Wie bereits aus mehreren Studien bekannt ist und in Kapitel 4.1 gezeigt wurde, bindet Annexin A1 in Gegenwart von Ca2+-Ionen an PS-haltige Membranen und lässt sich durch Zugabe eines Ca2+-Chelators wieder von den Membranen ablösen.8,24,31 So sollte im Folgenden mit Hilfe der Quarzmikrowaage die Bindung von Annexin A1 an planare festkörperunterstützte Membranen quantifiziert werden. Dabei sollte das Ausmaß der Reversibilität der Wechselwirkung durch die Messung der Desorption in Abhängigkeit der Ca2+-Konzentration analysiert werden und Erkenntnisse über die Dynamik dieser Interaktion gewonnen werden (Kapitel 4.3). Weiterhin sollte die Annexin A1-vermittelte Membranaggregation aus dem Adsorptionsverhalten von Vesikeln an membran-gebundenes Annexin A1 mittels der dissipativen Quarzmikrowaage (QCM-D) untersucht werden (Kapitel 4.5).
Um die Kinetik der Wechselwirkung von Annexin A1 mit festkörperunterstützten Membranen, sowie der Interaktion von Vesikeln mit membran-gebundenem Annexin A1 beschreiben zu können, ist es nötig, ein geeignetes theoretisches Modell aufzustellen. Zur allgemeinen Beschreibung der Bindung von Makromolekülen an Oberflächen wird im Folgenden das Random Sequential Adsorption (RSA)-Modell vorgestellt.
Während das Langmuir-Modell die Bindung an definierte nicht-überlappende Gitterplätze voraussetzt, wird beim RSA-Modell entweder die Adsorption an eine kontinuierliche Fläche oder an Gitterplätze, die sich überlappen können, angenommen.
Das Prinzip der Adsorption nach dem RSA-Modell basiert auf der zufälligen Positionierung eines Partikels auf einer definierten Fläche mit gleicher Wahrscheinlichkeit. Bei Überlappung des Partikels mit einem anderen adsorbierten Partikel erfolgt keine Adsorption. Bei erfolgreicher Adsorption wird der Partikel fixiert und die Prozedur wiederholt sich. Auf diese Weise kann für scheibenförmige Partikel eine maximale Belegung von 0,547 erreicht werden.112
Es lassen sich drei unterschiedliche Fälle der Adsorption unterscheiden:
a) Reversible Adsorption b) Irreversible Adsorption
c) Partiell reversible Adsorption / heterogene Oberflächen
a) Reversible Adsorption
Die Ratengleichung im reversiblen Fall (vergleiche Abbildung 39) kann ausgedrückt werden durch:
( ) ( )
δ θ θ ρθ π
off on 2
~ a k
dt k
d = Φ − , GL-42
wobei θ die Oberflächenbelegung, k~on die Geschwindigkeitskonstante der Adsorption, koff die Geschwindigkeitskonstante der Desorption, πa2 die Fläche, welche durch einen scheibenförmigen Partikel belegt wird, Φ(θ) die Oberflächenblockierfunktion und ρ(δ) die Partikeldichte in der Nähe der Oberfläche beschreiben.
Abbildung 39: Modell der vollständig reversiblen Bindung von Teilchen auf eine Oberfläche mit den Geschwindigkeitskonstanten der Adsorption kon und der Desorption koff.
ρ(δ) hängt vom Massentransport der Moleküle zur Oberfläche ab. Der Fluss j zur Oberfläche kann im Falle eines Stauflusspunktes durch Gleichung 43 näherungsweise ausgedrückt werden:113,114
( ) ( ) [
ρ ∞ −ρ δ]
=ktr
j , GL-43
mit der Transportgeschwindigkeitskonstante ktr und der Moleküldichte ρ(∞) in der Lösung.
Das Modell der reversiblen Adsorption stellt einen idealen Fall dar, der in der Praxis bei der Adsorption von Biomolekülen an Oberflächen nur selten auftritt. Meistens wird eine irreversible oder zumindest partiell irreversible Adsorption beobachtet.115-117
b) Irreversible Adsorption
Da festgestellt wurde, dass es sich bei der Adsorption von Vesikeln an membran-gebundenes Annexin A1 um einen irreversiblen Prozess handelt (Kapitel 4.5), wird im Folgenden ein Modell zur Auswertung der Kinetik der irreversiblen Adsorption von Vesikeln vorgestellt.
Für eine irreversible Adsorption (vergleiche Abbildung 40) ist koff = 0. Somit ergibt sich als Ratengleichung:
( ) ( )
δ θρ θ = irrπ 2 Φ
~on a dt k
d , GL-44
wobei k~onirr die Geschwindigkeitskonstante der irreversiblen Adsorption, πa2 die Fläche, welche durch ein Molekül belegt wird, Φ(θ) die Oberflächenblockierfunktion und ρ(δ) die Moleküldichte in der Nähe der Oberfläche ist.
