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Ionentransporte in C6-Glioma-Zellen bei oxidativem Streß

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vorgelegt von

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im Juni 2000 Dissertation

zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften

(Dr. rer. nat.)

dem Fachbereich 1 Physik /Elektrotechnik der Universität Bremen

(2)
(3)

A

BKÜRZUNGSVERZEICHNIS

ADP Adenindiphosphat

AMP Adeninmonophosphat

AM Acetoxymethylester Derivat (von Fluorophoren, membranpermeabel)

ATP Adenintriphosphat

ATPase ATP-Spaltendes Enzym

BAPTA 1,2-bis(2-Aminophenoxy)Ethan-N,N,N,N‘,N‘ tetra-Essigsäure (Ca2+-Chelator)

BCECF 2‘7‘-bis(2-carboxyethyl)-5-(und 6) carboxyfluoreszein [Ca2+]i intrazelluläre Kalziumionenkonzentration

DCF Dichlorofluoreszein Diacetat

DMEM Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium

DMSO Dimethylsulfoxid

EGTA Ethylenglykol-bis(ß-Aminoethylether)- N,N,N,N‘,N‘ tetra-Essigsäure (Ca2+-Chelator)

ER Endoplasmatisches Retikulum

Fluo-4 Ca2+-sensitiver Fluorophor Fura-2 Ca2+-sensitiver Fluorophor

GSH Glutathion oder Glutathion-di-Sulfid

GSSG oxidiertes GSH

Hepes (N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N‘-[2-Ethansulfonsäure]) H2DCFDA Di-Hydro-Chlorofluoreszein-di-Azetat

IDL Interactive Data Language Kd Dissoziationskonstante

[K+]i intrazelluläre Kaliumionenkonzentration

n Brechungsindex

NA Numerische Apertur

NAD+ Nicotinamid Adenin Dinukleotid NADH reduzierte Form von NAD+

NADP+ Nicotinamid Adenin Dinukleotid Phosphat NADPH reduzierte Form von NADP+

[Na+]i intrazelluläre Natriumionenkonzentration

Pi anorganisches Phosphat

PBFI Potassium Bindung Benzofuran Isophtalate pHi intrazellulärer pH-Wert

pHex extrazellulärer pH-Wert

PKC Phosphokinase C

RSV reaktive Sauerstoffverbindungen SBFI Sodium Bindung Benzofuran Isophtalate SNARF-1 Carboxy-Seminaphtorhodafluoreszein TCA Tri-Carbon Acid Cycle

TMRE Tetra-Methylrhodamin-Ethylester TMRM Tetra-Methylrhodamin-Methylester Tris 2-AMINO-2-(HYDROXYMETHYL)-1,3-PROPANDIOL ZNS Zentralnervensystem ∆Ψ Plasmamembranpotential ∆ΨM Mitochondrienmembranpotential ∆G Freie Enthalpie

(4)

A

BSTRACT

Pathological conditions due to oxidative stress inside the central nervous system (CNS) are often related to glial dysfunction. In this work the dose dependent disorders of ion transport processes and mitochondrial membrane potential caused by hydrogen peroxide were investigated with fluorescence spectroscopic methods in C6-Glioma-Cells. These cells served as a model system for one glial subtype, the astrocytes. Astrocytes provide more than 90 % of the antioxidant capacity of the brain protecting neurons and oligodendrocytes.

Furthermore astrocytes maintain extracellular ion and neurotransmitter concentrations at a physiological equilibrium supporting neuronal activity. Dose dependent but reversibel disturbances of intracellular sodium and potassium ion concentrations were measured during superfusion with 50, 100 and 500 µM H2O2 for 15 min in adherent C6-Glioma-Cells with

fluorescence spectroscopy using the fluorescent probes SBFI and PBFI.

