Diskussion

4.1.6.1 Isolierung und Charakterisierung von Annexin A1 aus verschiedenen Organismen

Annexin A1 wurde aus zwei verschiedenen Organismen isoliert. Durch rekombinante Expression in E.coli-Bakterien konnten aus einem Liter Kultur 35 mg Annexin A1 mit einer Reinheit von über 95 % nach einer Vorschrift von Rosengarth et al.⁷⁸ isoliert werden. Alle Aufreinigungsschritte wurden in Ca²⁺-freien Lösungen durchgeführt, da die Proteolyse des proteolyseempfindlichen N-Terminus von Annexin A1 in Ca²⁺-freier Umgebung langsamer abläuft als in Gegenwart von Ca²⁺-Ionen.^8,42 Der Grund hierfür ist, dass Annexin A1 im Ca²⁺-beladenen und –freien Zustand unterschiedliche Konformationen aufweist. Die N-terminale Domäne ist in Abwesenheit von Ca²⁺-Ionen

in die relativ proteolysestabile Kerndomäne eingelagert und ist somit wahrscheinlich für Proteasen erschwert zugänglich.¹⁶ Durch die zusätzliche Verwendung von Proteaseinhibitoren wurde die Proteolyse erfolgreich unterdrückt, sodass bei allen Aufreinigungsschritten in den SDS-Gelen keine proteolytischen Fragmente wie

∆^1-16 Annexin A1 mit 35 kDa oder ∆^1-29Annexin A1 mit 33 kDa zu erkennen waren.

Auf diese Weise konnte vollständiges Annexin A1n-ac mit guter Ausbeute isoliert werden.

Das Elutionsprofil der MonoS-Säule zeigte neben einem Hauptpeak auch noch mehrere kleine Nebenpeaks. Aus den SDS-Gelen ist erkennbar, dass bei den Elutionsfraktionen des Hauptpeaks nur eine einzelne Bande bei ca. 36 kDa auftritt, jedoch bei den Fraktionen der Nebenpeaks ebenfalls nur eine schwache Bande bei 36 kDa und keine weiteren Banden nachgewiesen werden konnten. So wird angenommen, dass die Nebenpeaks entweder durch Verunreinigungen zustande kommen, die nicht auf den hier verwendeten 12,5 und 15 %igen SDS-Gelen nachzuweisen sind, oder dass Annexin A1-Populationen, welche durch partielle Denaturierung oder Oxidation veränderte Ladungseigenschaften besitzen, bei unterschiedlichen Salzkonzentrationen eluieren. Es wurde darauf geachtet, dass die Fraktionen des Hauptpeaks nicht mit den Fraktionen der Nebenpeaks vereinigt wurden, um die Verwendung von einheitlichem Annexin A1n-ac

für die in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen zu gewährleisten.

Im Gegensatz zu prokaryontischen Systemen, wie Bakterien, können in eukaryontischen Expressionssystemen, wie Hefen oder Insektenzellen, Proteine mit ihren posttranslationen Modifizierungen isoliert werden. Nur die Isolierung von Proteinen aus Primärgewebe gewährleistet jedoch, dass diese in ihrer original wirksamen Form mit dem entsprechenden Anteil an Modifizierungen gewonnen werden. Allerdings sind derartige Aufreinigungen meist aufwendiger und liefern geringere Ausbeuten. Da die N-terminale Acetylierung von Annexin A1 essentiell für seine Wechselwirkung mit S100A11 sein soll, wurde es aus Schweinlunge nach einer leicht veränderten Vorschrift von Seemann et al. aufgereinigt.^58,71 Aus 700 g Lunge wurden 0,7 mg Annexin A1ac mit einer Reinheit von über 95 % gewonnen. Bei dieser Methode war es essentiell, die Proteolyse von Annexin A1ac während der Aufreinigung so gut wie möglich durch eine schnelle Aufarbeitung des Gewebes, den Einsatz hoher Konzentrationen an Proteaseinhibitoren und ständige Kühlung des Ansatzes einzuschränken. Die deutlichen Banden bei ca. 33 kDa, der typischen Masse von Annexin-Kerndomänen, im SDS-Gel deuten darauf hin, dass trotz der Maßnahmen, Proteolyseprozesse einzuschränken, ein großer Anteil an N-terminal verkürzten Annexinen vorliegt. Dies liegt zum einen an der sukzessiven Proteolyse der Proteine vor allem in den Anfangsschritten der Aufreinigung, zum anderen daran, dass auch im Gewebe selbst bereits proteolytisch

abgedaute Annexine vorliegen. Es ist bekannt, dass durch die kontrollierte Proteolyse N-terminaler Segmente die Funktion der einzelnen Annexine reguliert wird.⁷ So ist es naheliegend, dass bereits in lebenden Zellen ein bestimmter Anteil an Annexin-Fragmenten mit unterschiedlichen Proteolysegraden vorliegen.

