Mikrodilutionstest und MHK-Wert

Der Mikrodilutionstest gilt mittlerweile als der goldene Standard zur Resistenzbestimmung (AARESTRUP et al. 2008a). Die Erstbeschreibung des Dilutionstests stammt bereits von Alexander FLEMING (1929). Die ursprünglich verwendete Makrodilutionsmethode wurde in den 1960ern zur heutigen Mikrodilutionsmethode weiterentwickelt (TURNIDGE et al. 2007).

Der in der Mikrodilutionsmethode bestimmte MHK-Wert entspricht der minimalen Schwelle, bei der unter definierten Bedingungen durch eine antimikrobielle Substanz die Vermehrung einer Testkeimpopulation verhindert wird, bzw. diese Testkeimpopulation abgetötet wird (WIESNER et al. 2000). Der MHK-Wert ist zwar nur ein semiquantitativer Wert, aber derzeit die beste Art, eine Aussage über die Antibiotikaresistenz eines Bakteriums zu treffen.

Besonders die Reproduktion der Ergebnisse ist ein kritischer Punkt, da die Technik (Methode, Medien und verwendete Zusätze, Menge und Konzentration des Inokulums, Inkubationstemperatur und -dauer) starke Auswirkungen auf die Höhe der MHK-Werte haben (AARESTRUP et al. 2008a). Unter standardisierten In-vitro-Bedingungen ist der ermittelte MHK-Wert ein Maßstab für notwendige Gewebskonzentration, um am Infektionsort das Infektionsgeschehen zu unterdrücken (SCHWARZ et al. 2003). Grundlage für den Therapieerfolg ist bei zeitabhängig wirkenden Antibiotika eine lange anhaltende Überschreitung der MHK eines Erregers im Zielgewebe. Im Gegensatz dazu kann bei konzentrationsabhängig wirkenden Antibiotika bei ausreichend hoher Maximalkonzentration ein Unterschreiten der MHK im Zielgewebe toleriert werden, weil der sogenannte „postantibiotische Effekt“ auftritt (KIETZMANN et al. 2004).

Um anhand des MHK-Wertes eine Aussage über die Resistenz bzw. Sensibilität eines Bakteriums zu treffen, benötigt man einen validen Grenzwert. Grundsätzlich unterscheidet man zwei verschiedene Arten von Grenzwerten, zwischen denen strikt differenziert werden sollte:

erstens den epidemiologischen Cutoff (ECOFF) und zweitens den klinischen Breakpoint (BYWATER et al. 2006; DE JONG et al. 2009).

Epidemiologische Cutoffs teilen die Gesamterregerpopulation eines Erregers in Subpopulationen mit und ohne erworbenen Resistenzmechanismen bezüglich eines bestimmten Wirkstoffes ein. Die Subpopulation ohne Resistenzmechanismen entspricht der „Wildtyp“- Population und die Subpopulation mit erworbenen Resistenzmechanismen der

„Nicht-Wildtyp-Population“. Eine intermediäre Kategorie entfällt. Epidemiologische Cutoffs dienen der optimierten Früherkennung (phänotypische Detektion) von Isolaten mit erworbenen Resistenzen, pharmakologische Aspekte werden bei mikrobiologischen Breakpoints nicht in Erwägung gezogen. Daher können sie einheitlich für Isolate unterschiedlichen Ursprungs (Mensch, Tier, Lebensmittel) angewendet werden. Epidemiologische Cutoffs werden u.a. vom EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing) veröffentlicht, welches die Werte auf Basis einer umfangreichen Datenbank der minimalen Hemmkonzentrationen einer Vielzahl von Isolaten generiert (KAHLMETER et al. 2004).

