B.2 Methoden
B.2.2 Molekularbiologische Methoden
Zur Präparation von Plasmid-DNA aus Bakterienkulturen wurde das QIAprep Spin Miniprep Kit und das QIAprep Spin Midiprep Kit (Qiagen) verwendet. Jeweils 2 ml (Miniprep) bzw.
50 ml (Midiprep) Bakterienkultur, die über Nacht bei 37°C und 150 rpm angezogen wurde, wurden 15 min bei 4°C und 5000 rpm zentrifugiert. Die DNA-Präparation aus dem Bakterienpellet wurde anschließend nach Herstellerangaben durchgeführt.
B.2.2.2 Isolierung von Gesamt-RNA aus Pflanzenmaterial
Zur Isolierung von Gesamt-RNA kamen nur RNase freie Materialien zum Einsatz. Alle Geräte wurden sterilisiert und wässrigen Pufferlösungen wurde 0,1% (v/v) DEPC (Diethylpyrocarbonat) zugesetzt.
B.2.2.2.1 Isolierung mit TRIzol®-Reagenz
Diese Methode wurde zur Isolation von Gesamt-RNA aus Kartoffelschalen (Lagerungsexperiment) angewendet. Für diese Methode waren 200 mg des in flüssigem Stickstoff gemörserten Gewebes ausreichend. Die Isolation der RNA erfolgte mit TRIzol® -Reagenz (GibcoBRL und Invitrogen) nach Herstellerangaben. Zur besseren Abtrennung der Proteine wurde die Chloroformfällung wiederholt.
B.2.2.2.2 Isolierung mit NTES-Puffer und Phenol/Chloroform (Reinbothe et al., 1992)
Diese Methode diente zur Isolation von Gesamt-RNA aus Pflanzen- und Knollengeweben.
Je nach Gewebeart wurden 0,1 - 3,0 g Pflanzenmaterial mit flüssigem Stickstoff gemörsert. Dem Pflanzenpulver wurden 6 ml NTES-Puffer und 6 ml Phenol/Chloroform (1:1) zugesetzt.
NTES-Puffer: 10 mM Tris-HCl pH 7,5 100 mM NaCl
1 mM EDTA 1% (w/v) SDS
Der Mörser wurde anschließend mit 4 ml NTES-Puffer und 4 ml Phenol/Chloroform (1:1) gespült.
Danach wurde 5 min kräftig geschüttelt und 10 min bei 4°C und 5000 rpm zentrifugiert. Zur Abtrennung der Proteine wurde die obere polare Phase mit 1 Volumenteil Phenol/Chloroform (1:1) versetzt, 1 min kräftig geschüttelt und 10 min bei 4°C und 5000 rpm zentrifugiert. Dieser Vorgang wurde solange wiederholt bis die Interphase proteinfrei war. Die Fällung der Nukleinsäuren aus der polaren Phase erfolgte über Nacht mit 0,1 Volumenteil 3 M Natriumacetat pH 5,2 und 2,5 Volumenteilen 96%igem Ethanol. Die Nukleinsäuren wurden 10 min bei 4°C und 5000 rpm abzentrifugiert, mit 70%igem Ethanol gewaschen und in 5 ml DEPC-Wasser gelöst. Die Gesamt-RNA wurde über Nacht mit 5 ml Lithiumchlorid (4 M LiCl; 20 mM Natriumacetat pH 5,2) gefällt. Nach Zentrifugation und Waschen mit 70%igem Ethanol wurde die RNA je nach Pelletgröße in 20 – 1000 µl DEPC-Wasser gelöst.
B.2.2.3 Quantifizierung von Nukleinsäuren
Die Bestimmung der DNA- bzw. RNA-Konzentration erfolgte photometrisch bei 260 nm.
Hierzu wurde der RNA/DNA Calculator Gene Quant II verwendet. Die Verunreinigung mit Proteinen wurde aus dem Verhältnis der optischen Dichten bei 260 und 280 nm ermittelt. Werte zwischen 1,8 – 2,0 stehen für eine hohe Reinheit (Mülhardt 2000).