A superfusion for 30 min with nutrient media containing 100 µM H2O2 was paralleled

by a reversibel intracellular acidosis from 7.2 to 6.9 ± 0.05, whereas 250 µM resulted in an irreversible acidification of 6.6 ± 0.1 as revealed by confocal laser scanning fluorescence microscopy in single cells stained with the pH-sensitive fluorescent probe SNARF-1.

The main emphasis was put on confocal imaging to investigate the involvement of intracellular free calcium concentration ([Ca2+]i) and mitochondrial membrane potential

(∆ΨM) in the hydrogen peroxide induced signal transduction pathway with simultaneous employment of the fluorescent probes Fluo-4 ([Ca2+]i) and TMRM (∆ΨM). This signaling transduction involves a H2O2 dose dependent Ca2+ influx and hyperpolarization of ∆ΨM. If the Ca2+ influx was abolished by extracellular Ca2+-chelator EGTA the hyperpolarisation was lowered. 250 µ M leaded to a transient [Ca2+]i increase paralleled by mitochondrial

hyperpolarisation. During the following 7 h 40 % of the hyperpolarized mitochondria underwent depolarization. Loss of intakt but hyperpolarized mitochondria severly occured during and after 500 µM H2O2 in cells with permanent elevated [Ca2+]i.

The effects of 500 µM H2O2 resulted in a 40 % loss of viability and apoptosis. The

latter was detected with DNA-gelelectrophoresis. It is suggested that the irreversibel elevation of [Ca2+]i is involved in the depolarisation of ∆ΨM and in the following onset of the mitochondrial transition pore. The transition pore is known to precede the programmed cell death, apoptosis. The apoptotic pathway is interrupted if all mitochondria of the affected cell undergo depolarisation. The following deficiency of high energy substrates leads to cell swelling and plasmamembrane disrupture, the so called onkosis. The results of this work indicate that the mitochondria are involved in the signal cascade of the oxidative stress response in C6-Glioma-Cells.

(5)

INHALT

1. E

INLEITUNG

1

1.1 Gliederung 3

2. M

ATERIAL UND

M

ETHODEN

4

2.1 Gliazellen 4

2.1.1 Zellkultur 5

2.1.2 Oxidativer Streß 5

2.2 Ionenkonzentrationsgradienten über der Plasmamembran 7

2.3 Fluoreszenzsonden 10

2.3.1 Berechnung der Ionenkonzentration 12

2.3.2 Eichung von ionensensitiven Fluoreszenzsonden 14

2.4 Konfokale Mikroskopie 19

2.4.1 Konfokale Laser Scanning Fluoreszenzmikroskopie 22

2.5 Meßbedingungen 25

2.5.1 Versorgung der Zellen 25

2.5.2 Konfokale Laser Scanning Mikroskopie mit dem LSM 410 26 2.5.3 Auswertung der fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen 28

3. E

RGEBNISSE

30

3.1 Intrazelluläre Natrium- und Kaliumionenkonzentration

3.2 Der intrazelluläre pH-Wert 32

3.2.1 Intrazelluläre pH-Puffersysteme

3.2.2 H+-Ionentransporte in das und aus dem Zytoplasma 34

3.2.3 Metabolismus und pH 36

(6)

3.3 Botenstoff Kalzium 41

3.3.1 Oxidativer Streß und die [Ca2+]i 43

3.3.2 Quelle der Änderung der [Ca2+]i 48

3.3.3 Mitochondrien und die [Ca2+]i 51

3.3.4 Auswertung der fluoreszenzmikroskopischen 53

Aufnahmen vom Zustand der Mitochondrien und simultaner Messung der [Ca2+]i Exkurs 61 Oxidativer Streß [Ca2+]i und die Mitochondrien 62 Oxidativer Streß ohne Ca2+-Einstrom durch die Plasmamembran 67 Zusammenfassung 73

4. D

ISKUSSION

74

4.1 Azidose bei oxidativem Streß durch Hydrolyse von ATP 74 4.1.1 ATP-Hydrolyse und die Ansäuerung des Zytoplasmas 76 4.1.2 ATP-Konzentration und Ionentransporte 76 Schlußfolgerung 81 4.2 Signalkaskade bei oxidativem Streß: [Ca2+]i und Mitochondrien 82

