Ausgehend von den Ergebnissen leiten sich weitere Fragestellungen ab. Die nächsten Untersuchungen sollten sich auf die Regulation der Calysteginbiosynthese sowie die physiologische Bedeutung der Calystegine beziehen.
Regulation der Biosynthese:
Untersuchungen zur Regulation der Calysteginbiosynthese in S. tuberosum sollten mit transgenen Pflanzen durchgeführt werden. Dabei ist es sinnvoll, Gene an Verzweigungspunkten (PMT, TRII, TRI) überzuexprimieren bzw. zu supprimieren. Die Überexpression der PMT und der TRII sollten den regulatorischen Einfluss der Enzyme auf die Calysteginakkumulation klären.
Ferner könnte überprüft werden, ob eine gleichzeitige Überexpression der PMT und der TRII zu einer drastischen Steigerung in der Calysteginakkumulation führt. Zur Suppression der PMT und/oder TRII ist das RNAi-Verfahren gut geeignet (Nakamura et al., 2006). Dabei sollten Mutanten entstehen, die sehr wenig Calystegine akkumulieren. Interessant ist dabei, ob die entstandenen Pflanzen lebensfähig sind bzw. ob phänotypische Veränderungen im Vergleich zum Wildtyp bestehen. Durch Überexpression bzw. Suppression der TRI könnte die physiologische Rolle der TRI geklärt werden.
In dieser Arbeit wurde ein Transport von Tropinon und von Calysteginen postuliert. Ein weiterer Ansatzpunkt sind daher Untersuchungen zum Transport von Metaboliten der Biosynthese oder von Calysteginen. Dabei wäre es sinnvoll, markierte (13C, 15N) Metabolite der Biosynthese (z. B. Putrescin, Tropinon) an intakte Pflanzen zu applizieren. In einzelnen Pflanzen- und Knollengeweben sollten anschließend Zwischen- und Endprodukte der Calysteginbiosynthese nachgewiesen werden. Dabei können Aussagen getroffen werden, welcher Metabolit transportiert und welcher Metabolit metabolisiert wird. Auch markierte Calystegine sollten appliziert werden.
Ein wichtiger Punkt ist die Aufklärung der Biosynthese vom Pseudotropin zu den Calysteginen. Gene, die für die N-Demethylierung und die Hydroxylierung von Pseudotropin kodieren, sollten identifiziert werden. Anschließend könnte überprüft werden, ob diese Gene zuckerinduzierbar sind und damit einen regulatorischen Einfluss auf die Calysteginakkumulation haben. Auch die Gene auf dem Weg vom N-Methylputrescin zum Tropinon sind noch nicht identifiziert. Bei Vorliegen der Sequenzen von allen Genen der Calysteginbiosynthese, könnte die regulatorische Wirkung jedes einzelnen Enzyms untersucht werden.
Physiologische Bedeutung der Calystegine:
Eine wichtige Vorraussetzung für weitere Untersuchungen zur physiologischen Bedeutung von Calysteginen ist die Verfügbarkeit von Calysteginreinsubstanzen. Diese könnten aus Kartoffelkeimen isoliert werden und anschließend über verschiedene Ionenaustauscher gereinigt werden (Hueza et al., 2005).
Bisher wurden Calystegine und Stoffwechselmetabolite in Kartoffeln mit verändertem Kohlenhydratstoffwechsel analysiert. Als nächstes sollten Analysen von Stoffwechselmetaboliten
in Kartoffeln mit veränderter Calysteginbiosynthese untersucht werden. Dadurch könnten Metabolite oder Stoffwechselwege gefunden werden, die auf erhöhte oder verringerte Calystegingehalte reagieren. Die Applikation von Calysteginen an verschiedene Pflanzen- und Knollengewebe könnte zu ähnlichen Ergebnissen führen. Interessant ist auch eine Transkriptprofilanalyse von Kartoffeln mit veränderter Calysteginbiosynthese oder in Geweben nach Calysteginapplikation. Unter Verwendung von cDNA-Microarrays (Urbanczyk-Wochniak et al., 2005; Wang et al., 2005a) könnte die Transkription von Primärstoffwechselenzymen bei verändertem Calystegingehalt untersucht werden.
