Schlußfolgerung 95

Die Ergebnisse der Viabilitätstests von A. Gosslau und K. L. Tsai et al. und des Apoptosetests von E. Zeise zeigen, daß die Dosis von 100 µM H2O2 innerhalb von 24 h zu einer Sterberate von 10 % der C6-Glioma-Zellpopulation führt. Die Sterberate erhöht sich mit der H2O2-Dosis.

Bei einer Dosis von 500 µM H₂O₂ für 24 h liegt die Sterberate bei 35 - 40 % der Zellen. Bei dieser Dosis wurde Apoptose nachgewiesen [GOSA98, TSAK97, ZEIE99].

Im untersuchten Konzentrationsbereich von 100, 250 und 500 µM H2O2 findet folglich ein Übergang von reversiblen zu irreversiblen Änderungen des Zustands der C6-Glioma-Zellen statt.

Die Störungen der transmembranen Ionenkonzentrationsgradienten von Na⁺, K⁺, und dem pHi

sind bereits bei 100µM H2O2 deutlich ausgeprägt. Diese H2O2-Dosis führt aber noch nicht zu irreversiblen Schädigungen. Dieser Befund wird durch die fortschreitende Proliferation der C6-Glioma-Zellen nach 100 µM H₂O₂ bei Experimenten mit konfokaler Laser Scanning Mikroskopie bestätigt.

Die irreversible Ansäuerung des pHi nach der Inkubation mit 250 µM H2O2 deutet auf die anhaltende Störung des Energiemetabolismus hin. Die Ergebnisse der Messungen des pHi

stehen im Einklang mit den Ergebnissen von K. L. Tsai et al. Die Interpretation der experimentellen Befunde ergaben aber, daß die Ansäuerung des pHi ebenso wie die Störungen der [Na⁺]i und [K⁺]i auf die eingeschränkte Aktivität der primären Ionentransportsysteme zurückzuführen sind.

Die Zellen passen ihren Metabolismus an den erhöhten Bedarf der Glutathionreduktase an NADPH an, wodurch die Glykolyserate verringert wird (vgl. Abb. 4.1.1 und 4.2.5). Der Zitronensäurezyklus in den Mitochondrien wird deshalb durch Substratmangel gehemmt, was zur Depolarisation des mitochondrialen Membranpotentials (∆ΨM) führt und wodurch die ATP-Syntheserate fällt. Folglich sinkt die Freie Enthalpie des ATP/ADP-Konzentrationsverhältnisses auf einen niedrigeren Wert. Sie ist ein Maß für die Fähigkeit der Zelle sämtliche Regulationsmechanismen aufrechtzuerhalten. Deshalb wurde anhand der simultanen Messung des ∆ΨM und der intrazellulären Konzentration des Botenstoffs Ca²⁺

untersucht, ab welchem Grad die Schädigungen in den C6-Glioma-Zellen irreversibel sind.

DISKUSSION

96

C6-Glioma-Zellen reagieren mit einer dosisabhängigen Erhöhung der [Ca²⁺]i auf oxidativen Streß. Das mitochondriale Membranpotential (∆ΨM) wird bei den geringeren H2O2-Dosen hyperpolarisiert, 500 µM H₂O₂ führen in einer Vielzahl der Zellen nach einer kurzen Hyperpolarisation zur Depolarisation des ∆ΨM.

Die anhaltend erhöhte [Ca²⁺]i korreliert dabei häufig mit der Depolarisation des ∆ΨM aller Mitochondrien in der betroffenen Zelle. Diese Zellen sterben dann innerhalb der ersten 4h nach 30minütigem oxidativem Streß mit 500 µM H₂O₂ durch Onkose. Andere Zellen derselben Population zeigen eine anhaltend erhöhte [Ca²⁺]_i, ohne daß das ∆ΨM aller Mitochondrien depolarisiert wird. Ein kleiner Teil der mit 500 µM H2O2 für 30 min inkubierten Zellen zeigt keine erhöhte [Ca²⁺]_i. Die Voraussetzung für die regulierte Form des Zelltodes, die Apoptose, ist eine minimale Freie Enthalpie des ATP/ADP-Konzentrationsverhältnisses. Diese Voraussetzung wird durch intakte Mitochondrien gewährleistet.

Der stabile Zustand der C6-Glioma-Zellen nach der Inkubation mit 250 und 100 µM H2O2

bezüglich des ∆ΨM und der [Ca²⁺]i deutet auf eine scharfe Abstufung zwischen Überleben- und apoptoseauslösender H₂O₂-Dosis in C6-Glioma-Zellen hin. 500 µM H₂O₂ verursachen bereits nicht nur die irreversible regulierte Form des Zelltodes, die Apoptose, sondern auch Onkose.