Klinische Breakpoints haben dagegen therapeutische Relevanz, wobei Resistenz mit Therapieversagen und Empfindlichkeit mit Therapieerfolg assoziiert ist. Im Intermediärbereich kann bei Dosiserhöhung ein Therapieerfolg herbeigeführt werden. Bei Ermittlung der klinischen Breakpoints werden die pharmakologischen und toxikologischen Eigenschaften des Wirkstoffes berücksichtigt, wie beispielsweise die erreichbare Gewebekonzentration (BOTTNER et al. 2000; BYWATER et al. 2006). Die bisher existierenden klinischen Breakpoints stammen meist aus der Humanmedizin (NCCLS 2002). Da zwischen Mensch und Tier erhebliche pharmakologische Differenzen in Metabolismus und Verteilung der Wirkstoffe existieren, sollten in Zukunft für die Veterinärmedizin tierart- und indikationsspezifische klinische Breakpoints etabliert werden (SCHWARZ et al. 2008). Entgegen der weitverbreiteten Vorgehensweise ist eine allgemeingültige Einstufung von Keimen in die Sparte sensibel oder resistent nicht möglich, da valide tierart- sowie indikationsspezifische Breakpoints bisher für die wenigsten Pathogene existieren (KIETZMANN et al. 2004). Am häufigsten werden für Auswertungen mit klinischen Breakpoints die Grenzwerte des amerikanischen CLSI herangezogen, aber auch die europäische EUCAST veröffentlicht klinische Breakpoints (Anonymous 2007a). Die bestehenden Abweichungen zwischen den Breakpoints verschiedener Organisationen sind verwirrend, weshalb grundsätzlich die Harmonisierung anzustreben ist (TURNIDGE et al. 2007). Trotz erheblicher Fortschritte in den vergangenen Jahren bei der Festlegung von Grenzwerten, existieren noch viele ungeklärte Fragen (TURNIDGE et al. 2007).

Die klinischen Breakpoints für Salmonella sind im CLSI Dokument M100 über Enterobacteriaceae zu finden (CLSI 2009b). Speziell für Campylobacter spp. wurden im CLSI Dokument M 45-A bisher nur bezüglich Erythromycin, Ciprofloxacin, Tetrazyklin und Doxycyclin Breakpoints veröffentlicht (CLSI 2006). Übliche Praxis ist es daher, für andere

Antibiotika auf klinische Breakpoints für die Enterobacteriaceae zurückzugreifen, obwohl Campylobacter phylogenetisch nicht dieser Familie zuzuordnen ist. Die Grenzwerte im CLSI-Dokument M45-A für Campylobacter basieren wegen des Fehlens pharmakologischer Daten ebenfalls auf „epidemiologischen Cutoffs“ (FRITSCHE et al. 2007), differieren aber erstaunlicherweise dennoch von den epidemiologischen Cutoffs der EUCAST. Beispielsweise liegt für Erythromycin der CLSI-Grenzwert für Campylobacter spp. bei >16 μg/ml, während EUCAST für C. coli den Cutoff auf >8 μg/ml und für C. jejuni auf >2 μg/ml gesetzt hat.

Bemerkenswert ist die Tatsache, dass offenbar Diskrepanzen zwischen klinischem Erscheinungsbild bei Infektionen mit Salmonella-Isolaten und deren Resistenzeinstufung mittels klinischem Breakpoint auftraten. So erwiesen sich Infektionen mit Salmonella-Isolaten als behandlungsresistent gegenüber Fluorchinolonen, obwohl die MHK-Werte der isolierten Krankheitserreger deutlich unter dem klinischen Breakpoint der CLSI (4 μg/ml) lagen (HELMUTH et al. 2004). Aus diesem Grund forderten AARESTRUP et al. (2003) schon im Jahre 2003 dringend eine Senkung des klinischen Breakpoints von Ciprofloxacin auf 0,125 μg/ml, um eine Verschleierung von Resistenzen zu verhindern.

3 Material und Methoden

3.1 Aufbau und Ziel der Studie

Die Untersuchungen wurden im Rahmen des FBI-Zoo-Projektes (Projektträger: BMBF) und in enger Kooperation mit dem Projekt ZIPP II (Projektträger: BLE) der Klinik für kleine Klauentiere und forensische Medizin und Ambulatorischen Klinik der Tierärztlichen Hochschule Hannover durchgeführt.

In 27 norddeutschen Schweinemastbetrieben wurden Untersuchungen zum Vorkommen von Salmonella spp., Campylobacter spp. und Y. enterocolitica durchgeführt, dazu wurden deren bakteriologischen und serologischen Prävalenzen ermittelt. Um Zusammenhänge zwischen betrieblichen Gegebenheiten (Risikovariablen) und der Ausprägung der serologischen Ergebnisse (Zielvariablen) aufzudecken, wurde eine Risikofaktorenanalyse durchgeführt.

