Nachweis von Campylobacter spp

Kultureller Nachweis

Der kulturelle Campylobacter-Nachweis wurde erst in den 70er Jahren etabliert, da Campylobacter sehr anspruchsvoll in der Anzucht ist (MOORE et al. 2005).

Er erfolgt entweder durch direktes Ausplattieren des Probenmaterials auf dem Nährboden oder durch eine vorgeschaltete Selektivanreicherung in einem Flüssigmedium (JACOBS-REITSMA 2008). Dem direkten Ausplattieren kann die Filtrationsmethode vorgeschaltet werden (BUTZLER et al. 1973). Hierbei ermöglicht die geringe Größe des Erregers die Passage durch einen Membranfilter, beispielsweise aus Cellulose-Acetat (GOOSSENS et al. 1986). In den meisten Fällen ist die Voranreicherung der Proben in Anreicherungsbouillons angebracht, um die Wiederfindungsrate bei vorgeschädigten Erregern oder geringer Keimzahl zu verbessern (FITZGERALD et al. 2008). Es stehen verschiedene selektive Anreicherungsmedien (Preston-Boullion, Bolton-Anreicherung, usw.) und Nähragars (Karmali-Agar, Thioglyklolat-Agar, Skirrow-Agar) zur Verfügung. Die Spezial-Nährböden zur Campylobacter-Isolierung beinhalten häufig selektierende Antibiotika sowie Zusätze von Blut oder Kohle, um die Wirkung toxischer Sauerstoffverbindungen auf die empfindlichen Campylobacter spp.

abzuschwächen. Im Allgemeinen ergibt sich durch Kombination mehrerer Anzuchtmedien eine größere Isolationsquote als bei Verwendung eines einzigen Mediums (ENDTZ et al. 1991b).

Beim kulturellen Nachweis thermophiler Campylobacter spp. sind die besonderen Erregereigenschaften Mikroaerophilie und Thermophilie zu berücksichtigten. Zur Schaffung dieser Atmosphäre werden Anaerobierbrutschränke oder Anaerobiertöpfe verwendet (BOLTON et al. 1983). Die Bebrütung thermophiler Campylobacter spp. bei 42 °C bringt den Vorteil einer gewissen Selektion gegenüber meso- und psychrophilen Keimen mit sich. Auf den meisten Nährböden wachsen Campylobacter als flache graue unregelmäßige Kolonien. Sie zeigen keine Hämolyse auf Blutagar. Um das typische Schwärmen beobachten zu können, ist der Einsatz frischer, nicht ausgetrockneter Nährböden nötig (FITZGERALD et al. 2008). Zu Verwechslungen führen könnte die ähnliche Koloniemorphologie von Arcobacter (VANDAMME et al. 1992). Von präsumptiven Campylobacter-Kolonien wird eine

gram-Färbung angefertigt und außerdem die drehende Beweglichkeit der Bakterien im hängenden Tropfen beurteilt.

Weiterführende Differenzierungsmethoden

Zur weiterführenden Diagnostik zwecks Speziesdifferenzierung isolierter Campylobacter spp.

können phänotypische Methoden, wie die biochemische Feindifferenzierung, Serotypisierung, oder Resistenztestung, eingesetzt werden.

Die biochemische Differenzierung der einzelnen Campylobacter-Spezies voneinander ist schwierig, da eine vergleichsweise geringe biochemische Aktivität vorliegt und kaum Variationen im Verhalten auftreten (FITZGERALD et al. 2008). Die positive Chromoxidasereaktion ist typisch für alle Vertreter der Gattung, während die Katalasereaktion je nach Spezies unterschiedlich ausfällt. C. coli, C. jejuni und C. lari reagieren Katalase-positiv, während beispielsweise C. upsaliensis Katalase-negativ reagiert. Mittels Hippurat-Hydrolysetest lassen sich C. coli von C. jejuni unterscheiden, da hier C. jejuni als einzige Campylobacter-Spezies positiv reagiert (VANDAMME et al. 1992; ON 2001). Doch kann es dabei durch abweichende Reaktionen zu einer Überbewertung des C. jejuni-Anteils kommen (STEINHAUSEROVA et al. 2001), sodass ergänzend eine PCR zur Detektion des Hippurikasegens angewendet werden sollte.