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SIGNALKASKADE BEI OXIDATIVEM STREß:[CA2+]I UND MITOCHONDRIEN 97

Um die intrazelluläre Signalkaskade bei oxidativem Streß mit derjenigen eines bekannten Induktors für Apoptose zu vergleichen, wurden die [Ca²⁺]i und das ∆ΨM während der Inkubation der Zellen mit Staurosporin untersucht. Bei der staurosporininduzierten Apoptose ist die Depolarisation der Mitochondrien nicht, wie es bei oxidativem Streß der Fall war, an die erhöhte [Ca²⁺]i gekoppelt. Obwohl eine lang anhaltende Erhöhung der [Ca²⁺]i die anhaltende Depolarisation des ∆ΨM über den Ein- und Austransport und über die Anreicherung von Ca²⁺ in der mitochondrialen Matrix fördert:

Die Depolarisation durch die Öffnung der mitochondrialen Pore mit kleinem Durchmesser (PTP) wird durch die schnelle Ca²⁺-Aufnahme in der Matrix gefördert.

Eine lang anhaltend erhöhte [Ca²⁺]i führt zur Anreicherung von Ca²⁺ in der mitochondrialen Matrix, wodurch die Entstehung der mitochondrialen Pore begünstigt wird [ICHF98]. Die PTP führt zur kurzfristigen Depolarisation des ∆ΨM,während die MTP zur anhaltenden Depolarisation und zur Freisetzung des „Apoptotic Inducing Factor“ und des apoptoseauslösenden Cytochrom c führt (s. Kap. 4.2.5).

Im Gegensatz zum Apoptoseinduktor Staurosporin, verursacht H2O2 nicht nur die Erhöhung der [Ca²⁺]i, sondern führt auch zur Verringerung der intrazellulären Freien Enthalpie des Konzentrationsverhältnisses von ATP/ADP. Bei gleichzeitiger Belastung der Mitochondrien durch reaktive Sauerstoffverbindungen, den enzymkatalysierten Abbau von H2O2 und der erhöhten [Ca²⁺]_i begünstigen mehrere Faktoren die Entstehung der mitochondrialen Pore.

Die mitochondriale Pore ist ein Ereignis in der zellulären Signalkaskade, das zu Apoptose führen kann. Verliert die Zelle aber vor oder während dem apoptotischen Prozeß die zur Fortführung notwendigen Energiereserven wird der apoptotische durch einen nekrotischen Prozeß fortgesetzt [NICP98].

ZUSAMMENFASSUNG

98

5 Zusammenfassung

Oxidativer Streß bewirkt dosisabhängige und zelltypspezifische Reaktionen in Gehirnzellen.

Ziel dieser Arbeit war es, die zelluläre Streßantwort von C6-Glioma-Zellen als Modellsystem für Astrozyten bezüglich der Ionentransporte mit Fluoreszenzspektroskopie und -mikroskopie zu untersuchen.

Durch die Konstruktion und Anwendung eines perfundierbaren Objektträgers konnten mehrstündige Experimente (bis zu 10 h) am konfokalen Laser Scanning Mikroskop mit C6-Glioma-Zellen durchgeführt werden, die unter weitestgehend physiologischen Bedingungen gehalten wurden. Trotz des invasiven Charakters der Meßmethode aufgrund der Inkubation mit Fluoreszenzfarbstoffen und der Bestrahlung mit Laserlicht proliferierten die Zellen im Objektträger unter Kontrollbedingungen.

Mit Hilfe von ionensensitiven Fluoreszenzsonden für die Fluoreszenzspektroskopie und -mikroskopie konnte nachgewiesen werden, daß Ionentransporte Teil von dosisabhängigen intrazellulären Signalkaskaden sind, die durch 30minütigen oxidativen Streß bei 100, 250 und 500 µM Wasserstoffperoxid (H₂O₂) ausgelöst werden.

Die fluoreszenzspektroskopischen Messungen der intrazellulären Kalium- und Natriumkonzentration haben gezeigt, daß geringe Dosen – 100 µM H₂O₂ für 15 min – zur sofortigen und deutlichen Störung des dynamischen Gleichgewichts der Verteilung dieser Ionen über der Plasmamembran von C6-Glioma-Zellen führen. Diese Störung wird durch die verringerte Aktivität der Na⁺/K⁺-ATPase hervorgerufen. H2O2 verursacht unter anderem eine Umstellung des intrazellulären Energiestoffwechsels, die dem Abbau von H2O2 dient, und beeinträchtigt damit die ATP-Synthese. Dadurch wird die Aktivität der primären Ionentransportsysteme herabgesetzt. Die gemessene Ansäuerung des Zytoplasmas um 0,3 ± 0,05 pH-Einheiten bei 100 µM ist weder auf eine gesteigerte Laktatproduktion noch auf eine direkte Beeinträchtigung der sekundären Transportsysteme, sondern auf den verringerten Protonenaustransport der H⁺-ATPase zurückzuführen.