Zur Untersuchung der physiologischen Bedeutung der Calystegine sollten die Hemmstudien mit verschiedenen Enzymen des Kohlenhydratstoffwechsels fortgesetzt werden.
Viele Enzyme des Kohlenhydratstoffwechsels aus S. tuberosum wurden bereits kloniert und charakterisiert. In die Untersuchungen sollten die saccharoseabbauenden Enzyme Invertase (Hedley et al., 1993; Zhou et al., 1994) und Saccharosesynthase (Salanoubat und Genevieve, 1987) einbezogen werden. Neben der Hexokinase (Veramendi et al., 1999) und der Phosphoglucomutase (Tauberger et al., 2000; Fernie et al., 2002a) ist auch die Trehalase ein interessanter Ansatzpunkt. Dabei sollten verschiedene Calystegine auf ihre Hemmwirkung getestet und anschließend Ki-Werte bestimmt werden. Neben in vitro Studien ist es sinnvoll, die Hemmwirkung der Calystegine in vivo zu studieren. Dazu sollten Calystegine an Kartoffelgewebe appliziert werden und anschließend die Aktivität der entsprechenden Enzyme bestimmt werden.
E Zusammenfassung
Calystegine sind polyhydroxylierte Nortropanalkaloide, die Glycosidasen hemmen. In Solanum tuberosum akkumulieren Calystegine in allen Knollen- und Pflanzengeweben mit unterschiedlichen Gehalten. Calystegine leiten sich von der Tropanalkaloidbiosynthese ab.
Wichtige Biosyntheseenzyme wie PMT und TRII aus S. tuberosum sind hinreichend charakterisiert. In dieser Arbeit wurde nach Ansatzpunkten für eine physiologische Funktion der Calystegine gesucht. Dazu wurden Kartoffeln mit verändertem Kohlenhydratstoffwechsel auf die Calysteginbiosynthese analysiert. Durch parallele Untersuchungen von Calysteginen und Stoffwechselmetaboliten wurde nach möglichen Interaktionspartnern der Calystegine gesucht.
Zur Untersuchung wurden Kartoffeln mit apoplastisch überexprimierter Invertase (U-IN1), Kartoffeln mit cytosolisch überexprimierter Invertase (U-IN2) und Kartoffeln mit supprimierter Saccharosesynthase (RSSa) verwendet.
Calysteginbiosynthese in Kartoffeln mit verändertem Kohlenhydratstoffwechsel:
• Die Kartoffeln wurden hinsichtlich des Keimungsverhaltens und des Trockenmasseanteils charakterisiert. Kartoffeln mit cytosolisch überexprimierter Invertase keimten nicht. Die transformationsstärksten Linien mit supprimierter Saccharosesynthase keimten verzögert.
Alle transgenen Linien hatten einen geringeren Trockenmasseanteil als der Wildtyp.
• Die höchsten Calystegingehalte in Wildtyp-Kartoffeln wurden in der Schale, in dormanten Augen sowie in Keimen nachgewiesen. Während der Lagerung stieg der Calystegingehalt in der Schale leicht an. Während der Keimung sank der Calystegingehalt innerhalb einer Woche stark ab. In Wildtyp-Pflanzen akkumulierten in Wurzeln und Stolonen hohe Calysteginkonzentrationen.
• In Kartoffelknollen und Kartoffelpflanzen mit verändertem Kohlenhydratstoffwechsel wurden veränderte Calystegingehalte gefunden. In Kartoffeln mit überexprimierter Invertase (U-IN1 (33), U-IN2 (30)) ist der Calystegingehalt in der Schale kurz nach der Ernte 1,5fach und in Kartoffeln mit supprimierter Saccharosesynthase (RSSa (112)) 3fach erhöht. Während der Lagerung zeigten Kartoffeln mit apoplastisch überexprimierter Invertase und Kartoffeln mit supprimierter Saccharosesynthase einen dem Wildtyp vergleichbaren Verlauf auf einem anderen Konzentrationsniveau. In Kartoffeln mit cytosolisch überexprimierter Invertase nahm der Calystegingehalt während der Lagerung kontinuierlich ab. In Wurzeln von Pflanzen mit apoplastisch überexprimierter Invertase (U-IN1 (33)) war der Calystegingehalt 7fach und in Wurzeln von Pflanzen mit supprimierter Saccharosesynthase (RSSa (112)) 5fach erhöht.