Die früher einmal mögliche Speziesdifferenzierung mithilfe der Bestimmung der Antibiotikaresistenz wird mittlerweile durch erworbene Resitenzen erschwert. So eignet sich die Nalidixinsäureresistenz nicht mehr zur Abgrenzung von C. lari gegenüber C. coli und C. jejuni, da sich auch bei diesen Spezies Nalidixinsäureresistenzen entwickelt haben (ENDTZ et al.

1991a).

Es sind zwei verschiedene Serotypisierungsmethoden beschrieben worden: das Penner-System nutzt die Typisierung von hitzestabilen Oberflächenantigenen (HS-System) mit Hilfe passiver Hämagglutination (PENNER et al. 1980), das Lior-System basiert auf dem Nachweis wenig charakterisierter, hitzelabiler Oberflächenantigene (HL-System) mittels Objektträgeragglutination (LIOR et al. 1982). Da aber viele Stämme mittels Serotypisierung nicht näher zu differenzieren sind, ist die ergänzende Differenzierung mit einer genotypischen Methode angebracht (WASSENAAR et al. 2000).

Sonstige Nachweismethoden

Campylobacter spp. sind langsamwachsende und besonders anspruchsvolle Bakterien. Daher hat neben dem klassischen kulturellen Nachweis auch die Polymerase Chain Reaction (PCR) als molekularbiologische Methode Bedeutung (GONZALEZ et al. 1997; MARSHALL et al. 1999).

Je nach verwendetem Primer kann so die Zugehörigkeit zur Gattung Campylobacter, zu den einzelnen Spezies, wie C. coli oder C. jejuni, oder die Stammdifferenzierung innerhalb einer Spezies mittels Amplifizierung bestimmter Genabschnitte identifiziert werden (GAULL 2003).

Eine moderne Multiplex-Realtime-PCR bietet den Vorteil, dass Mischinfektionen mit C. coli und C. jejuni erkannt werden. Eine neuetablierte Kolonieblothybridisierung dient dem Nachweis von Kolonien verschiedener Spezies auf einer Agarplatte und verfeinert damit die kulturelle Diagnostik (HÄNEL et al. 2008). In der Humanmedizin spielt seit einigen Jahren der Antigennachweis im Kot mittels ELISA eine Rolle (HÄNEL et al. 2008). An genotypischen Methoden sind außerdem Ribotyping, Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE), Flagellin-Typing (fla typing) (WASSENAAR et al. 2000) und Multilocus-Sequenz-Typing (MLST) (DINGLE et al. 2005) im Einsatz.

Serologischer Nachweis

Für die Detektion von Campylobacter-Antikörpern beim Schwein wurden bisher einzelne serologische Untersuchungen beschrieben. Beispielsweise beruht die Studie von VON ALTROCK et al. (VON ALTROCK et al. 2006) auf der Immunoblot-Methode. Der von VON ALTROCK et al. eingesetzte Immunoblot war IgG-isotypspezifisch und beruhte auf dem Einsatz eines Vollzell-Mischantigens dreier Stämme C. coli und C. jejuni. KRAMER et al.

(2001) stellten anlässlich eines Kongresses erste Ergebnisse der Entwicklung eines LPS (Lipopolysaccharid)-Mix-ELISAs zum Nachweis von Antikörpern gegen C. coli und C. jejuni beim Schwein vor. Sie berichteten von einer guten Sensitivität und Spezifität dieses ELISAs.