4.2.1 Zelltod durch oxidativen Streß 82 4.2.2 Staurosporin: Apoptose, [Ca2+]i und Zustand der Mitochondrien 85 4.2.3 Oxidativer Streß schädigt Mitochondrien 88

4.2.4 Mitochondriale Pore 90

4.2.5 Anhaltend erhöhte [Ca2+]i, Verlust intakter Mitochondrien 92

4.2.6 H2O2und ATP-Produktion 93

4.3 Schlußfolgerung 95

5. Z

USAMMENFASSUNG

98

ANHANG A 100

Ergänzende Ergebnisse und weiterführende Literatur ANHANG B 115

Zellkultur und Puffermedien LITERATURVERZEICHNIS 117

Poster, Tagungen 124

Lebenslauf 125

(7)

Einleitung 1

1 Einleitung

Die alters- und krankheitsbedingten Schädigungen des Zentralnervensystems werden häufig durch die Wirkung reaktiver Sauerstoffverbindungen verursacht. Zwei bekannte Beispiele sind die Parkinsonsche und die Alzheimerische Krankheit. Derartige Beeinträchtigungen neuronaler Kommunikation stehen im Brennpunkt des medizinischen Interesses, wobei die Rolle der Gliazellen zusehends an Bedeutung gewinnt. 90 % unseres Zentralnervensystems (ZNS) besteht aus der Glia, den Bindegewebszellen zwischen den Neuronen. Neben der Stützgewebefunktion erfüllen die Gliazellen vielfältige Aufgaben, die die Leistungsfähigkeit der neuronalen Signalverarbeitung unterstützen. Krankhafte Veränderungen und die Degeneration des Nervensystems sind häufig mit Fehlfunktionen der Gliazellen verknüpft. Durch die neuronale Aktivität im ZNS werden Änderungen der extrazellulären Konzentration von Neurotransmittern und Ionen verursacht. Intakte Gliazellen regulieren diese Bestandteile des extrazellulären Mediums auf das Ruheniveau zurück. Irreversible Störungen des dynamischen Gleichgewichts zwischen Zytoplasma und extrazellulärem Medium bezüglich der Konzentrationen von Natrium, Kalium und Kalzium sowie dem pH erschweren die neuronale Kommunikation und sind Anzeichen für die dauerhaft beeinträchtigte Funktion der Gliazellen.

Deshalb werden die Störungen der Ionentransporte über die Plasmamembran von C6-(Rat-)Glioma-Zellen durch die dosisabhängige Wirkung von oxidativem Streß in dieser Arbeit untersucht. Die entscheidende Frage dabei ist, wie die deregulierten Ionenkonzentrati-onen an intrazellulären Signalkaskaden beteiligt sind.

Die immortalisierte und in Kultur gehaltene Zellinie C6-(Rat-)Glioma ist ein verbreitetes Modellsystem für eine funktionelle Untereinheit der Glia, die Astrozyten. Astrozyten nehmen in bezug auf die Streßtoleranz des ZNS eine Sonderrolle ein. Sie enthalten mehr Enzyme und Antioxidantien als die anderen Zellen des ZNS und schützen so auch die benachbarten Zellen. Deshalb sterben Neuronen und Oligodendrozyten bei der irreversiblen Schädigung von Astrozyten durch reaktive Sauerstoffverbindungen ebenfalls ab. Oxidativer Streß wird für die Experimente an C6-Glioma-Zellen mit membranpermeablem Wasserstoffperoxid ausgelöst. Bekannte Methoden zur Messung der Ionentransporte über die Plasmamembran lebender Zellen sind Patch Clamp, die Anreicherung radioaktiver Ionen, die Kernspinresonanz- und die Fluoreszenzspektroskopie. Die fluoreszenzspektroskopische Methode ist für die Untersu-chungen in dieser Arbeit ausgewählt worden, weil sowohl Experimente mit großen Zellpopulationen von 5x106 Zellen im Fluoreszenzspektrometer als auch ortsaufgelöste Messungen an einzelnen Zellen einer Population mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie durchgeführt werden können. Die zeitliche Auflösung ist dabei zwar geringer als bei der Patch-Clamp-Methode, aber deutlich besser als bei der Kernspinresonanzspektroskopie.