B.2.2.4 cDNA-Synthese
Die cDNA-Synthese wurde mit der SUPERSCRIPT™ II RNase H- Reverse Transkriptase (GibcoBRL und Invitrogen) durchgeführt. Dazu wurden 5 µg Gesamt-RNA verwendet. Alle Schritte erfolgten nach Herstellerangaben.
B.2.2.5 Polymerasekettenreaktion (PCR)
Die Polymerasekettenreaktion (PCR) diente zur Vervielfältigung von DNA-Fragmenten.
Hierbei kam die Standard-PCR und die Kolonie-PCR zum Einsatz.
B.2.2.5.1 Standard-PCR
Die Standard-PCR wurde zur Amplifikation der cDNA der UDPGlucose-Pyrophosphorylase genutzt. Weiterhin wurden die Sonden der Tropinonreduktasen I und II für den Northern Blot durch Standard-PCR hergestellt. Als DNA-Template wurde cDNA oder Plasmid-DNA verwendet. Die benutzten Oligonukleotide sind in Kapitel B.1.4 aufgeführt. Ein PCR-Ansatz setzte sich aus folgenden Bestandteilen zusammen:
PCR-Ansatz: 10 x PCR-Puffer 5 µl 2,5 mM dNTP`s 4 µl direkter Primer 50 pmol/µl 1 µl reverser Primer 50 pmol/µl 1 µl DNA-Template 1 µl Taq-/Pfu-DNA-Polymerase 1 U Aqua bidest. ad 50 µl
Für die PCR kamen zwei verschiedene DNA-Polymerasen zum Einsatz. Die Taq-DNA-Polymerase wurde für einfache PCR-Reaktionen verwendet. Um eine höhere Lesegenauigkeit zu erreichen, wurde für die Amplifikation der cDNA`s der entsprechenden Gene die Pfu-DNA-Polymerase benutzt.
Alle PCR-Reaktionen wurden mit dem T3 Thermocycler der Firma Biometra durchgeführt.
Folgende Bedingungen wurden für die PCR verwendet:
PCR-Bedingungen: für Taq-DNA-Polymerase für Pfu-DNA-Polymerase Denaturierung: 95°C 5 min 95°C 5 min
95°C 1 min 95°C 1 min
Annealingphase: AT (Primer) 1 min 35 Zyklen AT (Primer) 1 min 35 Zyklen Elongation: 72°C 1 min/kb 72°C 2 min/kb
72°C 10 min 72°C 10 min
Annealingtemperatur (AT) des Primers = Schmelztemperatur (Tm) des Primers – 1°C
Die amplifizierten Fragmente wurden im Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt, mit dem QIAquick Gel Extraktions Kit (Qiagen) aus dem Gel eluiert und anschließend kloniert und sequenziert (B.2.2.6).
B.2.2.5.2 Kolonie-PCR
Die Kolonie-PCR wurde zur Überprüfung der Transformation in E. coli angewendet. Dazu wurden Bakterienkolonien von der Agarplatte mittels Zahnstocher in ein PCR-Gefäß mit 20 µl sterilem Wasser überführt. Der Aufschluss der Bakterienzellen erfolgte 10 min bei 95°C. Danach wurde eine Standard-PCR (B.2.2.5.1) mit genspezifischen Primern (B.1.4) und Taq-DNA-Polymerase durchgeführt. Die Auswertung erfolgte durch Agarosegelelektrophorese.
B.2.2.6 Klonierung und Sequenzierung
Die für die Klonierung verwendeten Methoden zur elektrophoretischen Auftrennung von DNA im Agarosegel, zur Restriktion von DNA und zur Ligation von DNA wurden nach Vorschriften von Sambrook und Mitarbeitern (Sambrook et al., 1989) durchgeführt. Für die Präparation von Plasmid-DNA aus Bakterienkultur (B.2.2.1), die Elution von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen und die Reinigung von PCR-Produkten standen Kits (B.1.5) zur Verfügung.
Die Methoden wurden nach Herstellerprotokoll durchgeführt. Alle Transformationen erfolgten nach der Hitzeschockmethode von Cohen und Mitarbeitern (Cohen et al., 1972).
