Expression und Aufreinigung von Annexin A1 n-ac aus E.coli

Annexin A1n-ac wurde, wie in 3.3.4 beschrieben, nach einer Vorschrift von Rosengarth et al.⁷⁸ in Ca²⁺-kompetenten E.coli Bakterien (BL21(DE3)pLysS) mit Plasmid-DNA (pKK 233-3-Vektor mit Schweine-Annexin A1-Insert) exprimiert und in Ca²⁺-freiem Milieu aufgereinigt. Die Proteinexpression und die Aufreinigung wurden durch SDS-PAGE Analyse dokumentiert (Abbildung 21). Die Bakterien wurden in der späten exponentiellen Wachstumsphase durch Zugabe von 1 mM IPTG zur Expression des Proteins induziert. Die Expression wurde durch SDS-PAGE Analyse des Bakterienproteinextraktes kontrolliert. Im Vergleich zu nicht-induzierten Bakterien (Spur 2) war die starke Expression von Annexin A1n-ac drei Stunden nach der Induktion als zusätzliche Bande bei ca. 36 kDa zu erkennen (Spur 3). Nach vier Stunden Expression wurden die Bakterien einer 1 Liter-Kultur geerntet, in 30 ml EGTA-haltigem Lysispuffer durch mehrmaliges Einfrieren und Auftauen sowie durch Sonifizierung aufgeschlossen und die unlöslichen Bestandteile abzentrifugiert. In Gegenwart von EGTA löste sich Annexin A1n-ac von den Membranen ab und befand sich im Überstand (Spur 5).

Abbildung 21: SDS-Gel der Expression und der Aufreinigung von Annexin A1n-ac in E.coli.

Spur 1: Molekulargewichtsmarker mit Proteinen der angegebenen Massen. Spur 2:

Bakterienproteinextrakt vor der Induktion. Spur 3: Bakterienproteinextrakt 3 Stunden nach der Induktion mit IPTG. Spur 4: Probe nach dem Zellaufschluss. Spur 5: Überstand nach der Zentrifugation. Spur 6: Durchlauf der Q-Sepharose-Säule nach Spülen mit Puffer Q. Spur 7:

Durchlauf der Q-Sepharose-Säule beim Spülen mit Puffer Q + 50 mM NaCl. Spur 8-11:

Elutionsfraktionen der MonoS-Säule: Spur 8: Fraktion 42, Spur 9: Fraktion 54, Spur 10: Fraktion 60, Spur 11: Fraktion 82. Es wurden jeweils 15 µl der Proben zusammen mit 5 µl Probenpuffer (6x) auf das Gel aufgetragen.

Die Proteinlösung wurde durch Dialyse entsalzt und über eine Q-Sepharose-Säule mit einem Matrixvolumen von 40 ml chromatographisch vorgereinigt. Annexin A1n-ac

befand sich in relevanten Mengen in den ersten (80-90) ml des Durchlaufs nach Spülen mit Puffer Q (Spur 6) und in den ersten 40 ml der Waschfraktionen nach Spülen mit Puffer Q + 50 mM NaCl (Spur 7). Aus dem SDS-Gel konnte abgeschätzt werden, dass Annexin A1 zu diesem Zeitpunkt in einer Reinheit von über 90 % vorlag. Zur weiteren Aufreinigung wurden die Annexin A1n-ac-haltigen Fraktionen, deren Gesamtvolumen (120-130) ml betrug, vereinigt und der pH-Wert der Proteinlösung durch Dialyse auf pH 5.9 (Puffer M1) eingestellt.

Die weitere Aufreinigung von Annexin A1n-ac erfolgte bei 4 °C an einem FPLC-System.

Das bei pH 5.9 positiv geladene Annexin A1n-ac (pI = 6.4) wurde mittels eines Injektionssystems auf eine MonoS-Säule aufgetragen und mit einem linearen NaCl-Gradienten zwischen 10 und 500 mM eluiert. Proteinhaltige Fraktionen wurden durch Absorptionsmessung bei 280 nm detektiert. Abbildung 22 zeigt den Verlauf des linearen NaCl-Gradienten (schwarze Linie), der durch Leitfähigkeitsmessung bestimmt wurde, und der Absorption (graue Kurve) während der Proteinelution der MonoS-Säule.