(8)

2 Einleitung Die fluoreszenzspektroskopische Messung der intrazellulären Konzentrationsänderungen von

Natrium, Kalium, Kalzium und der intrazelluläre pH-Wert wird mit Hilfe von ins Zytoplasma eingebrachten, ionensensitiven Fluoreszenzsonden ermöglicht. Die hohe Ortsauflösung der verwendeten konfokalen Laser Scanning Fluoreszenzmikroskopie erlaubt außerdem die Detektion des Zustands der Mitochondrien. Simultane Änderungen der intrazellulären Kalziumkonzentration ([Ca2+]i) können durch die geeignete Auswahl der Fluoreszenzsonden

sichtbar gemacht werden.

Die Messung am empfindlichen und komplexen System „Zelle“ erfordert experimentelle Bedingungen, die den physiologischen weitestgehend entsprechen. Für die konfokale Laser Scanning Fluoreszenzmikroskopie wurde deshalb ein Objektträger benötigt, in dem die Zellen unter Zellkulturbedingungen gehalten werden können. Die Konstruktion sollte außerdem den Austausch des Mediums während der Messung erlauben, um sofortige Zellreaktionen auf oxidativen Streß detektierbar zu machen.

Jede intakte Zelle hält transmembrane Konzentrationsgradienten von Natrium- und Kaliumionen fern vom thermodynamischen Gleichgewicht aufrecht. Die Messung der intrazellulären Natrium- und Kaliumionenkonzentration bei oxidativem Streß dient dem Nachweis von Änderungen der transmembranen Ionenkonzentrationsgradienten. Ändern sich diese Konzentrationen in Astrozyten, können sie ihrer Aufgabe im ZNS, die Zusammenset-zung des extrazellulären Milieus zu regulieren, nur noch bedingt gerecht werden. Mit der Detektion des intrazellulären pH-Werts wird die Funktion einer Vielzahl pH-abhängiger physiologischer Prozesse, z.B. dem Energiestoffwechsel, überprüft. Änderungen der zytoplasmatischen Kalziumkonzentration sind eng mit der intrazellulären Signalweiterleitung verknüpft. Ihr wird wegen dieser Sonderrolle unter den intrazellulären Ionen besondere Aufmerksamkeit gewidmet.

Die Mitochondrien sind, neben dem Endoplasmatischen Retikulum, die an der Modulation der [Ca2+]i-vermittelten intrazellulären Signalweiterleitung beteiligten Organellen. Sie

beeinflussen dadurch den weiteren Weg der Signalkaskade nach einer [Ca2+]i-Antwort der

Zelle. Der Zustand der Mitochondrien wird durch die Unterscheidung von intaktem oder gestörtem Membranpotential meßbar. Intakte Mitochondrien decken den Energiebedarf der Zelle durch einen aeroben Stoffwechsel mit hohem Wirkungsgrad. Ohne sie kann das dynamische Gleichgewicht der Ionentransporte über die Plasmamembran nicht aufrechterhal-ten werden. Außerdem sind die Mitochondrien noch auf anderem Wege an intrazellulären Signalkaskaden beteiligt. Gelangen Proteine aus dem Inneren geschädigter Mitochondrien ins Zytoplasma wird der (vor-) programmierte Zelltod (Apoptose) ausgelöst. Schließlich machen die Mitochondrien bereits unter Ruhebedingungen durch die geringe Produktion von Superoxidradikalen zelluläre Enzymsysteme und Antioxidantien zum Abbau reaktiver Sauerstoffverbindungen notwendig. Erst die Überschreitung der durch den normalen aeroben Stoffwechsel bedingten Konzentration reaktiver Sauerstoffverbindungen in der Zelle verursacht oxidativen Streß.