Die Klonierung lief nach folgendem Schema ab:
1. Standard-PCR
2. elektrophoretische Auftrennung der DNA im Agarosegel 3. Elution der DNA aus dem Agarosegel
4. Klonierung in den pCR®2.1 TOPO TA-Vektor (Invitrogen) 5. Transformation in TOP10® -Zellen (Invitrogen)
6. Identifizierung von positiven Klonen durch Kolonie-PCR (B.2.2.5.2) 7. Plasmidpräparation (B.2.2.1)
8. Restriktion, Auftrennung der DNA im Agarosegel, Elution der DNA aus dem Gel 9. Ligation in den pET21d-Vektor (Novagen)
10. Transformation in XL1-Blue-Zellen (Stratagen)
11. Identifizierung von positiven Klonen durch Kolonie-PCR (B.2.2.5.2) 12. Plasmidpräparation (B.2.2.1)
13. Transformation in die Expressionszellen Bl21 Codon Plus® (DE3) –RP(Stratagen)
Zur Klonierung des PCR-Produktes in den pCR®2.1 TOPO TA-Vektor (Invitrogen) wurde die Eigenschaft der Taq-DNA-Polymerase ausgenutzt, überhängende Adenosin-Reste am PCR-Produkt zu synthetisieren. Bei Verwendung der Pfu-DNA-Polymerase musste das Adenosin nach vorheriger Reinigung des PCR-Produktes angefügt werden. Das PCR-Produkt wurde 15 min bei 72°C mit 10 x PCR-Puffer, 0,25 µmol dATP und 0,5 U Taq-DNA-Polymerase inkubiert.
Die PCR-Produkte wurden nach dem Klonierungsschritt in die Vektoren durch Sequenzierung überprüft. Die Sequenzierungen wurde mit dem A.L.F.-Sequenziergerät (Pharmacia) von Frau Dr.
Angela Peterson am Biozentrum der Martin-Luther-Universität Halle sowie von der Firma
MWG-Biotech durchgeführt. Die Auswertung erfolgte mit der Software OMIGA 1.2 (Oxford Molecular Ltd.) und über das Internet (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
B.2.2.7 Rekombinante Expression in E. coli
Die transformierten Bakterien wurden in TB-Medium unter Zusatz von 50 µg/ml Carbenicillin als Selektionsantibiotikum bei 37°C und 250 rpm bis zu einer optischen Dichte OD600 von 0,6 angezogen. Die Induktion der Proteinbiosynthese erfolgte mit 1 mM IPTG bei 37°C für 4 h. Anschließend wurden die Bakterien 30 min bei 4°C und 5000 rpm abzentrifugiert und lysiert (B.2.3.1.2).
B.2.2.8 Northern Blot
Der Northern Blot wurde zum Transkriptnachweis der trI, trII und pmt in Pflanzengeweben genutzt. Dazu wurden 20 µg Gesamt-RNA in einem 1,2%igen Formaldehyd-Agarose-Gel elektrophoretisch aufgetrennt. Die RNA wurde zusammen mit 2-3 Volumenteilen Probenpuffer (66,7% deionisiertes Formamid; 27 mM MOPS; 8,9% Formaldehyd) und 0,1 Volumenteil Stopppuffer (0,25% (m/v) Bromphenolblau; 50% (v/v) Glycerol; 1 mM EDTA; pH 8,0) 15 min bei 65°C erhitzt und anschließend auf Eis gestellt. Nach Zusatz von 2 µl Ethidiumbromid (1 mg/ml) erfolgte die Elektrophorese für 3-4 h bei 100 V unter Verwendung von MOPS-Puffer (20 mM MOPS pH 7,0; 5 mM Natriumacetat; 1 mM EDTA). Das Gel wurde anschließend unter UV-Licht photographiert und 10 min in 20 x SSC (3 M NaCl; 0,3 M Natriumcitrat) geschwenkt. Die RNA wurde über Nacht durch Kapillarwirkung auf eine positiv geladene Nylonmembran (Hybond™-N+ Membran, Amersham-Bioscience) geblottet. Als Transferpuffer diente 20 x SSC. Die RNA wurde anschließend durch UV-Strahlung (120 mJ, UV Stratalinker 2400, Stratagene) kovalent an die Membran gebunden und die Membran 10 min in DEPC-Wasser gewaschen. Die Membran wurde bis zur Hybridisierung (B.2.2.11) in Folie eingeschweißt und bei –20°C aufbewahrt.