Die mittleren molekularen Massen des aus E.coli isolierten Annexin A1n-ac und des aus Schweinelunge gewonnenen N-terminal acetylierten Annexin A1ac wurden mittels ESI-MS bestimmt. Die Differenz der beiden ermittelten mittleren molaren Massen entsprach im Rahmen des Fehlerbereiches der Masse einer Acetylgruppe (42 g/mol).

Die Blockierung der N-terminalen Aminosäure des isolierten Annexin A1ac bei der N-terminalen Sequenzierung bestätigte ebenfalls, dass das Protein aus Schweinelunge, im Gegensatz zu rekombinantem Annexin A1n-ac, am Aminoende acetyliert ist. Trotzdem konnte die Sequenz der ersten Aminosäuren bestimmt werden, die mit der des nicht-acetylierten Annexin A1n-ac übereinstimmt und das Protein eindeutig als Annexin A1ac

identifiziert. Dies war möglich, da ein geringer Anteil des Proteins in nicht-acetylierter Form vorlag (E. Hochmuth, persönliche Mitteilung). Der genaue Grad der Acetylierung konnte jedoch nicht bestimmt werden. Da aber das Massenspektrum des aus Schweinlunge isolierten Annexins nur einen, wenn auch weniger aufgelösten, Peak um 38655 g/mol und keinen signifikanten Peak bei einer um 42 g/mol kleineren Masse aufwies, wurde davon ausgegangen dass nur ein vernachlässigbarer Anteil an nicht-acetyliertem Annexin A1 nach der Aufreinigung aus Schweinelunge vorlag.

Um sicherzugehen, dass die isolierten Proteine in ihrer aktiven Form gewonnen wurden, wurde jeweils ein Aktivitätstest durchgeführt. Hierbei wurde die Eigenschaft der Annexine, Ca²⁺-abhängig an negativ-geladene Phospholipide zu binden mittels eines Vesikelpellettierungsassays kontrolliert. Multilamellare Vesikel, die zu 80 % aus POPC und zu 20 % aus dem negativ geladenen POPS bestanden, wurden mit dem entsprechenden Annexin in Gegenwart von Ca²⁺-Ionen inkubiert. Die Vesikel wurden mit den daran gebundenen Proteinen pelletiert und anschließend die Ca²⁺-abhängig gebundenen Proteine wieder durch Zugabe von EGTA abgelöst. Die SDS-PAGE Analysen ergaben eindeutig, dass die isolierten Proteine Annexin A1n-ac und Annexin A1ac Ca²⁺-abhängig an Membranen binden. Allerdings blieb ein geringer Teil (etwa 20

%) von Annexin A1 nach Inkubation mit EGTA irreversibel an die Vesikel gebunden.

Schläpfer et al. zeigten ebenfalls, dass Annexin A1 nur in Gegenwart von Ca²⁺-Ionen an unilamellare PS-Vesikel und nicht an PC-Vesikel bindet.²⁴

4.1.6.2 Isolierung von S100A11 aus E.coli

Die nach einer leicht veränderten Vorschrift von Seemann et al.⁵⁹ durchgeführte Aufreinigung von S100A11 aus einer 100 ml E.coli-Kultur lieferte eine Ausbeute von 17 mg mit einer Reinheit von über 95 %. Das gegenüber Proteolyse relativ unempfindliche S100A11 konnte in nur einem Aufreinigungsschritt mit hoher Reinheit gewonnen werden. Zur Aufreinigung wurde die unterschiedliche Konformation des Proteins im Ca²⁺-beladenen und Ca²⁺-freien Zustand ausgenutzt. Durch die Besetzung der Ca²⁺-Bindungsstellen treten hydrophobe Aminosäurereste an die Proteinoberfläche.^47,51,54 So kann das Protein an eine hydrophobe Matrix wie Phenylsepharose über hydrophobe Wechselwirkungen binden. Die Wechselwirkung konnte aufgrund einer Konformationsänderung des Proteins in seinen hydrophileren Ca²⁺-freien Zustand nach Entzug der gebundenen Ca²⁺-Ionen durch EGTA aufgelöst werden.47,48,51,54,59,108 Die Aufreinigung von S100A11 über die Ca²⁺-abhängige Bindung an eine hydrophobe Matrix beschrieben auch Allen et al.⁴⁸ aus Primärgewebe wie Hühnermuskelmagen und Ohta et al.¹⁰⁹ aus dem Schweineherzmuskel.