(9)

Einleitung 3 In dieser Arbeit werden alle zellulären Regulationsmechanismen als Netzwerk voneinander abhängiger Größen betrachtet. Die Untersuchung des Zusammenspiels zwischen Io-nentransporten und mitochondrialer Aktivität in lebenden Zellen beleuchtet dabei nur einen Teilaspekt aus dem Gesamtzusammenhang der zellulären Reaktion auf oxidativen Streß.

1.1 Gliederung

In den beiden ersten Teilen des zweiten Kapitels, „Material und Methoden“, wird die Rolle der Gliazellen, insbesondere die der Astrozyten und die biochemischen Reaktionen, die bei der Zugabe von Wasserstoffperoxid (H2O2) in eine Zellkultur hauptsächlich zu erwarten sind,

beschrieben. Die Anwendung der ionensensitiven Fluoreszenzfarbstoffe wird im Anschluß erläutert.

Der dritte Teil des zweiten Kapitels ist dem physikalischen Prinzip der konfokalen Mikroskopie und der Anwendung der konfokalen Laser Scanning Mikroskopie gewidmet. Am Ende des 2. Kapitels werden Teile der Auswertungsmethode zur Bestimmung der Ionenkonzentrationen am konfokalen Mikroskop beschrieben. Hier befinden sich auch Skizzen vom perfundierbaren Objektträger und dem Aufbau des konfokalen Laser Scanning Mikroskops LSM 410.

Na+ und K+ sind die häufigsten Kationen im Medium bzw. in Zytoplasma. Von Änderungen der Verteilung dieser Ionen sind auch die Bedingungen für die Regulation des pHi und der

[Ca2+]i betroffen. Welche Verschiebungen dieses Gleichgewichts durch oxidativen Streß

auslöst werden, wird im ersten Teil des Kapitels über die Meßergebnisse (Kapitel 3) gezeigt. Diese Ergebnisse sind Teil der Diplomarbeit von B. Säume, die er in dieser Arbeitsgruppe angefertigt hat [SÄUB98]. Im Anschluß werden die Meßergebnisse der in engem Zusammen-hang mit dem Metabolismus stehenden Änderungen des pHi durch oxidativen Streß

präsentiert.

Die Ergebnisse zur dosisabhängigen [Ca2+]i-Antwort der C6-Glioma-Zellen bei Zugabe von

H2O2 geben Aufschluß über die Quelle der [Ca2+]i. Die Ergebnisse der Messung des Zustands

der Mitochondrien sind im letzten Teil des dritten Kapitels zu finden. Dort wird auf die Auswertung mit Hilfe der von S. Härtel entwickelten und mit IDL (Interactive Data Language) programmierten Bildverarbeitung eingegangen [HÄRS00].

Am Anfang des vierten Kapitels wird die Wirkung von H2O2 auf den pHi anhand aktueller

Literatur erörtert. Die Änderung der [Ca2+]i und der Zustand der Mitochondrien bei der

Auslösung des Signals zum programmierten Zelltod wird im Anschluß mit den Ergebnissen zum oxidativen Streß verglichen. Die Wechselwirkung der erhöhten [Ca2+]i und der reaktiven

Sauerstoffverbindungen mit dem Zustand der Mitochondrien werden in den Zusammenhang mit der aktuellen Diskussion zur Rolle dieser Organellen bei den verschiedenen Formen des Zellsterbens gestellt. Die Schlußfolgerungen in beiden Unterkapiteln der Diskussion vermitteln einen Überblick über die zellulären Regulationsmechanismen der Ionenkonzentra-tion im Zytoplasma bei oxidativem Streß.

