C.1 Untersuchungen zur Bildung der Calystegine in Solanum tuberosum
C.1.3 Calysteginbiosynthese während der Lagerung
Tag 155 nach der Ernte
WT U-IN1 U-IN2 RSSa
0 5 10 15 20
1 2 3 33 41 17 30 33 34 42 99 108 112 114 129 130
µmol/gTM
Tag 288 nach der Ernte
WT U-IN1 U-IN2 RSSa
0 5 10 15 20
1 2 3 33 41 17 30 33 34 42 99 108 112 114 129 130
µmol/g TM
Abb. C-9: Gesamtcalysteginakkumulation in 1-2 mm Schale von transgenen Kartoffelknollen im Vergleich zum Wildtyp während der Lagerung.
Der Calystegingehalt stellt die Summe aus Calystegin A3 und B2 dar. Die Daten sind Mittelwerte aus 3 unabhängigen Bestimmungen von jeweils 2 Kartoffelknollen. Standardabweichungen sind als Fehlerbalken angegeben. Größe 1: 4-6 cm Knollendurchmesser
C.1.3.1.2 Calysteginakkumulation in Kartoffelaugen
In Kartoffelaugen wurden ebenfalls Calystegin A3 und B2 nachgewiesen. Am Tag 92 wurden hohe Calysteginkonzentrationen gemessen. Allerdings erreichten nur die Linien RSSa (112) und (129) mit supprimierter Saccharosesynthase sowie die Linie U-IN2 (30) mit cytosolisch überexprimierter Invertase Calysteginkonzentrationen im Wildtyp-Bereich. Kartoffeln mit apoplastisch überexprimierter Invertase akkumulierten in den Augen weniger Calystegine als der Wildtyp. Am Tag 120 schwankt der Calystegingehalt sehr stark. Diese Schwankung ist auch im Wildtyp zu beobachten. In Linien mit überexprimierter Invertase (mit Ausnahme der Linien U-IN2 (34) und (42)) sank der Calystegingehalt auf ein Minimum. In Kartoffeln mit supprimierter Saccharosesynthase wurden noch höhere Calysteginkonzentrationen gefunden. Die Schwankungen im Calystegingehalt wurden auch an anderen Erntetagen sowie in den Augen von Knollen der Größe 2 beobachtet (ohne Abbildung). Keiner und Dräger beschrieben sehr hohe Calystegingehalte in keimenden Augen (Keiner und Dräger, 2000). Es ist denkbar, dass sich die Knollen in unterschiedlichen Phasen vom Übergang aus der Dormanz- in die Keimungsphase befanden und dadurch unterschiedliche Calysteginmengen akkumulierten. Die gezeigten Ergebnisse waren jeweils Momentaufnahmen an den einzelnen Erntetagen. Abb. C-10 zeigt ausgewählte Ergebnisse. Der Anteil Calystegin A3 lag zwischen 52 und 58%.
Tag 92 nach der Ernte
RSSa U-IN2
U-IN1 WT
0 5 10 15 20
1 2 3 33 41 17 30 33 34 42 99 108 112 114 129 130
µmol/g TM
Tag 120 nach der Ernte
RSSa U-IN2
U-IN1 WT
0 5 10 15 20
1 2 3 33 41 17 30 33 34 42 99 108 112 114 129 130
µmol/g TM
Abb. C-10: Gesamtcalysteginakkumulation in den Augen von transgenen Kartoffelknollen im Vergleich zum Wildtyp an ausgewählten Tagen während der Lagerung.
Der Calystegingehalt stellt die Summe aus Calystegin A3 und B2 dar. Die Daten sind Mittelwerte aus 3 unabhängigen Bestimmungen von jeweils 2 Kartoffelknollen. Standardabweichungen sind als Fehlerbalken angegeben. Größe 1: 4-6 cm Knollendurchmesser
C.1.3.1.3 Calysteginakkumulation in Keimen
Der Calystegingehalt in 1 cm langen Keimen wurde am Tag 288 nach der Ernte bestimmt.