Das Profil zeigt neben kleineren Peaks einen Hauptpeak bei etwa (150-250) mM NaCl, der jedoch eine Schulter aufweist, was auf die Überlagerung zweier unterschiedlicher Peaks hinweist. Die SDS-PAGE Analyse einzelner Elutionsfraktionen der MonoS-Säule zeigte allerdings, dass sich nicht nur in den Fraktionen 50 bis 68 des Hauptpeaks, sondern auch in den Fraktionen der Nebenpeaks von Fraktion 40 bis 85 Annexin A1n-ac

befand und keine weiteren Banden zu erkennen waren (SDS-Gel, Spuren 8 bis 11). Die Fraktionen des Hauptpeaks und die der Nebenpeaks wurden getrennt voneinander vereinigt. Um die Einheitlichkeit des Proteins zu gewährleisten wurden für die Untersuchungen mit Annexin A1n-ac nur Fraktionen aus dem Hauptpeak verwendet. Aus einem Liter Bakterienkultur wurden insgesamt 35 mg Annexin A1n-ac isoliert.

Abbildung 22: Verlauf der Absorption bei 280 nm (E280) (graue Kurve) bei der Aufreinigung von Annexin A1 über eine MonoS-Säule mit einem linearen NaCl-Gradienten zwischen c(NaCl) = 10 mM (Puffer M1) und 500 mM (Puffer M2). Die NaCl-Konzentration wurde durch Leitfähigkeitsmessung verfolgt (schwarze Linie). Bei einer Konzentration von 400 mM NaCl wurde die Konzentration direkt auf 500 mM erhöht, da die Proteinelution abgeschlossen war. Die Fraktionen 40 bis 85 enthielten Annexin A1n-ac.

Nachweis von Annexin A1n-ac

Das aus E.coli Bakterien aufgereinigte Annexin A1n-ac wurde mittels Western-Blot Analyse, wie in 3.3.10 beschrieben, nachgewiesen.

Abbildung 23: Western-Blot Analyse von Annexin A1n-ac aus E.coli. Der Größenstandard wurde durch reversible Anfärbung eines Molekulargewichtsmarkers mit Proteinen der angegebenen Massen mit PonceauS auf der Nitrozellulose erhalten.

Hierzu wurde Annexin A1n-ac in einem SDS-Gel elektrophoretisch aufgetrennt, im elektrischen Feld auf eine Nitrozellulosemembran übertragen und mit einem polyklonalen anti-Annexin A1 Antikörper (mAB Anx A1, R281.13) inkubiert. Dieser Antikörper erkennt spezifisch die Kerndomäne von Annexin A1.

Die deutliche Bande bei ca. 36 kDa nach der Western-Blot Analyse zeigt, dass es sich bei dem aufgereinigten Protein um Annexin A1 handelt (Abbildung 23).

Zusätzlich zu den SDS-PAGE und Western-Blot Analysen wurde eine massenspektrometrische Analyse zur Charakterisierung des Proteins durchgeführt.

Hierzu wurde die Elektrosprayionisations (ESI)-Massenspektrometrie verwendet.^*

Abbildung 24: ESI-Massenspektrum von Annexin A1n-ac aus E.coli.

Das Spektrum zeigt einen Hauptpeak bei einen m/z-Verhältnis von 38613 g/mol mit zusätzlichen Peaks analog der entsprechenden Isotopenverteilung (Abbildung 24).

Dieser Wert stimmt mit der aus der Aminosäurezusammensetzung berechneten mittleren molaren Masse M = 38613 g/mol¹⁰⁷ für Annexin A1n-ac überein.

Zur weiteren Kontrolle wurde eine Sequenzierung der N-terminalen Aminosäuren mittels Edman-Abbau durchgeführt.^* Die Sequenz der untersuchten Aminosäuren stimmte mit der aus der Literatur bekannten Sequenz⁷¹ der Aminosäuren 2 bis 10 (AMVSEFLKQ) von porcinem Annexin A1 überein.

* Die ESI-MS-Analysen und die Sequenzierungen wurden von E. Hochmuth und Prof. Dr. R. Deutzmann, Institut für Biochemie, Genetik und Molekularbiologie, Universität Regensburg, durchgeführt.

Untersuchung der Aktivität von Annexin A1n-ac durch Ca²⁺-abhängige Bindung an Membranen

Um seine Funktionalität nachzuweisen, wurde das aus E.coli isolierte Annexin A1n-ac

auf seine Fähigkeit untersucht, calciumabhängig an Membranen zu binden. Diese Wechselwirkung kann mittels eines einfachen Vesikelassays analysiert werden, bei dem das zu untersuchende Protein mit Vesikeln in Gegenwart von Ca²⁺-Ionen pelletiert und anschließend durch die Zugabe von EGTA wieder von den Membranen abgelöst wird.