KLEY (2003) entwickelte in ihrem Dissertationsvorhaben einen ELISA zum Nachweis von C. coli und C. jejuni. Dieser war in der Lage, Infektionen der Schweine mit Untersuchung von Serum und Fleischsaft zu detektieren. Die Autorin berichtet allerdings von Schwierigkeiten bei der Beurteilung der Probenergebnisse, da aufgrund fehlender Negativ-Seren ein Cutoff nicht

festzulegen war. Für die Humanmedizin ist ein kommerzieller ELISA (recomWell^®Campylobacter) erhältlich, welcher sowohl IgA als auch IgG-Ak gegen C. coli und C. jejuni detektiert und auf rekombinanten, Campylobacter-spezifischen Antigenen basiert. Hier zeigte eine Testphase, dass zur Beurteilung des Campylobacter-Immunstatus immer die Ergebnisse des IgG- und IgA-Nachweises gemeinsam und zusätzlich klinische Hinweise hinzugezogen werden müssen (HÄNEL et al. 2008).

2.3.3 Epidemiologie

Campylobacter spp. sind die häufigste gemeldete Ursache akuter Gastroenteritis in den Industrieländern (MOORE et al. 2005). Dennoch bestehen bezüglich der Epidemiologie viele Unklarheiten und die Übertragungswege sind weit weniger bekannt als beispielsweise bei Salmonella spp. (EKDAHL et al. 2005).

Die thermophilen Campylobacter spp., in erster Linie C. coli und C. jejuni und seltener C. lari, sind Auslöser der Campylobacter-Enteritis beim Menschen. Campylobacter spp. sind weitverbreitet und kolonisieren als enterale Kommensalen im Gastrointestinaltrakt von landwirtschaftlichen Nutztieren (Geflügel (JORGENSEN et al. 2002), Schweine (GÖRGEN et al. 1983), Schafe und Rinder (STANLEY et al. 2003)) und Haustieren (Hunde und Katzen (HALD et al. 1997)). Diese stellen Reservoire von Campylobacter spp. dar und sind in der Regel asymptomatische Träger (HUMPHREY et al. 2007). Allgemein ist Campylobacter streng an seine enterale ökologische Nische adaptiert und kann nicht in der Umwelt replizieren. Jedoch kann der Keim in Biofilmen und Wasser einige Zeit in der VBNC-Form (viable but not culturable) überleben (ALTEKRUSE et al. 2003). In diesem Stadium überlebt das Bakterium zwar, ist jedoch nicht kultivierbar. Die genauen prozentualen Anteile der einzelnen auslösenden Ursachen humaner Campylobacteriosen sind unklar (JACOBS-REITSMA 2008). Die größte ätiologische Bedeutung wird dem Konsum nicht ausreichend erhitzten Geflügelfleisches beigemessen (THORNS 2000; BFR 2009). In Deutschland sind die Campylobacter-Funde in Geflügelfleisch seit Jahren unverändert hoch, so waren im Jahr 2005 31,1 % und im Jahr 2007 32,67 % der Geflügelfleischproben positiv (RKI 2006; BFR 2009). Nachdem in Belgien aufgrund eines Dioxinskandals Geflügelfleischprodukte vom Markt genommen wurden, sank die Infektionsrate der humanen Campylobacteriose um geschätzte 40 % (VELLINGA et al.

2002). Auch in Deutschland lässt sich eine Parallele zwischen dem Vorkommen von Campylobacter in Geflügelfleisch und humanen Campylobacteriosen aufzeigen (BFR 2008a).

Als weitere Ursachen sind der Konsum von Rohmilch (FAHEY et al. 1995), aber auch von rohem, beziehungsweise nicht durchgegartem, Fleisch vom Schwein, Rind und Schaf beschrieben. Generell ist die Kontaminationsrate von rohem Schweinefleisch mit unter 1,5%

(BFR 2009) sehr niedrig, weshalb der Genuss für den Verbraucher ein eher geringeres Risiko darstellt (HÄNEL et al. 2008).

Auch der enge Kontakt zu infizierten Haustieren kann eine mögliche Infektionsquelle darstellen, da Hunde und Katzen häufig Träger des Erregers sind (MORENO et al. 1993). In nordischen Ländern führt der Genuss von unbehandeltem kontaminiertem Oberflächengewässer regelmäßig zu humanen Infektionsausbrüchen (MOORE et al. 2005). Auch das Schwimmen in kontaminierten Seen ist als Risikofaktor für humane Campylobacter-Enteritis bekannt (SCHONBERG-NORIO et al. 2004).