Nach Viabilitätstests über 24 h überleben ca. 90 % der Zellen bei der niedrigsten Dosis von 100 µM H2O2 für 24 h. Bei der höchsten Dosis von 500 µM für 24 h sind es immer noch ca.

60 %. Bei 500 µM H₂O₂ wurde nach 24 h Apoptose in C6-Glioma-Zellen nachgewiesen.

Bei der niedrigsten H₂O₂-Dosis sind die Folgen von oxidativem Streß bezüglich der Ionentransporte reversibel. Werden die Zellen der mittleren H₂O₂-Dosis ausgesetzt, kommt es bereits zur irreversiblen Ansäuerung des Zytoplasmas um 0,6 ± 0,1 pH-Einheiten. Die hierbei auftretende Erhöhung der [Ca²⁺]i ist reversibel. 500 µM H2O2 für 30 min verursachen einen irreversiblen Anstieg der [Ca²⁺]_i durch Einstrom von Kalziumionen durch die Plasmamembran.

ZUSAMMENFASSUNG 99 Das Membranpotential der Mitochondrien wird bei der Inkubation mit H2O2 zunächst durch den Anstieg der [Ca²⁺]i und die Ansäuerung des pHi hyperpolarisiert. Nach dieser Hyperpola-risation konnte eine dosisabhängige Abnahme der Anzahl intakter Mitochondrien festgestellt werden. Eine anhaltend erhöhte [Ca²⁺]_i förderte dabei den Zusammenbruch des Membranpo-tentials der Mitochondrien auch noch mehrere Stunden nach der Inkubation mit H₂O₂. Die [Ca²⁺]_i bleibt regulierbar und die Plasmamembranintegrität kann aufrechterhalten werden, wenn ein Teil der Mitochondrien einer Zelle intakt bleibt. Die Depolarisation des Membran-potentials aller Mitochondrien einer Zelle führte hingegen zur unkontrollierten Erhöhung der [Ca²⁺]i und zu Onkose oder Nekrose.

Die simultanen Messungen der [Ca²⁺]i und des Zustands der Mitochondrien wurden durchgeführt, weil die [Ca²⁺]i neben Ca²⁺-Transportsystemen in der Plasmamembran und der Membran des Endoplasmatischen Retikulums auch durch die Mitochondrien reguliert wird.

Die Mitochondrien dienen dabei als vorübergehende [Ca²⁺]_i-Puffer. Sie enthalten außerdem zumindest zwei Auslöser für Apoptose, die bei der Depolarisation des Membranpotentials der Mitochondrien durch die sogenannte mitochondriale Pore freigesetzt werden.

Solange Mitochondrien in der Zelle intakt sind, können Reaktionen auf oxidativen Streß durch ATP angetrieben werden. Dazu zählt die Anpassung an die veränderten Bedingungen oder die Apoptose, bei der ein vorprogrammierter Prozeß zur unschädlichen Elimination der Zelle abläuft. Die Befunde zeigen, daß die Mitochondrien in der Signalkaskade, die durch oxidativen Streß in C6-Glioma-Zellen ausgelöst wird, eine Schlüsselrolle einnehmen.

ANHANG A 100

Anhang A

Eigene Meßergebnisse und Auszüge aus Veröffentlichungen, auf die in der Arbeit Bezug genommen wird

$I : Die Emissionsspektren von Fluo-4 und TMRM ermöglichen die simultane Messung des [Ca²⁺]i- und des ∆ΨM-sensitiven Signals aus einzelnen Zellen.

0.01 0 .1 1 10 1 00 10 00

500 550 600 65 0 700

W ellen län g e [nm ]

Fluoreszenzintensität [a.U.]

T (0,3µM ; 4 88n m ) T (0,3µM ; 5 43n m ) F (488 nm ) F (543 nm ) F T (488+ 543n m )

$II: Weder die Emissionsspektren von Fluo-4 noch diejenigen von TMRM werden durch die Zugabe von 1 mM H2O2 zum Zellysat nach 1 h beeinträchtigt:

0 5 10 15 20 25

525 545 565 585 605 625 645

Wellenlänge [nm]

Fluoreszenzintensität [a.U.]