Calystegin A3 und B2 waren in allen Keimen zu finden, wobei der Gesamtgehalt sehr gering war.
In den transgenen Linien U-IN1 (33) mit apoplastisch überexprimierter Invertase sowie RSSa (112) mit supprimierter Saccharosesynthase wurden höhere Calystegingehalte als im Wildtyp gemessen. Kartoffeln mit cytosolisch überexprimierter Invertase keimten unter den gewählten Bedingungen nicht. Abb. C-11 zeigt die Calystegingehalte in Keimen 288 Tage nach der Ernte.
Der Calystegin A3-Anteil betrug ca. 42%. Keime sind in der Literatur als Gewebe mit sehr hohen Calystegingehalten beschrieben worden (Keiner und Dräger, 2000). Der sehr geringe Calystegingehalt am Tag 288 könnte mit dem Alter der Knollen erklärt werden, da auch in der Schale zu diesem Zeitpunkt sehr wenig Calystegine gefunden wurden (Abb. C-9). Im Rahmen der Metabolitenprofilanalyse (C.2.1.3.1) wurden Keime am Tag 176 nach der Ernte analysiert.
Aufgrund fehlender Kalibrierung war hier keine Bestimmung der absoluten Calystegin-konzentration im Gewebe möglich. Nach Standardisierung über Ergebnisse in der Schale am Tag 106, die im Rahmen des Lagerungsversuches aber auch in der Metabolitenprofilanalyse untersucht worden waren, konnten Calysteginkonzentrationen für diese Keime abgeschätzt werden. In Wildtyp-Keimen akkumulierten 176 Tage nach der Ernte ca. 20 µmol/g TM, in Keimen der Linie U-IN1 (33) ca. 25 µmol/g TM und in Keimen der Linie RSSa (112) ca. 55 µmol/g TM.
Damit akkumulierten in Keimen deutlich mehr Calystegine als in den übrigen Knollengeweben.
Tag 288 nach der Ernte
RSSa U-IN1
WT 0 5 10 15 20
1 2 3 33 41 99 108 112 114 129
µmol/g TM
Abb. C-11: Gesamtcalysteginakkumulation in Keimen von transgenen Kartoffelknollen im Vergleich zum Wildtyp am Tag 288 nach der Ernte.
Der Calystegingehalt stellt die Summe aus Calystegin A3 und B2 dar. Die Daten sind Mittelwerte aus 3 unabhängigen Bestimmungen von jeweils 2 Kartoffelknollen. Standardabweichungen sind als Fehlerbalken angegeben. Größe 1: 4-6 cm Knollendurchmesser
C.1.3.2 Transkriptnachweis
Während der Lagerung wurden Transkripte der trI, trII und pmt in der Schale an den Erntetagen 2-7 sowie in 1 cm und 5-10 cm langen Keimen am Tag 191 und 249 nach der Ernte analysiert. Die Ergebnisse wurden aus Einzelanalysen erhalten. In beiden Geweben wurde kein pmt-Transkript detektiert. Transkripte der trI und trII wurden in beiden Geweben nachgewiesen.