2.3.3.1 Campylobacter spp. beim Menschen

Seit dem Jahr 2005 übersteigt die Zahl der humanen Campylobacteriosen die der Salmonellosen. Campylobacter-Gastroenteritiden waren 2007 in Deutschland mit 66.107 Erkrankungen gemäß Meldung nach Infektionsschutzgesetz die häufigsten bakteriellen Durchfallerkrankungen. Auch EU-weit sind Campylobacter-Infektionen die meistberichtetste Gastroenteritisursache (EFSA 2010). Laut TAM et al. (2003) sind 90 % aller humanen Campylobacteriosen durch die Spezies C. jejuni bedingt. Auch in Deutschland wird bei erkrankten Menschen hauptsächlich die Spezies C. jejuni (71,1 %) isoliert, gefolgt von C. coli (6,3%) und C. lari (1%). Bei 20,8 % der humanen Isolate erfolgte keine Weiterdifferenzierung zwischen C. coli und C. jejuni (RKI 2008). Auffällig ist eine ausgeprägte Saisonalität des Auftretens humaner Campylobacter-Enteritis, sie tritt in Europa vermehrt in der warmen Jahreszeit auf (NYLEN et al. 2002).

Infektionsverlauf

Viele Campylobacter-Infektionen verlaufen asymptomatisch, bei Manifestation der Infektion tritt gewöhnlich eine akute Enteritis auf. Die häufigsten Symptome sind (hämorrhagische) Diarrhoe, Abdominalkrämpfe, Fieber und Müdigkeit (WITTENBRINK 2002). Bemerkenswert ist die sehr geringe Infektionsdosis (ca. 800 Keime) im Vergleich zu anderen lebensmittelassoziierten Krankheitserregern (BLACK et al. 1988). In der Regel ist die Krankheit bei immunkompetenten Personen selbstlimitierend und die Symptome verschwinden nach ca. einer Woche. Als seltene postinfektiöse Komplikation tritt das Guillain-Barré-Syndrom (GBS) auf, welches eine immunvermittelte Polyradikuloneuropathie des peripheren Nervensystems darstellt und (NACHAMKIN 2002). Ätiologisch bedeutsam sind für das GBS außer Campylobacter auch andere Bakterien bzw. Viren (Anonymous 1998).

Therapie

Eine symptomatische Therapie mit Volumen- und Elektrolytsubstitution ist bei enteralen Verläufen meist ausreichend (RKI 2005). Bei hohem Fieber, septikämischer Streuung und schweren klinischen Verläufen ist eine antibiotische Therapie mit Erythromycin oder Fluorchinolonen angezeigt. Der Einsatz von ß-Lactamen empfiehlt sich aufgrund weit verbreiteter Resistenzen weniger (ENGBERG et al. 2001). Gegen Fluorchinolone wird eine stärkere Resistenzentwicklung als gegen Erythromycin beobachtet, weshalb bevorzugt Erythromycin zur Therapie gewählt werden sollte (ALTEKRUSE et al. 2003; VLIEGHE et al.

2008).

2.3.3.2 Campylobacter spp. beim Schwein

Schweine stellen ein bedeutendes Campylobacter-Reservoir dar (YOUNG et al. 2000), da sie den Erreger sehr oft in der Faezes ausscheiden (WEIJTENS et al. 1999).

Verschiedene Autoren beschreiben C. coli beim Schwein als Kommensalen, da die Prävalenz bei Schweinen sehr hoch ist und keinerlei Erkrankungen auslöst (GÖRGEN et al. 1983;

WEBER 1985; GAULL 2003). Schweine sind von Geburt an hochempfänglich gegenüber der

Campylobacter-Kolonisation (YOUNG et al. 2000); die Erregerübertragung geschieht in der Regel von der Muttersau auf die Ferkel (WEIJTENS et al. 1997). Mit zunehmendem Alter sinkt die Ausscheidungsrate im Kot (WEIJTENS et al. 1993; YOUNG et al. 2000).

