2 Zielsetzung dieser Arbeit
6.1 Diskussion der einzelnen Mutationen / Patienten
6.1.13 Mutation Arg 2187His (Patient 16)
Bei dieser Patientin fand sich die neue Mutation Arg2186His. Zusätzliche Mutationen oder Polymorphismen lagen nicht vor. Die heterozygote FV-Leiden-Trägerin wies mit 1,3 jedoch eine auffällige APCR auf, welche im Bereich einer FV-Leiden-Homozygotie lag. Gleichzeitig war die FV-Aktivität auf 47% reduziert. Die Mutation Arg2186His scheint zum vollständigen Funktionsverlust des non-Leiden-Allels zu führen. Im peripheren Blut ist dadurch nur der mutierte FV-Leiden aktiv. Arg2186His grenzt unmittelbar an die ß-Faltblattregion 2188 bis 2209. Diese koordiniert Cys2193, das zusammen mit Cys2038 eine Disulfidbrücke formt. Diese Disulfidbrücke umspannt nahezu die ganze C2-Domäne und ist essentiell für die Interaktion des FV mit der Phospholipidmembran (Orban et al., 2004). Vermutlich kommt es durch die Mutation nicht zur Ausbildung der Disulfidbrücke und damit zu einer eingeschränkten Membranbindung mit Aktivitätsverlust des FV, was zur FV-Leiden-Pseudohomozygotie führt.
6 Diskussion
6.2 Schlussfolgerung
Die klinische Relevanz der APCR und des FV-Mangels wurde in den letzten Jahren verstärkt diskutiert und ist immer mehr von klinischem Interesse. Die FV-Leiden-Mutation ist schon seit längerem als Hauptursache der APCR bekannt (Hoffman et
Dies steht ganz im Gegensatz zu den Ursachen einer verminderten FV-Aktivität. Hier konnte bei fast jedem Patienten eine andere Mutation gefunden werden. Dies wird dadurch verdeutlicht, dass sich bei 11 von 17 Familien mindestens eine neue Mutation finden ließ, die eine verminderte FV-Aktivität verursachte. Lediglich zweimal konnte eine bekannte Mutation (Val1813Met) identifiziert werden. Es fanden sich keine Hotspots, die Mutationen waren über sämtliche Domänen und die Promotorregion verteilt. Um die hämostyptische Funktionsfähigkeit des FV zu gewährleisten, ist eine Restaktivität von 5% ausreichend. Dies führte im Laufe der Zeit zur Prävalenz vieler Mutationen, die die Funktion des FV störten, jedoch keine klinische Relevanz haben.
Lediglich bei vier Patienten konnte keine neue Mutation gefunden werden. Bei zwei dieser Patienten konnte die reduzierte FV-Aktivität durch bekannte Polymorphismen erklärt werden. Bei den beiden anderen Patienten (1b und 5) müssen andere Ursachen diskutiert werden: Hierfür kommen nicht im FV-liegende Mutationen infrage, welche die Synthese oder Sekretion des FV beeinflussen könnten. Auch die Bedeutung von FV-Antikörpern ist zu diskutieren. Zukünftig wäre hier neben einer Antikörperbestimmung die Bestimmung des FV-Antigens wichtig, um eine verminderte Sekretion (Typ-1-Defekt=quantitativ) von einer verminderten Funktionsfähigkeit (Typ-2-Defekt=qualitativ) unterscheiden zu können.
6 Diskussion
Die Mutation -428C>C/T weist auf ein mögliches Promotorelement in diesem Bereich hin. Um die Existenz bzw. die Funktion als Enhancer/Silencer zu überprüfen, bleiben weitere Untersuchungen abzuwarten.