• Die Expression der Biosyntheseenzyme PMT, TRI und TRII wurde analysiert. Transkript der PMT wurde in Wurzeln lokalisiert, wobei die transgenen Linien weniger Transkript im Vergleich zum Wildtyp akkumulierten. Transkript, Protein und Aktivität der TRII wurde hauptsächlich in Pflanzengeweben und in Keimen nachgewiesen. In den transgenen Linien wurden veränderte Transkriptmengen und Enzymaktivitäten der TRII detektiert, während der Proteingehalt der TRII nahezu identisch war. Transkript, Protein und Aktivität der TRI wurden vorrangig in Knollengeweben detektiert. Besonders Kartoffeln mit überexprimierter Invertase zeigten erhöhte trI-Transkripte. Proteingehalte und Aktivitäten der TRI waren nur geringfügig verändert.
Parallele Analyse von Calysteginen und Stoffwechselmetaboliten:
• 7 Calysteginstandardsubstanzen wurden in der GC-MS im Rahmen des metabolic profiling untersucht. Retentionszeiten, Massenspektren und spezifische Ionen wurden in eine Datenbank eingetragen, so dass eine gemeinsame Analyse von Calysteginen und Metaboliten möglich war.
• In Kartoffelgeweben (Keime und Schale) wurden Calystegin A3, Calystegin B2 und Calystegin B4 mit der Metabolitenprofilanalyse nachgewiesen. Die quantitativen Ergebnisse sind mit vorangegangenen Untersuchungen mit der GC identisch.
• In Keimen und in der Schale wurden 172 verschiedene Stoffwechselmetabolite detektiert, von denen 85 quantifiziert wurden. Die transgenen Linien wurden auf ihre Gesamtmetabolite und ihre Einzelmetabolite charakterisiert. Dabei wurden die aus der Literatur bekannten Ergebnisse bestätigt.
• Korrelationsanalysen zwischen Calysteginen und Stoffwechselmetaboliten ergaben in Keimen eine Vielzahl an Korrelationen mit Calystegin A3 und B2 und in der Schale mit Calystegin B4. In Keimen und in der Schale korrelierte Calystegin A3 mit B2 aber nicht mit Calystegin B4. Wichtige Korrelationen in Keimen sowie in der Schale wurden zwischen Calysteginen und Metaboliten des Kohlenhydratstoffwechsels festgestellt. Damit wurden Ansatzpunkte für die weitergehende Untersuchung einer physiologischen Rolle der Calystegine im Kohlenhydratstoffwechsel geschaffen.
Wirkung von Kohlenhydraten auf die Calysteginbiosynthese:
• Verschiedene Kohlenhydrate (Glucose, Fructose, Galactose, Saccharose, Trehalose, Raffinose) sowie das Osmotikum Sorbitol wurden an Kartoffelgewebe appliziert.
Anschließend wurde der Calystegingehalt und Transkript der PMT, TRI und TRII analysiert.
• Der Calystegingehalt in Keimen war bei allen Zuckern ca. 1,5-2fach erhöht, während in der Schale nur die Applikation von Galactose, Saccharose, Trehalose und Raffinose zu einer signifikanten Erhöhung des Calystegingehaltes führte.
• Das trII-Transkript wurde in Keimen durch Trehalose und Raffinose induziert. trI-Transkript war in der Schale und in Keimen bei allen Zuckern im Vergleich zur Kontrolle verringert. In Blättern hingegen wurde eine Induktion des trI-Transkriptes nach Glucose- und Galactoseapplikation beobachtet.
Wirkung von Calysteginen auf Enzyme des Kohlenhydratstoffwechsels:
• Die UDPGlucose-Pyrophosphorylase (UGPase) aus S. tuberosum wurde kloniert, exprimiert und gereinigt. Für die gereinigte UGPase wurde ein Km-Wert von 0,174 mM und eine maximale Reaktionsgeschwindigkeit von 615,12 nkat/mg Protein ermittelt.
• Die UGPase war nicht durch Calystegin B2 hemmbar.
• Calystegin B2 wurde als Inhibitor der Phosphoglucomutase aus Kaninchenmuskel (Oryctolagus cuniculus) bestimmt.
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