MMP- und TIMP-Expression in kaninen Gehirnzellpopulationen

Ein Ziel der Untersuchungen war die Erstellung eines MMP-Expressionsmusters in kaninen, glialen Zellkulturen. Auf Transkriptionsebene wurden MMP-2, -9, -12, -13, und -14 sowie die Inhibitoren der MMPs TIMP-1 und TIMP-2 nachgewiesen. Diese Beobachtungen sind weitgehend in Übereinstimmung mit den MMP-Expressionen in Gliakulturen von Mensch, Maus und Ratte (MUIR et al., 2002; ROSENBERG et al., 2002; LIUZZI et al., 2004).

Neben der Transkription wurde eine proteolytische Aktivität der Zymogene MMP-2, MMP-9 und MMP-12 sowie einer nicht identifizierten Protease bei 55-60kDa nachgewiesen. Eine Aktivität der aktiven Formen von MMP-2 und MMP-9 fand sich in den nicht-infizierten Kulturen mit einer Ausnahme nicht. Dies ist in Übereinstimmung mit zahlreichen in vitro Studien, die eine konstitutive Expression der Proenzyme der Gelatinasen, nicht jedoch der aktiven Formen zeigten (GOTTSCHALL und YU, 1995; LIUZZI et al., 2004). Die Identifizierung der MMPs erfolgte im Western-Blot. Hier wurden MMP-9, -12 und MMP-13 nachgewiesen.

In der vorliegenden Arbeit wurde bis 96 Std nach der Isolierung zu drei verschiedenen Zeitpunkten eine konstante Expression von MMP-2, MMP-12, MMP-13, MMP-14 und TIMP-1 beobachtet. Lediglich MMP-9 in den Mischkulturen und TIMP-2 in den Mikroglia/Makrophagen-Kulturen wiesen starke Schwankungen im Kulturverlauf in der Expression auf. Daraus ist zu schließen, dass die Kulturdauer keinen Einfluss auf die Expression der meisten MMPs hatte. Einflüsse der Kulturdauer auf die MMP-Expression sind in glialen Zellen wenig beschrieben.

Um Effekte einer möglichen Stimulierung zu interpretieren, ist es jedoch wichtig, die Basisexpression zu verschiedenen Zeitpunkten zu kennen.

5.4.1 Vergleich der MMP-und TIMP-Expression der Mischkulturen (Gruppe A) und der Mikroglia/Makrophagen-Kulturen (Gruppe B) Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigten, dass die Mischkulturen (Gruppe A) mit und ohne Mikroglia/Makrophagen eine geringere MMP-Expression aufwiesen, als die gereinigten Mikroglia/Makrophagen-Kulturen (Gruppe B).

In den Kulturen der Gruppe A waren MMP-14 und MMP-12 hoch exprimiert, während 2 und TIMP-2 eine mittlere Expression zeigten, und 9, MMP-13 und TIMP-1 niedrig exprimiert waren.

Dieses Expressionsmuster weist Ähnlichkeiten mit dem Expressionsmuster in neonatalen und adulten Astrozytenkulturen sowie Oligodendrozytenkulturen auf. In vitro wurde in Astrozytenkulturen vornehmlich eine konstitutive Expression von MMP-2 beschrieben, während MMP-9 induzierbar war (CROSS und WOODROOFE, 1999). LARSEN und YONG (2004) zeigten, dass Oligodendrozytenvorläufer vornehmlich MMP-12 exprimierten und dass MMP-12 neben MMP-9 eine wichtige Rolle in der Ausdifferenzierung zur reifen O1-positiven Zelle besaß.

Möglicherweise sind die A2B5-positiven Zellen eine Quelle der MMP-12-Expression. Es ist zu bedenken, dass auch die Gruppe B (Mikroglia/Makrophagen) MMP-12 exprimierte. Da jedoch die Gruppe A ohne Mikroglia/Makrophagen eine höhere MMP-12 Expression aufwies, als die Gruppe A mit Mikroglia/Makrophagen, schienen auch andere Zellen MMP-12 zu exprimieren.