TMRM 0,3µM TMRM + EGTA TMRM+1mM H2O2

0 20 40 60 80 100 120 140 160

560 570 580 590 600 610 620 630 640 650

Wellenlänge [nm]

Fluoreszenzintensität [a.U.]

TMRM

TMRM + H2O2

TMRM+EGTA

$EE $I 6LPXOWDQH 0HVVXQJPLW)OXR XQG 7050 LP

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ANHANG A 101

0 50 100 150 200 250

505 510 515 520 525 530 535 540 545 550

Wellenlänge[nm]

Fluoreszenzintensität [a.U.]

1mM H₂O₂

w/o H2O2

$EE $IIE, )OXR XQG +2 LQ =HOO\VDW 'LH )OXRUHV]HQ]LQWHQVLWlW YRQ )OXRQLPPWLQ*HJHQZDUW YRQ P0 +2LQQHUKDOE YRQKXPZHQLJHUDOV DE'HU(IIHNWYRQ+2DXI GHQ )OXRURSKRU LVW ZHVHQW OLFK JHULQJHU DOV GLH (UK|

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ANHANG A 102

$III: Die Eichkurve von BCECF in situ, gemessen am Spektrometer mit superfundierten C6-Glioma-Zellen, der pH wurde mit Nigericin equilibriert (Puffer, s. Eichpuffer für pHi -sensitive Fluoreszenzsonden, Anhang B).

2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5

5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5

pH

F(485nm)/F(440nm) [a.U.]

0 100 200 300 400 500 600 700

0 5 10 15 20

Zeit [min]

F(440nm) [a.U.]

A.IV: Zur Eichung von Fura-2 in superfundierten C6 im Fluoreszenzspektrometer: Wenn die [Ca²⁺]i von C6-Glioma- Zellen bei der Eichung von Fura-2 mit 10µM Ionomycin mit der [Ca²⁺]ex equilibriert wird kann der minimale Wert des Fluoreszenzintensitätsverhältnisses R (s. Kapitel 2.3.2) nicht bestimmt werden, weil der Farbstoff aus den daraufhin nekrotischen Zellen ausgewaschen wird. Der maximale Wert wird aber erst bei diesen Konzentrationen des Ionophors erreicht. Bleiben die Zellen zum Teil intakt, kann der minimale Wert von R über dem Anfangswert liegen (vgl. Kapitel 3.3). Deshalb sollte der minimale Wert am Spektrometer zuerst durch Zugabe von EGTA (minimiert auch die intrazelluläre [Ca²⁺]i, vgl.

Abb. 3.3.17) bestimmt werden. Mit der Reperfusion mit Ca²⁺-haltigem Puffer und Ionomycin läßt sich danach der maximale Wert des Intensitätsverhältnisses bestimmen.

5 6 7 8 9 10 11 12

0 20 40 60 80 100

Zeit [min]

F(340nm)/F(385nm) [a.U.]

Iono-mycin

1µM

Ionomycin 10µM

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$EE XQG YJO $EE

%LOG,

ANHANG A 103

A.V: [Ca²⁺]i bei der Zugabe von Staurosporin (zu Kapitel 4.2.2)

0 50 100 150 200 250 300

0 50 100 150 200

Zeit [min]

[Ca2+]i [nM]

4µM Staurosporin

A.VI: Mit längeren Scanzeiten wird das Signal/Rausch Verhältnis am LSM 410 wesentlich verbessert. Die Verlängerung der Aufnahmezeit („Belichtungsdauer“) macht die Kompartimentierung von SNARF-1 30min nach der Inkubation des Fluorophors sichtbar.

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ANHANG A 104

Axiale Auflösung als Funktion der Lochblende, LSM 410

0 1 2

0 10 20 30 40 50 60

Lochblende [a.U.]

dz [µm]

<1µm

A.VIII: Die Aufnahme von H2O2 kann durch die RSV-sensitive Fluoreszenzsonde H2DCFDA sichtbar gemacht werden. Für den Vergleich unterschiedlicher RSV-Dosen in verschiedenen Medien ließen sich die mit H₂DCFDA gemessenen Werte zu schlecht reproduzieren. Bei Versuchen zur fluorimetrischen Bestimmung der intrazellulären RSV-Konzentration muß außerdem beachtet werden, daß der Farbstoff schneller aus den Zellen austransportiert wird als alle in dieser Arbeit verwendeten ionensensitiven Fluorophore.