Abbildung 40: Modell der irreversiblen Adsorption mit der Geschwindigkeitskonstanten konirr von Teilchen an eine Oberfläche, die in gleich große Bereiche aufgeteilt ist.
Zur Auswertung der Kinetik der Adsorption von Vesikeln an membran-gebundenes Annexin A1 wurden geeignete Computersimulationen durchgeführt, welche auch die Diffusion der Vesikel zu Oberfläche berücksichtigen (Algorithmus vergleiche 118,119).* Die Adsorption von Vesikeln wurde durch die zweidimensionale aufeinanderfolgende zufällige Adsorption (RSA) von runden Scheiben simuliert in Kombination mit einem mean-field-Ansatz, um den Fluss der Vesikel zur Oberfläche zu berücksichtigen.
Hierfür wurde eine quadratische Fläche mit einer Kantenlänge von 12 µm angenommen, an die Vesikel mit einem Radius von (60 ± 10) nm adsorbieren (vergleiche Abbildung 40). Dabei wurden die elektrostatischen Wechselwirkungen
* Die Simulationen wurden von E. Lüthgens und A. Janshoff, Johannes-Gutenberg-Universität Mainz, durchgeführt.
zwischen den adsorbierten Vesikeln, die hauptsächlich negativ geladen waren, durch eine Erhöhung des effektiven Radius berücksichtigt (Berücksichtigung der Elektrostatik bei der Größe der Vesikel, siehe Anhang 7.2).
c) Partiell reversible Adsorption / heterogene Oberflächen
Für die Bindung von Annexin A1 an festkörperunterstützte Membranen wurde festgestellt, dass es sich um eine partiell reversible Bindung handelt, d.h. ein Teil des Proteins adsorbiert irreversibel und ein Teil reversibel. Im Folgenden wird ein Modell aufgestellt, nach dem die Kinetik dieser Bindung ausgewertet werden kann.
Es wird angenommen, dass eine heterogene Oberfläche vorliegt, an deren unterschiedliche Bereiche das Protein unterschiedlich bindet. Für die Adsorption von Annexin A1 an Membranen wird angenommen, dass das Protein irreversibel an runde Domänen und irreversibel an die Bereiche zwischen den Domänen bindet (Abbildung 41).
Abbildung 41: Modell der partiell reversiblen Adsorption von Teilchen an eine Oberfläche. Auf der Oberfläche befinden sich Bereiche, hier runde weiße Domänen, an die Teilchen irreversibel adsorbieren (konirr). Die reversible Adsorption (kon und koff) kann an die restliche Oberfläche (Zwischenbereich) erfolgen.
Für den Bereich der irreversiblen (Index 1) und der reversiblen (Index 2) Adsorption können separate Ratengleichungen aufgestellt werden:
( ) ( )
1 1irr 2
~on
1 π ρ δ θ
θ =k a Φ dt
d GL-45
und
( ) ( )
2 2 off 2on 2
2 ~ π ρ δ θ θ
θ k a k
dt
d = Φ − , GL-46
wobei k~onirr die Geschwindigkeitskonstante der irreversiblen Adsorption, k~on und koff
die Werte für die reversible Adsorption sind. Die reversible und irreversible Adsorption kann jedoch nicht strikt getrennt voneinander betrachtet werden, da bei der Adsorption eines Teilchens an einer Domänengrenze (vergleiche Abbildung 41) zwar das Teilchen als irreversibel gebunden betrachtet wird, jedoch sowohl θ1 als auch θ2 verändert werden.
Zur Auswertung der Kinetik der Adsorption von Annexin A1 an festkörperunterstützte POPC/POPS (4:1)-Membranen wurden Computersimulationen durchgeführt, welche die reversible und die irreversible Adsorption, sowie die Diffusion des Proteins zur Oberfläche umfassen.* Die Proteinadsorption durch die zweidimensionale aufeinanderfolgende zufällige Adsorption (RSA) von harten runden Scheiben simuliert in Kombination mit einem mean-field-Ansatz.
Es wurde eine Simulationsfläche mit der Kantenlänge 1 µm angenommen, auf der 200 kreisrunde Domänen zufällig angeordnet sind. Die von den Domänen eingenommene maximale Oberflächenbelegung wurde auf 35 % gesetzt. Um eine geringere Oberflächenbelegung zu berücksichtigen wurde die von den Domänen eingenommene Oberfläche zwischen 5 % und 35 % variiert, und mittlere Domänengrößen von 17 bis 44,8 nm für die Simulationen verwendet.
* Die Simulationen wurden von S. Faiß, E. Lüthgens und A. Janshoff, Johannes-Gutenberg-Universität Mainz, durchgeführt.
4.3 Einfluss von Ca2+-Ionen auf die Adsorption und Desorption von