Weiterhin galt es, Beziehungen zwischen den Infektionen der Tiere mit bestimmten Erregerkombinationen darzustellen. Schließlich erfolgte eine Empfindlichkeitsuntersuchung der gewonnenen Salmonella- und Campylobacter-Isolate gegen verschiedene antibakterielle Substanzen. Aufgrund der geringen Anzahl an Y.-enterocolitica-Isolaten (n=2) wurde dort keine Empfindlichkeitstestung durchgeführt.

3.2 Art und Herkunft der untersuchten Proben

An einem Schlachthof in Niedersachsen wurden Hybridmastschweine aus 27 verschiedenen Mitgliedsbetrieben einer Erzeugergemeinschaft auf das Vorliegen von Salmonella spp., Campylobacter spp. und Y. enterocolitica beprobt. Die Probennahme fand im Untersuchungszeitraum Juli 2007 bis Juni 2008 statt. Die regelmäßige Belieferung dieses Schlachthofes durch dieselben Betriebe stellte das entscheidende Kriterium für die Betriebsauswahl dar. Die untersuchten Mastschweine waren im üblichen Schlachtalter von ungefähr 6 Monaten.

Am Schlachthof wurden zunächst die Tiere des zu beprobenden Betriebes im Wartestall mit Sprühfarbe markiert, um eine Identifikation zu gewährleisten. Die farblich markierten Tiere konnten beim Entbluten zwecks Stichblutentnahme gut identifiziert werden. Von jeweils 30 zufällig ausgewählten Tieren pro Testbestand wurde Stichblut zur serologischen Untersuchung in einer 9 ml Monovette^®Z Luer (Fa. Sarstedt) aufgefangen. Dies geschah nach dem Entfernen des Hohlmessers im Rahmen des Entblutungsvorganges.

Die Beprobung der Lnn. ileocaecales fand, vor der amtlichen Untersuchung, am Darmband statt. Der zu beprobende Bestand wurde durch Ablesen des Schlagstempels am Tierkörper identifiziert, welcher parallel zum Darm an einem weiteren Fließband mitlief. Pro Schwein wurde ein Ln. ileocaecalis aus dem jeweiligen Bestand entnommen. Insgesamt wurden pro Bestand Lymphknoten von 20 zufällig ausgewählten Tieren zur kulturellen Untersuchung entnommen.

Die Gesamtprobenmenge betrug 540 Lymphknoten (kulturelle Untersuchung) und 810 Serumproben (serologische Untersuchung).

Die am Schlachthof entnommenen Ileocaecallymphknoten wurden gekühlt aufbewahrt und innerhalb von 24 h im Institut für Mikrobiologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover einer kulturellen Untersuchung unterzogen.

3.3 Kulturelle Untersuchung

Die Lymphknoten wurden zunächst in Ethanol getaucht und abgeflammt, um eine Oberflächenkontamination des Probenmaterials zu vermeiden. 100-300 mg des Lymphknotens wurden per Skalpell in kleine Teile geschnitten und gemeinsam mit 1 ml einer 0,9 %igen NaCl-Lösung in ein Fastprep®-Röhrchen mit sterilen Glaskugeln gegeben, um im Bead-Beater^® für 40 s bei Stufe 3 zerkleinert zu werden. Diese Lymphknotensuspension wurde, wie in den folgenden Abschnitten beschrieben, für die bakteriologische Untersuchung auf Salmonella spp., Campylobacter spp. und Y. enterocolitica eingesetzt. Die gewonnenen Isolate wurden kryokonserviert und zur Serotypisierung und Resistenztestung weitergeleitet.

3.3.1 Salmonella spp.

500 μl der Lymphknotensuspension wurden in 450 μl Buffered-Pepton-Water (BPW) (Oxoid) überführt und für 24 h bei 37 °C inkubiert. 100 μl dieser Vorkultur wurden in Rappaport-Vassiliadis (RVS)-Medium (Fa. Oxoid) gegeben und für 24 h bei 42 °C inkubiert. Ein weiteres Aliquot von 1000 μl der Voranreicherungskultur wurden in Müller-Kaufmann-Tetrathionat-Novobiocin (MKTTn)- Medium (Fa. VWR/Merck) überführt und für 24 h bei 37 °C inkubiert.