In einer Untersuchung in den Niederlanden waren über 85 % der Schlachtschweine positiv (WEIJTENS et al. 1993), deutsche (GÖRGEN et al. 1983), französische (FOSSE et al. 2008a), kanadische (MAFU et al. 1989) und schweizer (SCHUPPERS et al. 2005) Studien ergaben Prävalenzen im Kot von nahezu 100 %. Eine Metastudie von FOSSE et al. (2009) beschreibt 69,7 % Prävalenz in Faezes oder Rektuminhalt als Median aus elf verschiedenen Studien.

Generell gibt es zum Vorkommen von Campylobacter im Lymphknoten weniger wissenschaftliche Studien als zum Vorkommen im Kot, aber die vorliegenden Studien lassen niedrigere Raten in den Lymphknoten als im Kot erahnen. So fand man beispielsweise in den Jejunallymphknoten bei deutschen Schweinen eine Prävalenz von 45,8 % (FRIES et al. 2002) bzw. 45,6 % (LEUE 2005) und bei norwegischen Schweinen von 29,2 % (NESBAKKEN et al.

2003). In frischen Schweinefleischproben lagen die Isolationsraten 2006 in Deutschland bei 0,7 %, in anderen europäischen Ländern waren sie auf vergleichbar niedrigem Niveau (EFSA 2007).

Im Allgemeinen herrscht die Meinung vor, dass Geflügel vornehmlich C. jejuni und Schweine eher C. coli beherbergen (MANSER et al. 1985). Eine Wirtspreferenz von C. coli liegt bezüglich des Schweines vor (LEBLANC MARIDOR et al. 2008). Laut EFSA wird bei Schweinen fast immer C. coli isoliert und nur in Ausnahmefällen C. jejuni (2007), was auch durch das Speziesverhältnis in zahlreichen Studien, beispielsweise von VARELA et al. (2007) mit 0,2 % C. jejuni vs. 99,2 % C. coli oder von SCHUPPERS et al. (2005) mit 1,2 % C. jejuni vs. 96,3 % C. coli bestätigt wird. Allerdings zeigten im Gegensatz dazu Studien von YOUNG et al. (2000) und FINLAY et al. (1986) erstaunlich hohe C. jejuni-Prävalenzen (bis 82 %) beim Schwein. Coinfektionen mit beiden Spezies kommen vor, C. jejuni beherbergende Schweine tragen häufig auch C. coli (BOES et al. 2005).

WEITJENS et al. (WEIJTENS et al. 1999) stellte bei wiederholter Beprobung starke Schwankungen in der Keimauscheidung im Kot fest. Die Ursachen für die intermittierende Erregerausscheidung könnten beispielsweise in einer mukusassoziierten Akkumulation von Campylobacter in der Tiefe der Darmkrypten oder einer inhomogenen Kolonisation verschiedener Darmabschnitte begründet sein (LEE et al. 1986).

Risikofaktoren

Insgesamt liegen bisher vergleichsweise wenig Studien zu Risikofaktoren bezüglich Campylobacter-Prävalenzen in Schweinemastbetrieben vor (FOSSE et al. 2009). WEIJTENS et al. (2000) zeigten den Einfluss der Umweltkontamination mit Campylobacter als Risikofaktor für eine Reinfektion des Bestandes auf. Nach einer Grundreinigung und -desinfektion der Stallgebäude wurden SPF-Schweine wiedereingestallt, diese Maßnahme der Dekontamination führte 20 Monate lang zur Senkung der Infektionen. Die Campylobacter-Pävalenz betrug in dem grundgereinigten Betrieb nur 22 %, während sie in einem Kontrollbetrieb bei 98 % lag (WEIJTENS et al. 2000). Somit scheint Reinigung und Desinfektion des Stalles den Keimdruck zu senken und die Campylobacter-Prävalenzen deutlich zu beeinflussen. Auch ALTER et al. vermuten, dass unzureichend gereinigte Abteile eine kontinuierliche Infektionsquelle mit Campylobacter spp. darstellen könnten, da die Campylobacter-Funde in der Umgebung nach Reinigung und Desinfektion der Buchten zwar deutlich weniger (1,6 % statt 9,2 %), doch immer noch Erreger vorhanden waren (ALTER et al.