10 100 1000

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Zeit [min]

F(>570nm)

100µM H₂O₂

1mM H2O2

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6HPLQDSKWRUKRGDIOXRUHVFHLQ61$5)XQG%LVFDUER[\HWK\OXQG&DUER[\IOXRUHVFHLQ%&(&) ]X VHKHQ 'DV $EVRUSWLRQV XQG (PLVVLRQVVSHNWUXP GHV )OXRURSKRUV lQGHUW VLFK ² DXV GHPVHOEHQ *UXQG ZLH EHL %&(&) ² GXUFK GLH 3URWRQLHUXQJ E]Z 'HSURWRQLHUXQJ GHV 6DXHUVWRIIVDQGHU3KHQROJUXSSHURWHU3IHLO

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ANHANG A 105 In Kontrollexperimenten ließ sich die DCF-Fluoreszenz allein durch die häufige oder stärkere Bestrahlung der Probe ebenso stark wie durch die Inkubation der Zellen mit H2O2 erhöhen.

Dieses Experiment wurde deshalb unter Meßbedingungen durchgeführt, die erst nach mehr als einer Stunde zum Anstieg der DCF-Fluoreszenz in der Kontrolle führten: Die Zeitinterval-le zwischen den Messungen wurden auf fünf Minuten gesetzt. Die 40fache Vergrößerung, 256² Bildpunkte und 0,6 % der Laserintensität des Ar-Lasers mit 25 mW bei 488nm führen zu 1/40 der in den anderen Experimenten verwendeten Laserintensität pro Volumeneinheit.

A.IX: Die elektronenmikroskopischen Aufnahmen dokumentieren die Wirkung von H2O2 und t-BuOOH auf die Morphologie von Mitochondrien in Astrozyten und Glioma-Zellen.

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ANHANG A 106

A.X Die Membranpotentialsonden TMRM, TMRE und das häufiger verwendete Rhodamin 123: Die positive, am Stickstoffatom eingezeichnete Ladung sorgt für die Anreicherung im negativ geladenen Kompartiment und ist gleichzeitig delokalisiert. Dadurch sind die Fluorophore ausreichend membranpermeabel, um die Equilibrierung der Fluorophor-konzentration innerhalb von wenigen Minuten nach der Zugabe zum Medium zu ermöglichen (vgl. [LOEL93] und [PLAJ96]).

A.XI: Die Skalierungs-Index-Methode ermöglicht die Segmentierung des TMRM-Bildes.

Dadurch können die Regionen intakter Mitochondrien auf automatisiertem und reproduzierba-rem Wege identifiziert werden [HÄRS00]. Die für die Auswertung verwendeten Parameter Gesamtfläche, gesamte Intensität, durchschnittliche Intensität und Anzahl repräsentieren bei weitem nicht alle, aber wesentliche Eigenschaften der segmentierten Flächen.

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YRUKDQGHQ 'DV 7050*OHLFKJHZLFKW VWHOOW VLFK DP VFKQHOOVWHQ HQWVSUHFKHQG GHU 1HUQVWJOHL FKXQJ HLQ GDV YRQ 5KRGDPLQ DP ODQJVDPVWHQ 'HU 3DUWLWLRQVNRHIIL]LHQW YRQ 705( LVW JU|‰HU DOV YRQ 7050 DEHU NOHLQHU DOV GHU YRQ 5KRGDPLQ 8QWHUVFKLHG 7HWUD0HWK\O 5KRGDPLQ0HWK\OXQG(WK\OHVWHUEODXHU3IHLO>+$85&$56@

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$WPXQJVDNWLYLWlW GHU 0LWRFKRQ GULHQEHUHLWVEHHLQWUlFKWLJW'LH VLPXOWDQH $QZHQGXQJ YRQ 5KRGDPLQ XQG )OXR LVW QLFKW SUDNWLNDEHO ZHLO GLH (PLVVLRQVVSHNWUHQ ]X VWDUN

EHUODSSHQ

ANHANG A 107

A.XII: Diese Durchlichtaufnahmen sind am Ende der Experimente zur Optimierung der Bestrahlungsdauer gemacht worden.

A.XIII: K. Glunde hat mit Hilfe von ¹H-NMR und ¹³C-NMR an Perchlorsäure-Extrakten untersucht, ob Hepes in das Zytoplasma von Zellen aufgenommen wird. Die C6-Glioma-Zellen wurden 1 h in Hepes gepuffertem Medium gehalten und danach 2x mit Phosphat gepufferter, physiologischer Salzlösung abgespült, bevor die Extraktion der hydrophilen Bestandteile durchgeführt wurde (¹³C-NMR-Spektrum ist nicht abgebildet).