C.1.3.2.1 Transkriptnachweis der trII
In der Schale wurde trII-Transkript an den Tagen 92 und 99 im Wildtyp nachgewiesen. In der Schale von Kartoffeln mit apoplastisch überexprimierter Invertase wurde die trII in den Linien U-IN1 (3) und (33) am Tag 99 (Abb. C-12) und in Kartoffeln mit supprimierter
Saccharosesynthase in der Linie RSSa (99) am Tag 92 (ohne Abbildung) detektiert. Bis zum Tag 99 nach der Ernte stiegen die Calystegine in der Schale an. Der Nachweis der trII zu diesem Zeitpunkt könnte auf die Bildung von Calysteginen in der Knolle während der Lagerung hindeuten. In der Schale von Kartoffeln mit cytosolisch überexprimierter Invertase wurde kein trII-Transkript nachgewiesen. In diesen Kartoffeln sank der Calystegingehalt während der Lagerung kontinuierlich. In Keimen wurde die trII in allen transgenen Linien, von denen Keime gewonnen wurden (C.1.1.3), sowie im Wildtyp detektiert. Auch die trII zeigte veränderte Expressionsstärken bei verändertem Kohlenhydratstoffwechsel. Eine Korrelation der Transkriptmenge mit der Transformationsstärke wurde für 1 cm bzw. 5-10 cm lange Keime von Kartoffeln mit apoplastisch überexprimierter Invertase festgestellt. In Kartoffeln mit supprimierter Saccharosesynthase wurde diese Korrelation nur bedingt beobachtet, da die transformationsstärkste Linie RSSa (112) sehr wenig trII exprimierte. Die Linien RSSa (129) und (108) mit dem zweit- bzw. dritthöchsten Transformationseffekt zeigten deutlich erhöhte trII-Transkriptmengen (Abb. C-13).
Abb. C-12: Transkriptnachweis der trII in 1-2 mm Schale von Kartoffeln mit überexprimierter Invertase im Vergleich zum Wildtyp durch Northern Blot.
Probenauftrag: 20 µg Gesamt-RNA; obere Zeile zeigt die mRNA der trII; untere Zeile zeigt die 18S rRNA als Ladekontrolle; Proben: WT: Wildtyp 1, U-IN1 (3), (33) und (41): Kartoffeln mit apoplastisch überexprimierter Invertase, U-IN2 (17), (30), (33), (34) und (42): Kartoffeln mit cytosolisch überexprimierter Invertase; Größe 2: 2-4 cm Knollendurchmesser; Knollenalter: 99 Tage nach der Ernte
Abb. C-13: Transkriptnachweis der trII in Keimen von transgenen Kartoffeln im Vergleich zum Wildtyp durch Northern Blot.
Probenauftrag: 20 µg Gesamt-RNA; obere Zeile zeigt die mRNA der trII; untere Zeile zeigt die 18S rRNA als Ladekontrolle; Das Diagramm beinhaltet die Quantifizierung der mRNA der trII aus dem Northern Blot im Vergleich zum Wildtyp; Proben: WT1 und WT2: Wildtyp 1 und 2 (1 cm Keime), WT*: Wildtyp 1 (5-10 cm Keime), U-IN1 (3), (33) und (41): Kartoffeln mit apoplastisch überexprimierter Invertase (1 cm Keime), RSSa (99), (108), (112), (114) und (129): Kartoffeln mit supprimierter Saccharosesynthase (1 cm Keime); Knollenalter: 249 Tage nach der Ernte
U-IN1 U-IN2
WT 3 33 41 17 30 33 34 42
trII
18S rRNA
U-IN1 RSSa
WT1 WT* 3 33 41 99 108 112 114 129 WT2 trII
18S rRNA
RSSa U-IN1
0 100 200 300 400 500
WT1 WT* 3 33 41 99 108 112 114 129 WT2
% mRNA im Vergleich zum Wildtyp
C.1.3.2.2 Transkriptnachweis der trI
trI-Transkript wurde im Wildtyp und in Kartoffeln mit überexprimierter Invertase bis zum Tag 120 nach der Ernte und in Kartoffeln mit supprimierter Saccharosesynthase nur bis zum Tag 99 nach der Ernte nachgewiesen. Während der Lagerung wurde die trI in der Schale unterschiedlich stark exprimiert. Im Wildtyp wurde die größte trI-Transkriptmenge am Tag 92 nach der Ernte nachgewiesen (ohne Abbildung). In der Schale von Kartoffeln mit apoplastisch überexprimierter Invertase sowie von Kartoffeln mit supprimierter Saccharosesynthase wurden die höchsten Transkriptmengen am Tag 92 und 99 bzw. am Tag 99 beobachtet. In der Schale von Kartoffeln mit cytosolisch überexprimierter Invertase wurde die trI bis zum Tag 120 nach der Ernte stark exprimiert, wobei die transformationsstärkste Linie U-IN2 (17) meist die höchste Transkriptakkumulation aufwies. Abb. C-14 zeigt trI-Transkript in der Schale am Tag 99 nach der Ernte. In Keimen wurde trI-Transkript nur schwach detektiert (ohne Abbildung).