(10)

4 MATERIAL UND METHODEN

2 Material

und

Methoden

2.1 Gliazellen

Nach einer groben Unterteilung der Zelltypen im Zentralnervensystem (ZNS) werden die nicht erregbaren Zellen Gliazellen genannt. Entgegen erster Vermutungen fungieren sie nicht nur als Stützgewebe (Glia = Kit), sondern sind mit vielfältigen Aufgaben betraut. Gliazellen lassen sich nach morphologischen und funktionellen Eigenschaften in drei Subtypen einteilen: Astrozyten, Oligodendrozyten und Mikroglia. Letztere sind die im ZNS lokalisierten Immunzellen.       

Oligodendrozyten ermöglichen durch die Myelinisierung (Ummantelung mit Membran) der Axone die saltatorische Erregungsleitung bei der elektrischen Signalweiterleitung im ZNS. Im peripheren Nervensystem, bei längeren Axonen und geringerer Neuronendichte, übernehmen Schwannsche Zellen diese Aufgabe [ALBB95, SIEJ94, KETH95].

Die Fähigkeiten der Astrozyten sind in vielfältiger Hinsicht mit der Funktion des Neuronen-netzwerkes verknüpft. Der Transport von Substanzen aus dem Blutkreislauf zu den Neuronen geht immer durch eine Astrozytenschicht. Die Vermutung liegt nahe, daß eine metabolische Aufbereitung in den Astrozyten stattfindet. Sie regulieren den extrazellulären pH-Wert, die extrazelluläre Kaliumkonzentration (pHex) und die [K+]ex) und sorgen so für optimale

Milieubedingungen im ZNS. Ihre weitverzweigte Morphologie ist eng mit ihrer Funktion verknüpft. Überall dorthin, wo die Zusammensetzung des extrazellulären Milieus entschei-dend ist, reichen Astrozytenfortsätze. Sie befinden sich z.B. in der Nähe jeder Synapse. Ein Beispiel für den Austausch von Metaboliten zwischen Astrozyten und Neuronen ist die Aufnahme von Glutamat durch Astrozyten, das bei neuronaler Aktivität an glutamergen

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(11)

GLIAZELLEN 5 Synapsen freigesetzt wird. Astrozyten wandeln Glutamat in γ-Aminobuttersäure (GABA) um und setzen diese wieder frei, so daß sie von den Neuronen aufgenommen werden kann. So sind Astrozyten in den Glutamat-Kreislauf im ZNS eingebunden [CERS96, GLOJ94, KETH95, MARH96, SASH96].

2.1.1 Zellkultur

Die Zellinie C6-(Rat-)Glioma wurde bereits 1968 durch einen chemisch induzierten Tumor in einer Kultur von neonatalen Rattenastrozyten immortalisiert. Sie hat die Eigenschaften einer noch nicht vollständig differenzierten Gliazelle mit dem Potential, unter bestimmten Kulturbedingungen auch oligodendrozytenspezifische Proteine zu exprimieren [BENP68, BACH87].

C6-(Rat-)Glioma Zellen wurden in Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) mit 10% neonatalem Kälberserum und 44 mM NaHCO3 in 10%CO2 bei 37°C (pH 7,4) im Brutschrank

kultiviert. Sie wurden alle 3,5 Tage, nachdem die Kulturflaschen konfluent bewachsen waren, mit einer Trypsin/EDTA Lösung suspendiert, abzentrifugiert und zu 1/12 in neuen Kulturflaschen weiterkultiviert. Für Experimente wurden nur Zellen von der 4. bis zur 25. Passage verwendet [PARK80]. Die fluoreszenzspektroskopischen Messungen in Perfusion wurden an Zellen, die in silikonisierten Rührflaschen auf Mikroträgern aus Gelatine bis zu einer Dichte von 3x107 pro ml Mikroträger gewachsen waren, durchgeführt. Für die Mikroskopie wurden die Zellen auf mit Poly-L-Lysin beschichteten, runden Deckgläsern ausplatiert. Die verwendeten Zelldichten lagen dabei während der Experimente zwischen 1 und 2x104 pro cm².