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3URJUDPPV YRQ 6 +lUWHO N|QQHQ YHUVFKLHGHQH $OJR ULWKPHQ ]XU %LOGVHJPHQWLH UXQJ DQJHZHQGHW ZHUGHQ

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$EE $XII 0RUSKRORJLVFKH 9HUlQGHUXQJGXUFK%HVWUDKOXQJ

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ANHANG A 108

(p p m)

0 .6 0 .8 1 .0 1 .2 1 .4 1 .6 1 .8 2 .0 2 .2 2 .4 2 .6 2 .8 3 .0 3 .2 3 .4 3 .6 3 .8 4 .0 4 .2

/D NWD W + ( 3(6

+ ( 3(6

( p p m )

2 . 1 2 . 2 2 . 3 2 . 4 2 . 5 2 . 6 2 . 7 2 . 8 2 . 9 3 . 0 3 . 1 3 . 2 3 . 3 3 . 4 3 . 5 3 . 6 3 . 7 3 . 8 3 . 9

A.XIV Die Schädigung der Zellen durch die Bestrahlung mit hoher Intensität bei konfokaler Laser Scanning Fluoreszenzmikroskopie

Ein Schwerpunkt dieser Arbeit liegt auf der Verbesserung der Meßbedingungen im Hinblick auf den Zustand der Zellen unter den experimentellen Kontrollbedingungen. In diesem Unterkapitel wird die Auswirkung der Bestrahlung der Zellen mit drei unterschiedlichen Scandauern untersucht.

Die Wirkung der Laser Scanning Mikroskopie auf Zellkulturen ist noch nicht systematisch untersucht worden. Stattdessen ist die kontinuierliche Bestrahlung der Zellen mit verschiede-nen Laserleistungen bereits durchgeführt worden. Mit diesem Ansatz wurde auch die Laserbestrahlung von Zellen mit eingefärbten Mitochondrien im Hinblick auf die photodyna-mische Therapie bei der Tumorbekämpfung in Betracht gezogen. Die gefärbten Mitochond-rien werden durch die Laserbestrahlung selektiv zerstört, wodurch Apoptose bei Knochenmark- und Blasenkrebszellen ausgelöst werden konnte [MINT99, SHEC90]. Zellen aus dem ZNS sind noch nicht auf diese Art untersucht worden.

Die Experimente dieser Arbeit werden deshalb in Bezug zur Bestrahlung von ungefärbten Astrozytenkulturen mit langwelligerem und nicht fokussiertem Laserlicht und der Anwen-dung von TMRM an einzelnen Mitochondrien verglichen [HÜSJ98, YEWD90].

Untersuchungen zur Wirkung von HeNe-Laserlicht auf Astrozyten wurden von D. T. Yew durchgeführt. Dazu wurden Astrozyten mit niedriger Laserleistung für drei unterschiedliche Zeitintervalle (5, 10 und 15min) bestrahlt. Die morphologischen Veränderungen wurden beim

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$

%

ANHANG A 109 Vergleich mit der Morphologie unbestrahlter Zellen und Zellen, die mit der 1400fachen Intensität für 15min bestrahlt wurden, festgestellt. Sie wurden mit Hilfe elektronenmikrosko-pischer Aufnahmen sichtbar (s. Tabelle A. XIV.1).

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3DUDPHWHUGHU=HOOHQ

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ZHQLJHNOHLQH FD±SUR=HOOH

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Bei der konfokalen Laser Scanning Fluoreszenzmikroskopie reicht die verfügbare Laserinten-sität in der Fokusebene aus, um alle Farbstoffmoleküle im beleuchteten Volumen während einer lang gewählten Bestrahlungsdauer t in den angeregten Zustand zu versetzen (s. Kapitel 2.4. und vgl. [PAWJ90]). Die Sättigung des angeregten Zustands ist umso wahrscheinlicher je größer der Extinktionskoeffizient (ε) des Farbstoffs ist. Die Laser am LSM 410 wurden bei allen Simultanmessungen des Zustands der Mitochondrien und der [Ca²⁺]i mit 0,03 mW bei 543 nm (HeNe-Laser) und 0,45 mW bei 488 nm (Ar-Laser) betrieben. Mit der 63fachen Vergrößerung und 512x512 Bildpunkten war die minimale Aufnahmedauer pro Bild 1 s. Die Bestrahlungsdauer pro Bildpunkt ist also t = 4 µs, die einem Bildpunkt zugeordnete Objektfläche ist 0,16 µm². Die Laserleistung I ist folglich 2,95x10⁵ W (Ar) und 1,97 x10⁴ W (HeNe) pro cm².

Der oben zitierten Dosis nach zehnminütiger Bestrahlung (Tabelle A.XIV.1) entspricht derjenigen nach der Aufnahme von 40 Bildern mit je 1 s Scandauer eingestrahlten Energie pro cm² und Zeit. Für die Experimente zur Scandauer wurden insgesamt 100 Bilder/Region in 5 min Intervallen aufgenommen (Abb. A.XIV.2-5).