Von den RVS- und MKTTn-Medien erfolgten so mittels ausgeglühter Öse Ausstriche sowohl auf Xylose-Lysin-Desoxycholat (XLD)- als auch auf Brillantgrün-Phenolrot-Lactose-Saccharose (BPLS)-Agarplatten (Fa. Oxoid), welche bei 37 °C für 24 h bebrütet wurden. Von verdächtigen Kolonien wurden Subkulturen angelegt, indem Koloniematerial mittels Öse entnommen wurde und auf einem Blut- und einem Gassner-Agar ausgestrichen wurde.

Nach weiteren 24 h Wachstum auf den Agarplatten wurden die Salmonella-verdächtigen Kolonien anhand biochemischer Reaktionen wie Urease-, Indol- und Citratreaktion überprüft und mittels Agglutinationsreaktion und ApiE-System bestätigt. Die Differenzierung erfolgte jeweils für ein Salmonella-Isolat pro Lymphknoten.

Die Phagentypisierung der S.-Isolate nach ANDERSON wurde am BfR Berlin durchgeführt (ANDERSON et al. 1977).

3.3.2 Campylobacter spp.

Aliquots von jeweils 25 μl Lymphknotensuspension wurden direkt auf einem Selektivagar nach Skirrow (Fa. Oxoid) sowie einem Thioglyklolat-Agar (Fa. Oxoid) ausgestrichen und bei 42 °C für 48 h in einem CO2-Inkubator bebrütet. Dem Thioglykolatagar wurde vor der Bebrütung direkt nach dem Autoklavieren Rinderblut hinzugefügt. Am dritten Tag erfolgte die Subkultivierung von bis zu 20 verdächtigen Einzelkolonien pro Platte unter den gleichen Kulturbedingungen wie oben. Anhand der Kulturmorphologie und mittels Phasenkontrastmikroskopie wurde kontrolliert, ob die Subkulturen tatsächlich Campylobacter spp. waren.

Die so erhaltenen Reinkulturen wurden mithilfe einer Campylobacter-spp.-spezifischen PCR identifiziert, deren Zielgen die GTPase war (VAN DOORN et al. 1998). Da Schweine meist C. coli beherbergen, wurde anschließend eine für die Spezies C. coli spezifische PCR angewandt. Die Primer zielen auf einen C.-coli-spezifischen Teil des ceuE-Gens (enterocholin uptake periplasmic binding protein-Gen) ab (GONZALEZ et al. 1997). Dieses kodiert für ein Protein, das in den Siderophorentransport involviert ist. Im negativen Fall wurde eine C.-jejuni-spezifische PCR mit Primern durchgeführt, welche das C.-jejuni-C.-jejuni-spezifische Hip-O-Gen (Hippurikase-Gen) detektiert (HANI et al. 1995; MARSHALL et al. 1999). Die Differenzierung erfolgte jeweils für ein Campylobacter-Isolat pro Lymphknoten.

3.3.3 Y. enterocolitica

10 µl der Lymphknotensuspension wurden in 10 ml einer ITC (Irgasan-Ticarcilin-Kaliumchlorat)-Bouillon (Fa. Merck) gegeben und bei 25 °C 72 h lang inkubiert.

Nach der Anreicherung der Yersinien in der Bouillon erfolgte das Ausplattieren auf CIN (Cefsulidin-Irgascin-Novobiocin)-Platten (Fa. Oxoid) und die Inkubation für 24-48 h bei 30 °C.

Weitere 10 µl der ursprünglichen Lymphknotensuspension wurden an Tag 1 in 10 ml PBS (Phosphate buffered Saline)-Medium bei 4 °C inkubiert („Kälteanreicherung“). Das Ausplattieren des PBS erfolgte nach 7, 14 und 21 Tagen Inkubationsdauer ebenfalls auf CIN-Platten. Nach 24 bis 48 Stunden Kultivierung bei 28 °C in aerober Atmosphäre wachsen Yersinien auf CIN-Agar als ca. 1 mm große glatte Kolonien mit rosa Kranz mit dunkelrotem Zentrum, also in typischer „Kuhaugenform“.

