-Pool Hypothese würde die Produktion von 5 zu einem früheren Zeitpunkt gefördert. Der Stamm reagiert jedoch mitunter sehr empfindlich auf Vorläufer, so dass zuvor in einer größeren Versuchsreihe die verträgliche Acetatkonzentration zu ermitteln wäre.

Molekulargenetische Untersuchungen an diesem Stamm könnten weitere Erkenntnisse zum Biosyntheseablauf liefern. Vor allem die Identifizierung des für die Umlagerung verantwortlichen Enzyms wäre von Interesse, weil sich durch dieses erst die für die biologische Aktivität so wichtige Acrylateinheit ausbildet. Für die kombinatorische Biosynthese würde somit ein weiteres interessantes Enzym als Werkzeug zur Verfügung stehen.