Abbildung 25: SDS-Gel eines Vesikelpelletierungsassays von Annexin A1n-ac aus E.coli mit POPC- oder POPC/POPS (4:1)-Vesikeln in An- und Abwesenheit von Ca²⁺-Ionen. Ca/EGTA:

Inkubation erfolgte in Puffer Ca1 oder in Puffer E1. Ü: Überstand der zentrifugierten Ansätze. W:

Überstand nach Waschschritt. P1: Überstand nach Inkubation des Pellets mit EGTA. P2: Pellet nach Inkubation mit EGTA. PC: Inkubation mit POPC-Vesikeln in Puffer Ca1.

Es wurden 4 µg Annexin A1n-ac zusammen mit 125 µg multilamellaren POPC- oder POPC/POPS (4:1)-Vesikeln in 160 µl Puffer Ca1 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und die Vesikel anschließend pelletiert. Das Waschen des Pellets mit 15 µl Ca²⁺-haltigem Puffer Ca10 sollte unspezifisch pelletiertes Protein entfernen. Das Pellet wurde anschließend mit 15 µl EGTA-haltigem Puffer E10 20 Minuten inkubiert, um das Protein von den Membranen abzulösen. Nach erneuter Zentrifugation wurde die Anwesenheit des Proteins im Überstand nach der ersten Zentrifugation (ÜCa), im Waschüberstand (WCa), im Überstand nach Inkubation mit EGTA-haltigem Puffer (PCa1) und im Vesikelpellet (PCa2) mittels SDS-PAGE Analyse untersucht.

Abbildung 25 zeigt, dass Annexin A1n-ac nahezu vollständig mit POPC/POPS (4:1)- Vesikeln pelletiert wurde, da nahezu kein Protein mehr im Überstand (ÜCa) nachgewiesen werden konnte. Auch im Waschüberstand (WCa) konnte nur eine geringe Menge Protein detektiert werden. Erst nach Inkubation der Vesikel mit EGTA-haltigem Puffer löste sich Annexin A1n-ac von den Membranen ab und konnte nach erneuter Zentrifugation der Vesikel im Überstand (PCa1) nachgewiesen werden. Die Analyse des Vesikelpellets nach Proteinablösung mit EGTA (PCa2) zeigt jedoch, dass ein Teil des Proteins auch in Abwesenheit von Ca²⁺ an den Membranen gebunden blieb.

Bei der Verwendung von reinen POPC-Vesikeln blieb Annexin A1n-ac in Gegenwart von 1 mM Ca²⁺-Ionen im Überstand (ÜPC). Nach einem Waschschritt mit Puffer Ca10

und nach Inkubation des Pellets mit EGTA (Puffer E10) wurde kein Annexin A1n-ac in

den Überständen detektiert (Daten nicht gezeigt). Die SDS-PAGE Analyse des Vesikelpellets zeigt jedoch, dass eine geringe Menge an Annexin A1n-ac an POPC-Vesikel gebunden hatte (PPC2). Somit konnte bestätigt werden, dass Annexin A1n-ac nur an negativ geladene Phospholipide bindet.

Zur Kontrolle wurde ein entsprechender Ansatz in 1 mM EGTA-haltigem Puffer E1 mit POPC/POPS (4:1)-Vesikeln durchgeführt. Die SDS-PAGE Analyse zeigt, dass Annexin A1n-ac im Überstand (ÜEGTA) blieb, und im Waschüberstand (WEGTA) und im Überstand nach weiterer EGTA-Inkubation (PEGTA1) kein Annexin A1n-ac detektiert werden konnte. Auch die SDS-PAGE Analyse des Vesikelpellets (PEGTA2) wies nur eine sehr schwache Bande bei 36 kDa auf, wodurch die Ca²⁺-abhängigkeit der Bindung bestätigt werden konnte. Außerdem konnte Annexin A1n-ac, in Abwesenheit von Vesikeln, nicht pelletiert werden (Daten nicht gezeigt). Auf diese Weise wurde die Funktionalität des aus E.coli isolierten Annexin A1n-ac durch seine Ca²⁺-abhängige Bindung an negativ geladene Phospholipide nachgewiesen.