Von jeder CIN-Agarplatte wurden bis zu 20 Subkulturen auf eine frische Platte angelegt. Die Differenzierung und Bestätigung präsumptiver Y. enterocolitica erfolgte mittels Testsystem für Enterobacteriacea API ^®20E (Fa. BioMerieux).

Eine Serotypbestimmung durch Objektträgerschnellagglutination der präsumptiven Yersinia-Isolate wurde mit spezifischen Antiseren gegen die Y.-enterocolitica-Serotypen O:3, O:4, O:5, O:6, O:8 und O:9 durchgeführt. Die spezifischen Antiseren wurden im Kaninchen mittels Yersinia-Referenzstämmen produziert (ALEKSIC et al. 1984) und auf ihre Spezifität überprüft.

Die Differenzierung erfolgte jeweils für ein Yersinia-Isolat pro Lymphknoten.

3.4 Serologische Untersuchung

Die Blutproben wurden über Nacht in 9 ml Monovetten^®Z Luer (Fa. Sarstedt) bei Raumtemperatur gelagert. Zur Serumgewinnung wurden die Monovetten^® zentrifugiert, der Überstand nachfolgend in 1 ml Plastikgefäße (Fa. Eppendorf) dekantiert und bis zum Untersuchungszeitpunkt bei -20°C tiefgefroren und an das Untersuchungslabor versendet. Die serologische Diagnostik fand im Institut für Tierhygiene und Öffentliches Veterinärwesen der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig statt.

3.4.1 Salmonella spp.

Das Serum wurde mittels des komerziellen SALMOTYPE^® Pig Screen ELISA Tests gemäß den Herstellerangaben untersucht. Dieser Test verwendet die O-Antigene 1, 4, 5, 6, 7 und 12 als Testantigene, welche an eine Mikrotiterplatte gebunden sind. Spezifische anti-Salmonella-Antikörper bilden während der Inkubation der Probe in der beschichteten Vertiefung einen immobilisierten, haftenden Komplex mit den Antigenen der Mikrotiterplatte. Anti-Schwein-IgG-Peroxidase-Konjugat diente der Markierung der per Antigen an die Festphase gebundenen anti-Salmonella-Antikörper. Nichtgebundenes überflüssiges Material wird nun durch Waschen entfernt. Die abschließende qualitative Detektion des OD%-Wertes erfolgte unter Verwendung des löslichen Chromogens Tetramethylbenzidin (TMB) mittels Photometers. Die Farbreaktion korreliert mit der Konzentration der anti-Salmonella-Antikörper in der Probe (siehe Anleitung des SALMOTYPE^® Pig Screen ELISA, LDL).

Serumproben mit einer Antikörperkonzentration von >20 OD% (Cutoff-Wert) wurden entsprechend der Herstellerangabe als positiv bewertet.

3.4.2 Campylobacter spp.

Der serologische Nachweis der Campylobacter-Infektion erfolgte durch einen in-house-ELISA des Instituts für Tierhygiene und Öffentliches Veterinärwesen der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig. Die Untersuchung erfolgte im Rahmen des ZIPP-II-Projektes.

Antikörperkonzentrationen über 35 OD% führten zu einer Bewertung der Serumprobe als positiv.

3.4.3 Y. enterocolitica

Wie auch bei Campylobacter spp. wurden die serologischen Ergebnisse bezüglich Y. enterocolitica durch das Projekt ZIPP II zur Verfügung gestellt: Die Proben wurden im Institut für Lebensmittelhygiene der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig untersucht. Als Cutoff wurden die vom Hersteller des YOP-Screen ELISA (Fa.

Labordiagnostik, Leipzig) empfohlenen 20 OD% verwendet.

3.5 Antimikrobielle Empfindlichkeitsprüfung

Die Salmonella-Isolate wurden gegenüber 14 und die Campylobacter-Isolate gegenüber acht antibiotischen Wirkstoffen auf ihre Empfindlichkeit getestet. Fünf der Antibiotika wurden an beiden Erregerarten zugleich überprüft, dies waren Ampicillin, Ciprofloxacin, Gentamicin, Nalidixinsäure und Tetrazyklin. Die Empfindlichkeitstestung wurde als Auftragsarbeit vom BfR in Berlin bzw. dem Institut für Lebensmittelhygiene der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig durchgeführt.