Das isolierte Protein wurde eindeutig durch Western-Blot-Analyse, Massenspektroskopie und N-terminaler Sequenzierung als S100A11 identifiziert.

Seemann et al. konnten mittels analytischer Gelfiltration zeigen, dass die Retentionszeit, bei der das isolierte S100A11 eluierte, einer Masse von etwa 20 kDa entsprach und somit in der für S100-Proteine charakteristischen dimeren Form vorlag.^58,59

4.1.6.3 Isolierung des Annexin A2t aus Schweinemucosa und Aufspaltung in seine aktiven Untereinheiten

Annexin A2t wurde nach einer leicht veränderten Vorschrift von Gerke und Weber⁷⁴ aus Schweinemucosa isoliert. Aus 700 g Mucosa wurden etwa 50 mg Annexin A2t mit einer Reinheit von über 95 % gewonnen. Durch MALDI-MS wurde das Protein eindeutig als nicht-kovalent verbundener Komplex aus den beiden Untereinheiten Annexin A2m und S100A10 nachgewiesen.⁷⁹ So wurde angenommen, dass nach der Denaturierung von Annexin A2t in Gegenwart von 9 M Harnstoff und anschließender gelchromatographischer Auftrennung es sich bei den beiden erhaltenen Proteinen um Annexin A2m und S100A10 handelte. Dies wurde durch Größenabschätzung mittels SDS-PAGE Analyse bestätigt. Die Bande im SDS-Gel des Annexin A2m entsprach der oberen Bande von Annexin A2t bei ca. 36 kDa und die des S100A10 der unteren Bande bei ca. 10 kDa. Die Renaturierung der Proteine erfolgte durch Dialyse, um Harnstoff aus der Proteinlösung zu entfernen. Dadurch sollten sich die durch Harnstoff teilweise

zerstörten nicht-kovalenten Wechselwirkungen der Proteine wieder ausbilden und so die native Konformation des Proteins wiederhergestellt werden.

Gerke und Weber⁵⁶ bestätigten, dass nach Trennung der beiden Untereinheiten von Annexin A2t unter denaturierenden Bedingungen die Proteine unter den oben genannten Bedingungen wieder renaturiert werden können und in ihrer aktiven Form vorliegen.

Sie konnten mittels Gelfiltration zeigen, dass S100A10 in denaturiertem Zustand als monomeres 10 kDa-Protein vorlag, sich nach Renaturierung jedoch wieder das nativ vorliegende S100A10-Dimer mit 20 kDa bildete. Nach einstündiger Inkubation der beiden Untereinheiten in äquimolarem Verhältnis, zeigten sie mittels analytischer Gelfiltration, dass sich wieder ein aktiver ca. 90 kDa-Heterotetramerkomplex gebildet hatte.⁵⁶ Bei einige Studien, welche sich mit Annexin A2t beschäftigten, wurde der Heterotetramerkomplex nicht direkt isoliert, sondern Annexin A2m und S100A10 getrennt voneinander rekombinant aus Hefezellen oder Bakterien gewonnen. Nach Inkubation der beiden Proteine lagerten sie sich zu dem Heterotetramerkomplex zusammen.^110,111

Die Fähigkeit der beiden isolierten Untereinheiten, einen aktiven Heterotetramerkomplex zu bilden, wurde in dieser Arbeit mittels eines Vesikelpellettierungsassays überprüft. Da S100A10 nicht ohne Annexin A2m signifikant an Membranen bindet, kann angenommen werden, dass S100A10 mit Annexin A2m wechselwirkt und somit über Annexin A2m an die Membranen gebunden hatte. Da die Membranbindungseigenschaft der beiden Proteine nach Inkubation dem Bindungsverhalten von Annexin A2t entsprach, wurde davon ausgegangen, dass Annexin A2m und S100A10 vollständig renaturiert wurden und sich wieder zu einem aktiven heterotetrameren Komplex zusammenlagerten.

4.2 Modelle zur Auswertung der Bindungskinetik von Teilchen an