Mit der Umrechnung des molaren Extinktionskoeffizienten in den Wirkungsquerschnitt pro Molekül σ =3,8x10^-17 cm² Molekül^-1 bei 543 nm (sinkt auf 16 % bei 488 nm) ergibt sich die Anregungsrate α = σI . Diese Anregungsrate wird unter der Annahme, daß die Übergangsrate in den Triplettzustand weniger als 10³ s^-1 und die Lebensdauer der Moleküle im Triplett-zustand länger als 4 µs ist, in Gleichung 2.4.8 eingesetzt ([PAWJ95] und Abb. A.XIV.1).

7DEHOOH$XIV'LHPRUSKRORJLVFKHQ9HUlQGHUXQJHQEHL/DVHUEHVWUDKOXQJPLWGHUQP +H1H /DVHU %HVRQGHUV DXIIlOOLJ LVW GD‰ GLH KRKH 'RVLV NHLQH $XVZLUNXQJHQ DXI GLH 0RUSKRORJLHGHU$VWUR]\WHQNXOWXULQQHUKDOEYRQKKDW><(:'@

ANHANG A 110

0 20 40 60 80 100

0 10 20 30 40 50 60

Scandauer [s]

Anteil an angeregtem TMRM [%]

10% HeNe

3% HeNe + 1,8%Ar

3% HeNe

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Bei einer Schichtdicke von d = 1 µ m einer Lösung mit [TMRM] = 10 mM nimmt die Intensität nach dem Lambert-Beerschen Gesetz

} ) ( ] [

0exp{ TMRM d

I

I = − ⋅ε λ ⋅ (Gl. A.XIV.1)

bei 543 nm um weniger als 10 % ab. Bevor das Licht auf die Mitochondrien trifft, wird es um weniger als 1 % abgeschwächt, weil die optische Dichte des Zytoplasmas nur ca. 1/1000 der optischen Dichte der Mitochondrien entspricht (Gl. 2.3.8).

Für die Optimierung der Messung bezüglich der Bestrahlungsdauer wurden die Scandauern 1 s, 4 s, und 16 s verglichen (vgl. Kapitel 2.4). Die Auswirkungen der längeren Bestrahlungs-dauern während der Meßzeit sind in Abb. A.XIV.2-5 zu sehen. Die Zellen, die der geringsten Bestrahlungsdauer ausgesetzt waren, weisen am wenigsten morphologische Veränderungen auf. Wie bei oxidativem Streß sind die Auswirkungen auf die einzelnen Zellen inhomogen.

Eine homogene Verringerung der Fluoreszenzintensität würde Ausbleichen des Farbstoffes bedeuten. Die inhomogenen Effekte sprechen für den Verlust der TMRM-Fluoreszenz durch die Depolarisation der Mitochondrien. Außerdem verringert sich die Fluoreszenz der Regionen mit intakten Mitochondrien diskontinuierlich (vgl. [HÜSJ98]).

Die Färbung der Mitochondrien und hohe Extinktion von TMRM birgt die Gefahr der selektiven Schädigung dieser Organellen allein durch die Messung. Die Auswertung des Mitochondrienzustands in der Zellpopulation mit Hilfe der Bildsegmentierung von S. Härtel verdeutlicht die Abnahme der intakten Mitochondrien mit der Scandauer (s. Abb. A.XIV.3-5, [HÄRS00]).

ANHANG A 111

$EE $XIV 'LH GHXWOLFKHQ PRUSKRORJLVFKHQ 9HUlQGHUXQJHQ LQ GHQ PLW XQWHUVFKLHGOLFKHQ 6FDQGDXHUQEHVWUDKOWHQ5HJLRQHQVLQGPLWGHP9HUOXVWYRQLQWDNWHQ0LWRFKRQGULHQYHUEXQGHQ

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$EE$XIV'LH%HVWUDKOXQJGHU=HOOHQPLWV6FDQGDXHUKDWLQQHUKDOEYRQNQDSSK QXU JHULQJH $XVZLUNXQJHQ EH]JOLFK GHU PLWWOHUHQ ,QWHQVLWlW )G XQG $Q]DKO 1 GHU LQWDNWHQ 0LWRFKRQGULHQUHJLRQHQ 'LH *HVDPWLQWHQVLWlW )J XQG IOlFKH $J ZHLVW JU|‰HUH 6FKZDQNXQJHQ DXI 'HU XQNRQWUROOLHUWH (LQVWURP YRQ &D GXUFK ,RQRP\FLQ EHZLUNW ]XQlFKVW GLH +\SHUSRODULVDWLRQ GHU PHLVWHQ 0LWRFKRQGULHQ %LOG ( XQG HLQH QDFKIROJHQGH 'HSRODULVDWLRQ OHW]WHU 0H‰ZHUW LQ GHU *UDILN 5HFKWV VLQG GLH D[LDOHQ 6FDQV ]X .RQWUROOH GHU /DJH GHU )RNXVHEHQHDEJHELOGHW