3.5.1 Empfindlichkeitstestung der Salmonella spp.-Isolate

Die Resistenzbestimmung der Salmonella-Isolate erfolgte im Nationalen Referenzlabor für Salmonellen am BfR in Berlin, wobei die Mikrobouillonverdünnungsmethode (“broth microdilution method“) nach CLSI-Dokument M07-A8 (CLSI 2009a) Anwendung fand.

Physiologische Kochsalzlösung wurde mit einem über Nacht auf Müller/Hinton-Agar gewachsenem Salmonella-Isolat so beimpft, dass sie dem Standard 0,5 McFarland (1-2 x 10⁸ KBE/ml) entsprach. Damit wurden 11 ml Müller/Hinton-Bouillon (Fa. Becton Dickinson) beimpft, so dass ein Titer von 1-2 x 10⁵ KBE/ml erhalten wurde. Mittels Inokulator wurden dann 50 µl dieser Suspension automatisch je Well der Mikrotiterplatte (Fa. EUMVS) dosiert. In den fertig konfektionierten Mikrotiterplatten lagen die Konzentrationen der 14 verwendeten antimikrobiellen Wirkstoffe (Tab.3) in lyophilisierter Form vor und wurden durch die Zugabe der Bouillon gelöst. Die abgefüllten Mikrotiterplatten wurden mit einer Folie verschlossen und über Nacht 18-24 Stunden bei 37 °C bebrütet. Mittels Sensititre-Sensitouch-System wurden die MHK-Werte ermittelt.

Für die Bewertung wurden in erster Linie die epidemiologischen Cutoffs herangezogen (www.eucast.org) (EUCAST). In den Fällen Kanamycin sowie Sulfamethoxazol wurden die klinischen Breakpoints des CLSI und im Fall von Colistin sowie Streptomycin wurden die DANMAP-Grenzwerte verwendet, da es noch keine epidemiologischen Cuttoffs gab.

Tabelle 3 MHK-Grenzwerte für Salmonella spp.

Wirkstoff Wirkstoffgruppe Abk. Grenzwert Testbereich

[μg/ml] [μg/ml]

Ampicillin Penicillin AMP >4 ¹ 0,5 - 32 Chloramphenicol Fenicol CHL >16 ¹ 2 - 64 Ciprofloxacin Fluorchinolon CIP >0,064 ¹ 0,0678125 - 8 Colistin Polypeptid COL >2 ² 8 - 16 Florfenicol Fenicol FFN >16 ¹ 2 - 64 Cefotaxim Cephalosporin FOT >0.5 ¹ 0,0625 - 4 Gentamicin Aminoglykosid GEN >2 ¹ 0,25 - 32 Kanamycin Aminoglykosid KAN >32 ³ 4 - 128 Nalidixinsäure Chinolon NAL >16 ¹ 4 - 64 Sulfamethoxazol Sulfonamid SMX >256 ³ 8 - 1024 Streptomycin Aminoglykosid STR >32 ² 2 - 128 Ceftazidim Cephalosporin TAZ >2 ¹ 0,25 - 16 Tetrazyklin Tetrazyklin TET >8 ¹ 1 - 64 Trimethoprim Diaminopyrimidin TMP >2 ¹ 0,5 - 32