2005b). In Umgebungsproben werden regelmäßig Campylobacter spp. isoliert, obwohl das Bakterium eine relativ geringe Tenazität gegenüber Umwelteinflüssen besitzt. VON ALTROCK et al. (2006) isolierten Campylobacter spp. von Tränken, Trögen, Stiefeln und Wasserhähnen der untersuchten Schweinebestände. KASIMIR (2005) gelang die Isolation des Erregers auf Fliegen, einer Nippeltränke und einem Wassertrog. ALTER et al. (2005b) fanden 0,7 % positive Umgebungsproben, unter anderem in einem Trog, einer Ratte und zwei Fliegen.

GAULL (2003) fand in 4,2 % der Umgebungsproben Campylobacter vor. Auch WEITJENS et al. vermuteten den möglichen Eintrag in die Bestände über Schadnager, Wildvögel bzw. den Landwirt selbst (WEIJTENS et al. 1997). Eine Unterdrucklüftung des Stallgebäudes scheint einen protektiven Effekt zu erzeugen (WEIJTENS et al. 2000).

WEHEBRINK (2007) führte als Risikofaktoren für eine höhere Campylobacter-Prävalenz eine kleine Bestandsgröße (unter 1.000 Tieren) und anthelminthische Behandlung auf, während in ihrer Studie die Aufstallung in getrennten Ställen und antibiotische Behandlung zu Anfang der Mastperiode protektive Faktoren darstellen. FOSSE et al. (2009) vermuteten, dass kleinere Betriebe möglicherweise generell ein weniger gutes Hygienemanagement praktizierten und dadurch die Campylobacter-Prävalenzen höher als in größeren Betrieben lagen. Obwohl es im

Geflügelbereich in zahlreichen Studien gelang, kontaminiertes Wasser und Futter als Risikofaktor zu identifizierten (PEARSON et al. 1993), wurde jener Zusammenhang im Schweinebereich noch nicht nachgewiesen (FOSSE et al. 2009). In einer Studie von ALTER et al. (ALTER et al. 2005a) waren Futter- und Tränkewasserproben erregerfrei und scheinen auch laut WEIJTJENS et al. (2000) und JACOBS-REIMTSMA et al. (1995) keine Rolle für den Erregereintrag zu spielen. WEITJENS et al. (1993) ermittelten keinen Unterschied zwischen Trocken- und Flüssigfütterung, jedoch wurde vom gleichen Autor eine protektive Wirkung bei manueller Fütterung der Mastschweine ausgemacht (2000). WEHEBRINK (2007) entdeckte signifikant höhere bakteriologische Campylobacter-Prävalenzen, wenn Futter zugekauft wurde.

WELLS et al. (2010) beschreiben die Reduzierung des Vorkommens enteraler Campylobacter spp. durch Zusatz von Kupfersulfat und Carbadox zum Futter, zweier in den USA eingesetzter Wachstumspromotoren. Bezüglich der Stallumgebung beschrieb WEHEBRINK Teilspaltenböden als Risikofaktoren (2007), welche im Vergleich zu Vollspaltenböden mit höheren Campylobacter-Funden korreliert waren.

Bekämpfung

WEIJTENS et al. (2000) halten die Campylobacter-Bekämpfung in Schweinbeständen für praktikabel. Da sich die Saugferkel sehr früh über den Kontakt zur Muttersau infizieren (WEIJTENS et al. 1993), müsste die Bekämpfung unter Miteinbeziehung der Muttersauen erfolgen. Die frühe Trennung der Ferkel von der Sau und nachfolgend mutterlose Aufzucht wurde hierfür in Betracht gezogen. NESBAKKEN et al. (2007) nahmen hingegen aufgrund der hohen Prävalenz von bis zu 100 % an, dass die Schaffung Campylobacter-freier Betriebe nicht machbar ist.