B.2.2.9 Dot Blot
Der Dot Blot wurde zur Überprüfung der Sonden und zum Ausschluss der Sondenkreuzreaktivität zwischen trI und trII eingesetzt. Plasmid-DNA (0,5–5 µg), die das nachzuweisende Gen enthielt, wurde punktförmig auf eine positiv geladene Nylonmembran (Hybond™-N+ Membran, Amersham-Bioscience) aufgetragen. Als Negativkontrolle diente bidestilliertes Wasser. Der Blot wurde 5 min in Denaturierungslösung (1,5 M NaCl; 0,5 M NaOH), 5 min in Neutralisationslösung (1,5 M NaCl; 0,5 M Tris-HCl, pH 7,4) und 5 min in 2 x SSC (0,3 M NaCl; 0,03 M Natriumcitrat) geschwenkt. Durch UV-Strahlung (120 mJ) wurde die DNA kovalent an die Membran gebunden. Bis zur Hybridisierung (B.2.2.11) wurde der Blot in Folie eingeschweißt und bei –20°C aufbewahrt.
B.2.2.10 Radioaktive Sondenmarkierung
Für die Hybridisierung wurden folgende Sonden verwendet:
trI: 400 bp-Fragment vom 3`Terminus (Keiner 2001) trII: 400 bp-Fragment vom 3`Terminus (Keiner 2001) pmt: 200 bp-Fragment vom 5`Terminus (Stenzel 2005)
Die Sonden wurden durch Standard-PCR (B.2.2.5.1) amplifiziert, im Agarosegel aufgetrennt und anschließend mit dem QIAquick Gel Extraktions Kit (Qiagen) aus dem Gel eluiert.
Als Ladekontrolle diente die 18S rRNA aus Lycopersicon esculentum (Dobrowolski et al., 1989).
Die radioaktive Markierung der Sonde erfolgte nach dem random primed Verfahren nach Feinberg und Vogelstein (Feinberg und Vogelstein, 1983) unter Verwendung des High Prime DNA Labeling Kits (Roche) und 50 µCi [α-32P] dATP (NEN). Anschließend wurden ungebundene Nukleotide mit dem QIAquick Nucleotide Removal Kit entfernt.
B.2.2.11 Hybridisierung von Northern Blot und Dot Blot
Die Hybridisierung von Northern Blot (B.2.2.8) und Dot Blot (B.2.2.9) wurde nach (Amasino 1986) durchgeführt. Die Blots wurden in 100 ml Hybridisierungspuffer für 4 h bei 42°C vorhybridisiert. Zum Abblocken aller freien Bindungsstellen wurde Heringsperma-DNA (100 µg/ml) hinzugefügt.
Hybridisierungspuffer: 0,25 M NaH2PO4, pH 7,2 0,25 M NaCl
1 mM EDTA 7% (m/v) SDS
50% (v/v) deionisiertes Formamid
10% (m/v) PEG (Mr 6000)
Nach Zugabe der radioaktiv markierten Sonde erfolgte die Hybridisierung für 16 h bei 42°C. Die unspezifisch gebundene Radioaktivität wurde anschließend nach folgendem Waschschema entfernt:
Waschschema:
5 min; RT 2 x SSC (0,3 M NaCl; 0,03 M Natriumcitrat) zweimal 20 – 60 min; 65°C 0,25 M NaH2PO4, 2% (m/v) SDS, 1 mM EDTA zweimal 20 min; 65°C 0,05 M NaH2PO4, 1% (m/v) SDS, 1 mM EDTA Der Blot wurde in Folie eingeschweißt und zur Detektion für 16 h auf eine Phosphorimagerplatte (Fuji) exponiert. Die Auswertung erfolgte mit dem Phosphorimager (Fuji, BAS 1500). Mit 0,1%iger (m/v) kochender SDS-Lösung wurde die Sonde wieder von der Membran entfernt. Der Blot wurde danach mit weiteren Sonden hybridisiert.