Grenzwerte für Salmonella spp. nach ¹EUCAST, ² DANMAP, ³CLSI

3.5.2 Empfindlichkeitstestung der Campylobacter spp.-Isolate

Im Institut für Lebensmittelhygiene der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig erfolgte im Rahmen des Projektes ZIPP II die Empfindlichkeitstestung der isolierten Campylobacter spp.. Getestet wurde gegenüber acht verschiedenen Antibiotika mittels Mikrodilutionstest laut CLSI-Richtlinie (NCCLS 2001). Der erste Schritt beinhaltete die Rekultivierung der Campylobacter-Stämme auf Müller-Hinton-Blutagar bei 42 °C für 48 h in mikroaerober Atmosphäre. Zur Herstellung einer Vorkultur mit ca. 10⁸ KbE/ml wurde eine halbe Öse des Koloniematerials in 5 ml Müller-Hinton-Boullion (MHB) gegeben und für 24 h bei 37 °C mikroaerob bebrütet. Nun folgte das Überimpfen von 150 μl dieser Vorkultur in ein Glasröhrchen mit 10 ml MHB, die Keimdichte sollte ca. 10⁶-10⁷ KbE/ml betragen. Von diesem Inokulum wurden per 12 Kanal-Transferpipette je 100 μl in je eine Kavität der Sensititre^® Mikrotiterplatte (Plattenlayout siehe Tab.3) gefüllt. Die Platte wurde mit perforierter Folie beklebt und bei hoher Luftfeuchte 24 h bei 37 °C mikroaerob bebrütet. Zur allgemeinen Wachstumskontrolle dienten 2 Kavitäten ohne Antibiotika. Die Qualitätsprüfung der

Mikrotiterplatten erfolgte anhand von je einem C.- jejuni- und einem C.- coli-DSM-Kontrollstamm, deren MHK-Werte im Referenzbereich liegen mussten. Die Qualitätskontrolle jeder neuen MHB-Charge erfolgte mittels der ATCC-Stämme E. coli und Staph. aureus. Der MHK-Wert entsprach der geringsten Konzentration, bei der mittels Ablesespiegel kein Wachstum mehr sichtbar war. Bei bakteriostatischen Antibiotika, wie Erythromycin, Tetrazyklin und Sulfmethoxazol/Trimethoprim, erfolgte das Ablesen des MHK-Wertes bei 80 % Wachstumshemmung. Als Grenzwerte wurden größtenteils die ECOFFs verwendet, außer für Sulfamethoxazol/Trimethoprim, Ampicillin und Ampicillin/Sulbactam. Hier wurde auf die klinischen Breakpoints des CLSI zurückgegriffen, weil zum Zeitpunkt der Auswertung keine ECOFFS für Campylobacter spp. vorlagen.

Tabelle 4 MHK-Grenzwerte für C. coli und C. jejuni

Wirkstoff Spezies Grenzwert

[μg/ml]

Testbereich [μg/ml]

jejuni >2 ¹

Erythromycin

coli >8 ¹ 0,0078125 -16

jejuni >0,5 ¹

Gentamicin

coli >1 ¹ 0,015625 - 32

Nalidixinsäure >16 ¹ 0,015625 - 32

Ciprofloxacin >0,5 ¹ 0,0078125 - 16

Tetrazyklin >1 ¹ 0,0078125 - 16

Sulfamethoxazol /

Trimethoprim (1:19) >2/38 ² 0,0078125 / 0,1484375 - 16 / 304

Ampicillin >16 ² 0,015625 - 32

Ampicillin / Sulbactam (2:1)

beide Spezies

>16 ² 0,015625 / 0,0078125 - 32 / 16

3.6 Fragebogen

Die Daten zu den Beständen wurden einer Datenbank von ZIPP II entnommen, welche auf einer Erhebung mittels Fragebogen beruhte.

Grundsätzlich wurden nur solche Fragen in die Auswertung miteinbezogen, die pro Antwortkategorie von mindestens drei Betrieben ausgefüllt wurden. In den Tabellen 16 und 18 befindet sich eine Aufstellung der überprüften potentiellen Risikofaktoren.

3.7 Statistische Auswertung

Die statistische Auswertung gliedert sich in

1. die Darstellung der serologischen und bakteriologischen Befunde auf Einzeltier- und Betriebsebene,

2. die Verknüpfung der Fragebogendaten über Betriebsmerkmale mit den Betriebsprävalenzen, um deren Eigenschaft als Risikofaktoren zu überprüfen,

3. die Darstellung der Resistenzdaten und

4. deren Verknüpfung mit den per Fragebogen erhobenen Betriebsdaten.

Datenmaterial

Insgesamt standen hierfür folgende Daten zur Verfügung:

• Angaben aus dem Fragebogen über betriebliche Faktoren in 27 Schweinemastanlagen

• Bakteriologische Ergebnisse von 540 Tieren bezüglich des kulturellen Salmonella-spp.-, Campylobacter-spp.- und Y.-enterocolitica-(Serovar O:3)-Status (Positiv/Negativ).