Die Kulturen der Gruppe Bohne exprimierten signifikant mehr MMP-9, MMP-12, und MMP-14 als die Kulturen der Gruppe A. Diese Beobachtungen sind ähnlich den Angaben in der Literatur. Sowohl in vitro als auch in vivo werden Mikroglia/Makrophagen als die Hauptquelle der MMP-9 und MMP-12 (Makrophagen-Elastase) Synthese beschrieben. Dies gilt insbesondere nach Aufregulierung bei neuroinflammatorischen Prozessen (GOTTSCHALL et al., 1995;

VOS et al., 2003; TOFT-HANSEN et al., 2004).

Bezüglich der Expression von MMP-2, MMP-13, TIMP-1 und TIMP-2 waren keine signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Gruppen vorhanden. Dies ist in Übereinstimmung mit der Literatur. So wird eine konstitutive MMP-2-Expression sowohl von Astrozyten als auch von Mikroglia, Makrophagen, Neuronen und Gefäßendothelzellen beschrieben (APODACA et al., 1990; GOTTSCHALL und YU, 1995; HUMMEL et al., 2000; VECIL et al., 2000).

Innerhalb der Gruppe A (Mischkulturen mit und ohne Mikroglia/Makrophagen) wurden keine signifikanten Unterschiede beobachtet. Dies liegt vermutlich daran, dass der Anteil der Mikroglia/Makrophagen in Gruppe A nur 14% ausmachte, und die Kulturen ansonsten gleicher Herkunft waren.

In den Zellkulturüberständen der Mischkulturen und der Mikroglia/Makrophagenkulturen fanden sich die Gelatinasen MMP-2 und pro-MMP-9. Hier ist aber zu beachten, dass die proteolytische Aktivität der beiden Gelatinasen nicht 1:1 ins Verhältnis zur Proteinmenge gesetzt werden kann, sondern dass MMP-9 eine bis zu 25fache gelatinolytische Aktivität von MMP-2 aufweist (LEPPERT et al., 1995). In der Literatur wird in gereinigten Astrozytenkulturen vorwiegend eine konstitutive gelatinolytische Aktivität von pro-MMP-2 beschrieben (GOTTSCHALL und YU, 1995; LIUZZI et al. 1999). Bei den Kulturen der vorliegenden Arbeit handelte es sich um Mischkulturen, so dass einer erhöhten konstitutiven gelatinolytischen Aktivität von pro-MMP-9 vermutlich eine Expression der anderen glialen Zellen wie Mikroglia, Makrophagen und den A2B5-positiven Zellen zugrunde liegt (CROSS und WOODROOFE, 1999; LARSEN und YONG, 2004). Die Mikroglia/Makrophagen-Kulturen hingegen wiesen eine deutliche gelatinolytische Aktivität von pro-MMP-9 auf, während pro-MMP-2 nicht

gleichmäßig exprimiert war. Dieses Muster der vorherrschenden gelatinolytischen Aktivität von pro-MMP-9 in Mikrogliakulturen bechrieben auch GOTTSCHALL und YU (1995) und CROSS und WOODROOFE (1999).

5.4.2 Vergleich der MMP- und TIMP-Expression der Mikroglia/Makrophagen (Gruppe B) unter verschiedenen Kulturbedingungen

Ein weiteres Ziel bestand darin, den Einfluß von konditioniertem Medium auf die MMP-Expression zu untersuchen. Hierzu wurden zwei Systeme verwendet. Ein Teil der Kulturen der Gruppe B wurde nur mit Sato’s Medium kultiviert (Gruppe Bohne) ein Teil mit präkonditioniertem Medium (Gruppe BKond) und ein weiterer Teil im Transwellsystem (Gruppe BKokultur) mit Mischkulturen ohne Mikroglia/Makrohagen.

Die Expression von MMP-2 und TIMP-2 war unter den verschiedenen Kulturbedingungen konstitutiv und nicht auf/abreguliert. Diese Beobachtung ist in Übereinstimmung mit der verbreiteten Annahme, dass MMP-2 vorwiegend konstitutiv exprimiert wird (MATRISIAN, 1994). VECIL et al. (2000) stellten in Astrozyten/Neuronenkokulturen ebenfalls eine konstitutive Expression von MMP-2 fest.