ANHANG A 112

Die Ursache für die Schädigung der Zellen wird insbesondere durch den Farbstoff verstärkt, wenn Fluorophore in den angeregten Triplettzustand übergehen (s. Abb. 2.4.3).

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ANHANG A 113 Die Lebensdauer des Fluorophors im Triplettzustand ist mehrere Größenordnungen länger als im angeregten Singulettzustand. Deshalb wird dessen Energie mit größerer Wahrscheinlich-keit auf molekularen Sauerstoff übertragen, so daß Superoxidanionen entstehen (s. Kapitel 2.4.1). Neben der Zerstörung von Fluorophoren und Objekt führt eine längere Scandauer wegen der Sättigung des angeregten Zustands nicht zur gewünschten Maximierung des Fluoreszenzsignals. Es ist also wesentlich günstiger häufig in kurzen Intervallen zu messen, als dieselbe Zeit für eine Aufnahme zu verwenden. Die gesamte Bestrahlungsdosis sollte so gering wie möglich gehalten werden.

A.XV Einfluß experimenteller Bedingungen bei oxidativem Streß

Beim Vergleich unterschiedlicher H2O2-Dosen muß sowohl die Konzentration als auch die Dauer der Exposition berücksichtigt werden. Desweiteren ist die Zelldichte und die Art des Mediums, in dem die Zellreaktion untersucht wird von Bedeutung.

Da H₂O₂ durch die eisenkatalysierte Harber-Weiss-Reaktion in kurzlebigere Produkte zerlegt wird, ist die Zusammensetzung des Mediums, in dem die Experimente durchgeführt werden, wichtig, um die Resultate vergleichen zu können. Die meisten Viabilitätstests werden an Zellen in Nährmedium mit den zu untersuchenden Zusätzen im Inkubator durchgeführt.

Messungen der Ionenkonzentrationen unter anderen Bedingungen sind dann nicht mit der gemessenen Überlebensrate vergleichbar. Da Eisen die Fenton-Reaktion katalysiert, ist das Vorhandensein von Eisen im Medium ein qualitativer Unterschied zu Medium ohne Eisen.

DMEM enthält 0,25 µM Fe²⁺- und Fe³⁺-Ionen, Tyrode enthält keine Eisenionen. In DMEM können also bereits mehr Hydroxylradikale gebildet werden als in Tyrode. Der schützende Effekt des Nährmediums gegenüber physiologischem Puffer kann deshalb auf die Reaktion der entstandenen Hydroxylradikale mit Lipiden und Proteinen des Nährmediums zurückge-führt werden. Es gibt aber auch essentielle Bestandteile im Nährmedium, die die Zellschädi-gung fördern können:

S. Robb und J. Connor aber auch K. Tsai et al. haben einen wesentlichen Einfluß der intrazellulären Konzentration von freien Eisenionen auf die Wirkung von oxidativem Streß festgestellt ([TSAK97, ROBS98] und vgl. Anhang A.IX). Im Serum, von dem 10 Vol% zum Nährmedium hinzugefügt wird, befinden sich Proteine, die die Fe³⁺-Aufnahme in die Zellen erst ermöglichen (Transferrin, bei Kulturen ohne Serumzusatz muß Transferrin als essentieller Bestandteil zugegeben werden). Das Serum im Medium hat folglich keinen rein protektiven Effekt bei oxidativem Streß.

Die einer bestimmten H2O2-Konzentration ausgesetzten Zellen können außerdem – je nach Inkubationsbedingungen mehr oder weniger – als H2O2-Senken aufgefaßt werden. Folglich muß bei der zugegebenen Konzentration die Zelldichte berücksichtigt werden. Bei den für diese Arbeit durchgeführten Experimenten am konfokalen Laser Scanning Mikroskop wurden 10³ Zellen in ca. 50 µ l Medium mit den entsprechenden H2O2-Konzentrationen behandelt (also 2x10⁴ pro ml). In konfluenten Zellkulturen ist die Zelldichte oft um 2 Größenordnungen

Im Dokument Ionentransporte in C6-Glioma-Zellen bei oxidativem Streß (Seite 101-133)