Zusätzlich die Angabe über Salmonellenserovar und Phagentyp sowie über die Spezieszugehörigkeit zu C. coli bzw. C. jejuni.

• Serologische Ergebnisse von 810 Tieren über den serologischen Salmonella-spp.-, Campylobacter-spp.- und Y.- enterocolitica-Status, angegeben in OD%.

• MHK-Werte antibakterieller Wirkstoffe bzw. Wirkstoffkombinationen für Salmonella spp. und Campylobacter spp. in μg/ml, im Falle von Y. enterocolitica wurde aufgrund der wenigen Isolate auf die Empfindlichkeitstestung verzichtet.

Beschreibung der serologischen und kulturellen Befunde

Überblick der serologischen und kulturellen Untersuchungsergebnisse

Serologische und bakteriologische Untersuchungsergebnisse für Salmonella spp., Campylobacter spp. und Y. enterocolitica wurden auf Tierebene (statistische Einheit ist das Tier) und auf Betriebsebene (statistische Einheit ist der Betrieb) ausgewertet.

Der Betriebsstatus wurde bakteriologisch als positiv definiert, wenn mindestens ein Tier einen positiven bakteriologischen Befund zeigte und serologisch als positiv definiert, wenn mindestens ein Tier des Betriebs einen Messwert >20 OD% (Salmonella spp. und Y.

enterocolitica) bzw >35 OD% (Campylobacter spp.) aufwies.

Auf Basis der bakteriologischen Ergebnisse wurde das Erregerspektrum der einzelnen Betriebe untersucht.

Die serologischen Ergebnisse wurden hinsichtlich ihrer Verteilung ausgewertet, hierzu wurden mit der Prozedur Gchart Box-Plots gezeichnet. Der Box-Plot stellt einige charakteristische Lage- und Streuungsmaße zusammen (s. Abb. 1): Die Box umfasst typischerweise den Median als Zentrum der Daten und das untere und obere Quartil der Daten. Somit beinhaltet die Box die mittleren 50 % der Daten. Minimum und Maximum der Daten werden von der Box ausgehend als sogenannte Wiskers dargestellt (KREIENBROCK et al. 2005).

Abbildung 1 Schematische Darstellung eines Boxplots

Vergleich der serologischen und kulturellen Untersuchung

Die Kombinationen von serologischem und bakteriologischem Betriebsstatus wurden für die einzelnen Erreger getrennt aufgeführt. Auf Einzeltierebene war die Erfassung der serologischen

und bakteriologischen Befundkombination nicht möglich, bedingt durch den technischen Ablauf bei der Probenentnahme auf dem Schlachthof. Mittels McNemar-Test wurde die Kongruenz von serologischer und bakteriologischer Untersuchung auf Betriebsebene statistisch überprüft.

Der McNemar-Test diente zum Vergleich der Häufigkeitsverteilungen der diagnostischen Tests.

Ein p-Wert zum McNemar-Test von ≤ 0,05 beschreibt, dass die diagnostischen Tests im Sinne der festgestellten positiven Ergebnisse signifikant verschieden reagieren. Der McNemar-Test kann nur zweiseitig durchgeführt werden. Dass heißt, er trifft eine Aussage über eine signifikante Differenz, nicht aber über die Richtung (Erhöhung oder Erniedrigung).

Erregerkombinationen

Die Erregerkombinationen wurden, getrennt nach bakteriologischen und serologischen Testergebnissen, auf Tier- und auf Betriebsebene in einer Tabelle dargestellt (Tab. 13 und Tab.

14). Die Übereinstimmung des Nachweises von zwei der drei Erreger wurde – getrennt nach serologischen und kulturellen Ergebnissen – auf Ebene des Einzeltiers, aber auch auf Betriebsebene, mit Hilfe des Homogenitätstests nach Fisher überprüft. Liegt der ermittelte

14). Die Übereinstimmung des Nachweises von zwei der drei Erreger wurde – getrennt nach serologischen und kulturellen Ergebnissen – auf Ebene des Einzeltiers, aber auch auf Betriebsebene, mit Hilfe des Homogenitätstests nach Fisher überprüft. Liegt der ermittelte

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