MMP-9 war in der Gruppe BKokultur signifikant höher exprimiert als in der Gruppe Bohne. Einflüsse der Kulturbedingungen auf die MMP-Expression sind nur wenig untersucht. Einen Einfluß auf die MMP-9 Expression wiesen MASSENGALE et al.

(2002) nach. Demnach beeinflußt die Kohlenhydratquelle im Medium die Stimulierbarkeit der Zellen.

Einflüsse einer Kokultur von Zellen auf die MMP-Expression sind in Mäusefibroblastenkulturen in Kokultur mit epithelialen TumorzeIlen untersucht worden. In einer Studie wurde wie im vorliegenden Versuch eine Kokultur von Zellen im Transwell-System untersucht, bei der kein zellulärer Kontakt möglich war, sondern die Zellpopulationen sich das Medium und damit die löslichen Substanzen teilten (SELVERY et al., 2004). Sie fanden keinen Einfluß auf die Expression von MMP-14 und MMP-11.

Gegensätzliche Beobachtungen machten POLETTE et al. (1997). In der Arbeit wurde in Fibroblastenkulturen eine erhöhte Expression von MMP-14 durch präkonditioniertes Medium von invasiven Tumorzellen nachgewiesen.

Im vorliegenden Versuch war zwischen den Gruppen Bohne und BKond ein stimulierender Einfluß des präkonditionierten Mediums nur bei der Expression von TIMP-1 feststellbar. TIMP-1 wurde wahrscheinlich durch im präkonditionierten Medium Substanzen signifikant aufreguliert.

SURYADEVARA et al. (2003) wiesen nach, dass TIMP-1 durch IL-1ß induzierbar war. Inwieweit nun das Vorkommen von IL-1ß in dem präkonditionierten Medium zu einer Aufregulierung führt, bleibt spekulativ. In der Literatur wurde beschrieben, dass Astrozyten-Kulturen insbesondere nach Stimulierung eine IL-1ß Produktion aufweisen (ANDERSON et al., 2005).

Die Gruppen Bohne und BKond zeigten eine signifikant höhere Expression von MMP-12 und MMP-14 als die Gruppe B Kokultur. Diese Unterschiede sind möglicherweise auf suboptimale Kulturbedingungen zurückzuführen. Es ist bekannt, dass Mikroglia/Makrophagen eine selektive Plastikadhärenz besitzen (GIULIAN und BAKER, 1986). Möglicherweise bot der poröse Polykarbonateinsatz den Mikroglia/Makrophagen im Transwellsystem, im Vergleich zu dem Plastikboden in der Gruppe BKond und Bohneschlechte Adhäsionsmöglichkeiten. Dies könnte zu einer Herabregulierung von MMP-12 und MMP-14 geführt haben.

Die Gruppen BKokultur und BKond nicht jedoch die Gruppe Bohne wiesen eine signifikant höhere MMP-9-Expression auf, als die Gruppe AKokultur.Dies könnte auf eine Aufregulierung von MMP-9 unter Einfluß des konditionierten Mediums hinweisen.

Eine Induktion der MMP-9-Expression ist unter Einfluß verschiedener Zytokine und anderer proinflammatorischer Substanzen gezeigt worden (GOTTSCHALL et al., 1995; CROSS und WOODROOFE 1999; LIUZZI et al., 2004). Auf die anderen MMPs schien weniger das konditionierte Medium, und damit die von den Mischkulturen sezernierten löslichen Substanzen Einfluß auf die MMP-Expression zu haben, als die Adhäsionsbedingungen.

Aus diesen Untersuchungen lässt sich schlussfolgern, dass das konditionierte Medium der Mischkulturen lediglich auf die TIMP-1-Expression einen stimulierenden Einfluß besaß. Außerdem boten die Einsätze des Transwellsystems den Mikroglia/Makrophagen vermutlich suboptimale Wachstumsbedingungen, was zu einer Herabregulierung der MMP-12 und MMP-14 Aktivität führte.

5.5 Zelltropismus des Staupevirus und zytopathogener