U-IN1 U-IN2
WT1 3 33 41 17 30 33 34 42 WT2 trI
18S rRNA
RSSa
108 108* 112 112* 129 129*
trI
18S rRNA
Abb. C-14: Transkriptnachweis der trI in 1-2 mm Schale von transgenen Kartoffeln im Vergleich zum Wildtyp durch Northern Blot.
Probenauftrag: 20 µg Gesamt-RNA; obere Zeile zeigt die mRNA der trI; untere Zeile zeigt die 18S rRNA als Ladekontrolle; Proben: WT1 und WT2: Wildtyp 1 und 2, U-IN1 (3), (33) und (41):
Kartoffeln mit apoplastisch überexprimierter Invertase, U-IN2 (17), (30), (33), (34) und (42):
Kartoffeln mit cytosolisch überexprimierter Invertase; RSSa (108), (112) und (129): Kartoffeln mit supprimierter Saccharosesynthase; Von Linie RSSa (108*) war nicht ausreichend Material für eine gute RNA-Präparation vorhanden; Größe 1: 4-6 cm Knollendurchmesser; Größe 2: 2-4 cm Knollendurchmesser (durch * gekennzeichnet); Knollenalter: 99 Tage nach der Ernte
C.1.3.3 Intermediate der Biosynthese
In Keimen sollte die Bestimmung von endogen vorhandenen Intermediaten (Tropinon, Tropin und Pseudotropin) weitere Aufschlüsse über die Biosynthese geben. Zusätzlich wurde an Keime 2 mM Tropinonlösung appliziert und die Bildung der Reduktionsprodukte der TRI bzw.
TRII, Tropin und Pseudotropin, verfolgt. Davon können Rückschlüsse auf die TRI- und/oder TRII-Aktivität gezogen werden. Endogen wurde in Keimen von transgenen Linien und vom Wildtyp jeweils Tropinon in Spuren detektiert (Konzentration < 0,1 µmol/g TM). Tropin und Pseudotropin wurden nicht gefunden. Nach Applikation von Tropinon wurde Pseudotropin gebildet. Tropin entstand nur in Spuren. Somit wurde TRI- und TRII-Aktivität im Gewebe nachgewiesen. Im Western Blot wurde allerdings weder TRI- noch TRII-Protein detektiert.
Die höchste Pseudotropinmenge wurde in der Linie U-IN1 (33) gebildet. In dieser Linie wurde schon erhöhtes trII-Transkript sowie eine leicht erhöhte Calysteginkonzentration beobachtet. In Keimen von Kartoffeln mit supprimierter Saccharosesynthase wurde weniger Pseudotropin als im Wildtyp gebildet. Die Linie RSSa (112) hatte weniger trII-Transkript aber einen stark erhöhten Calystegingehalt. Abb. C-15 zeigt das Ergebnis.
WT U-IN1 RSSa
0 20 40 60 80 100
1 3 33 41 99 108 112 114 129
Pseudotropingehalt in µmol/g Trockenmasse
Abb. C-15: Pseudotropinakkumulation in Keimen (1 cm) von transgenen Kartoffelknollen im Vergleich zum Wildtyp nach Tropinonapplikation.
Die Daten sind Mittelwerte aus 1-3 unabhängigen Bestimmungen. Standardabweichungen sind als Fehlerbalken angegeben.