Neue funktionelle Domänen mit antikoagulatorischer Wirkung im FV konnten nicht sicher entdeckt werden. Die Patienten 9, 10 und 11 fielen zwar durch Thrombosen bei FV-Mangel und gleichzeitiger normaler APCR-Ratio auf, zudem fand sich bei den Patienten 9 und 10 der gleiche Polymorphismus Met2120Thr. Ob eine Kausalität besteht, bleibt jedoch fraglich, da bei allen Patienten zusätzliche Thrombose-Risikofaktoren vorhanden waren und für den gut untersuchten Polymorphismus Met2120Thr bisher keine Assoziation zu Thrombosen beschrieben wurde.
Häufig unterschätzt wurde bisher der Einfluss der Polymorphismen (s. Tab. 5.2), welche in einem Fall durch eine Kombination des Haplotyps R2 mit Met1736Val und Asp2194Gly eine Reduktion der FV-Aktivität auf 20% auslösten (Patient 17).
Ebenfalls von Bedeutung ist der Polymorphismus Met2120Thr, der bereits allein eine Reduktion der FV-Sekretion um 25% verursachte. Die genannten Polymorphismen haben alle eine Häufigkeit von etwa 20%, daher treten auch Kombinationen mit gegenseitiger Wirkungsverstärkung häufig auf (Scanavini et al., 2004).
Für sich allein betrachtet sind die Mutationen und Polymorphismen meist von geringer Bedeutung, da sie nur selten zu einem klinisch relevanten FV-Aktivitätsverlust auf unter 5% führen. In Kombination mit einer zum Beispiel durch die FV-Leiden-Mutation hervorgerufenen APCR kann sich die Wirkung der Mutation umkehren. Durch die Synthesehemmung des non-Leiden-Allels tritt die FV-Leiden-Mutation dominant hervor. Diese Pseudohomozygotie (Patient 1a, 6b, 7b, 16) hat ein stark erhöhtes Thromboserisiko zur Folge, welches weniger von der Plasmakonzentration des veränderten FV-Leiden-Proteins als von der Konzentration des FV-Wildtyp im Serum abhängt (Brugge et al., 2005).
7 Zusammenfassung
7 Zusammenfassung
FV spielt sowohl im koagulatorischen als auch im antikoagulatorischen System eine wichtige Rolle. In den letzten Jahren konnten durch intensive Forschungen viele funktionell wichtigen Bereiche im Gen bzw. im Protein identifiziert werden.
Mittlerweile besteht weitgehende Klarheit über die Auswirkungen der wichtigsten Polymorphismen sowie über die häufigeren Auslöser der APCR. Die FV-Leiden-Mutation ist mit 95% die Hauptursache für die APCR. Das FV-Gen weist jedoch eine hohe Variabilität in seiner Sequenz auf, woraus oft eine verminderte FV-Synthese oder -Funktion resultiert. Größtenteils sind die klinischen Auswirkungen eines FV-Mangels gering, da eine minimale Restfunktion für eine suffiziente Hämostase auszureichen scheint. Heikel ist die Kombination eines FV-Mangels mit einer APCR.
Hier kann es durch einen Verlust eines Allels zu einer funktionellen Hemizygotie bzw.
Pseudohomozygotie des FV kommen. Dies äußert sich durch eine verstärkte APCR mit erhöhter Thrombosegefahr. Der genaue Pathomechanismus konnte jedoch noch nicht vollständig geklärt werden.
Ziel dieser Arbeit war die Identifikation zugrunde liegender Gendefekte sowie die Analyse der Auswirkung einer Koseggregation von Mutationen, die einen FV-Mangel bzw. eine APCR verursachen. Auf längere Sicht soll dies dem Aufbau einer Datenbank dienen, die einen Überblick über die komplette genetische Vielfalt des FV bietet.
Dafür musste eine Screeningmethode etabliert werden, mit der Patienten mit FV-Mangel oder APCR auf Mutationen untersucht werden konnten.
Im Rahmen dieser Dissertation wurde das bis dahin weltweit größte zusammenhängende Patientenkollektiv (20) untersucht, wobei 15 neue Mutationen entdeckt wurden. Dies entspricht 6% aller bis dato bekannten Mutationen (ca. 250).
Es zeigte sich, dass die Auslöser für eine APCR verhältnismäßig konstant sind, was im Gegensatz zu den Ursachen einer verminderten FV-Aktivität steht. Diesbezüglich wurde bei fast jedem Patienten (15/20) eine andere Mutation gefunden. Um eine hämostyptisch ausreichende Funktionsfähigkeit des FV zu gewährleisten, ist eine
7 Zusammenfassung
Restaktivität von ca. 5% ausreichend. Dies führte im Laufe der Zeit zu zahlreichen Polymorphismen und Mutationen, die im Normalfall jedoch keine klinische Relevanz haben.
Eine einen FV-Mangel oder APCR auslösende Mutation ist für sich allein betrachtet zwar von klinischer Relevanz (z.B. führt eine heterozygote FV-Leiden-Mutation zu einem 5- bis 10-fach erhöhtem Thromboserisiko), da meist jedoch ein zweites nicht verändertes Allel vorhanden ist, können die klinischen Auswirkungen zum Teil kompensiert werden. Wie bereits durch Castaman et al. (1997) gezeigt, kann es im Falle einer Kombination der Mutationen durch Funktionsverlust des non-Leiden-Allels zur Leiden-Pseudohomozgotie kommen. Bei diesen Patienten ist der FV-Plasmaspiegel auf ca. 50% oder weniger reduziert und die APCR-Ratio ist vergleichbar mit der eines homozygoten FV-Leiden-Trägers. Diese Pseudohomozygotie hat ein stark erhöhtes Thromboserisiko (50- bis 100-fach) zur Folge, welches weniger von der Plasmakonzentration des veränderten FV-Leiden-Proteins als von der Konzentration des FV-Wildtyp im Plasma abhängt (Brugge et al., 2005). Diese Ergebnisse spiegelten sich auch in dieser Arbeit wider. Von neun Patienten mit Thromboseneigung hatten fünf Patienten eine heterozygote FV-Leiden-Mutation, die sich 4-mal als pseudohomozygot bestätigte. Mögliche Ursachen eines FV-Mangels und damit einer FV-Leiden-Pseudohomozygotie bei unseren Patienten sind:
1) mögliche FV-Instabilität (Pat. 1a).
2) verminderte Synthese / FV-Null-Allel (Pat. 6b).
3) verminderte Membran- / Cofaktor- / Substratbindung (Pat. 7b, 16).
Neue funktionelle Domänen mit antikoagulatorischer Wirkung im FV konnten nicht sicher entdeckt werden. Es kann aber um Position -428 (cDNA) ein neues mögliches Promotorelement vermutet werden.
Häufig unterschätzt wurde bisher der Einfluss der Polymorphismen. In einem Fall verursachte die Kombination des Haplotyps R2 mit Met1736Val und Asp2194Gly eine Reduktion der FV-Aktivität auf 20%. Erwähnenswert ist zudem der Polymorphismus Met2120Thr, welcher eine Reduktion der FV-Sekretion um 25%
7 Zusammenfassung
bewirkt. Die oben genannten Polymorphismen haben Häufigkeiten von etwa 20%, daher sind auch Kombinationen mit gegenseitiger Wirkungsverstärkung sehr häufig (Asselta et al., 2006; Castoldi et al., 2004; van der Neut Kolfschoten et al., 2003;
Yamazaki et al., 2002).
Aufgrund der großen Komplexität und der multiplen meist nur „privaten“-Mutationen (innerhalb einer Familie) im FV konnten wir dem Ziel des Aufbaus einer Datenbank, die einen Überblick über die komplette genetische Vielfalt des FV bietet, zwar etwas näher kommen, aber auch in Zukunft sind hier weitere Untersuchungen nötig, insbesondere auch um weitere funktionelle Domänen zu entdecken.
8 Referenzen
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