C6-Glioma-Zellen wurden von der AG Rensing zur Verfügung gestellt und im eigenen Zellkulturlabor kultiviert (s. Anhang B).

2.1.2 Oxidativer Streß

Im normalen Stoffwechsel wird H2O2 ständig produziert: Bei der Oxidation des NADH am

Komplex 1 in der Atmungskette werden bis zu 2 % der Elektronen auf molekularen Sauerstoff übertragen. Dabei entstehen Superoxidanionen, die von der Superoxiddismutase mit Beteiligung von H2O in H2O2 umgewandelt werden.

H2O2 ist langlebig und membranpermeabel [SIEH93]. Im Organismus werden zwei H2O2

-Moleküle z.B. durch das Enzym Katalase oder die Glutathionperoxidase zu je zwei H2O- und

O2-Molekülen abgebaut. Die Glutathionperoxidase oxidiert dabei Glutathion, welches von der

Glutathionreduktase mit Beteiligung der Oxidation von NADPH zu NADP+ wieder in die reduzierte Form gebracht wird.

Trifft das H2O2-Molekül auf reduziertes Eisen (Fe2+, oder auch andere reduzierte

Über-gangsmetalle) findet die Fenton-Reaktion statt: − • + →  OH OH O H Fe 2 2 (2.1.1)

(12)

6 MATERIAL UND METHODEN wobei Fe2+ zu Fe3+ oxidiert wird. Im Organismus kann Fe3+ z.B. durch das Superoxidanion reduziert werden, welches besonders häufig in den Mitochondrien vorkommt und dort normalerweise von der Superoxiddismutase in H2O2 umgewandelt wird (s.o.). In Gegenwart

dieses geeigneten Reduktors wird die eisenkatalysierte Harber-Weiss-Reaktion nicht durch Mangel an Fe2+ gebremst:

+ → + +

O2 H2O2 Fe O2 OH OH (2.1.2)

Ist das hochreaktive, kurzlebige Hydroxylradikal entstanden, gibt es nur noch Rettung durch Antioxidantien vor der Lipidperoxidation, der Proteindenaturierung oder der DNA-Schädigung. Diese Antioxidantien sind jedoch nahezu unwirksam gegen das Hydroxylradikal selbst wegen dessen kurzer Halbwertszeit von 10-9 s. Deshalb wirken sie erst an zweiter Stelle der RSV-Schädigung, sie reduzieren erst die Produkte der Hydroxylradikalreaktion mit zellulären Bausteinen [SIEH93].

Bei der Lipidperoxidation reagieren Hydroxylradikale mit Wasserstoffatomen, die an Kohlenstoffatome gebunden sind, welche wiederum an Doppelbindungen von ungesättigten Lipiden beteiligt sind. Durch die weitere Reaktion mit molekularem Sauerstoff bildet sich ein Lipidperoxylradikal, wodurch eine Lipidperoxidations-Kettenreaktion ausgelöst wird. Die Schäden in der Plasmamembran führen zur Erhöhung der Membranpermeabilität. Die Lipidperoxidations-Kettenreaktion kann durch das lipophile α-Tocopherol zum Stillstand gebracht werden.

Von den Proteinen reagieren die Thiolgruppen der Cysteinreste leicht mit RSV. Die resultierenden Disulfidbrücken führen beispielsweise zu Funktionsstörungen von Enzymen. Diesem Effekt wird durch Streßproteine vorgebeugt. Die verstärkte Expression von Hitzeschockproteinen führt deshalb zu erhöhter Überlebensrate bei oxidativem Streß [POLB96].

Das Antioxidantienreservoir liegt, wie die Expression von Streßproteinen und Enzymen zum Abbau von RSV, auf zelltypspezifischem Niveau. Es kann nach oxidativem Streß durch die Reduktion, Produktion oder Aufnahme von Antioxidantien wiederhergestellt werden.

Die Empfindlichkeit der Zellen hängt außerdem von der Konzentration freien Fe2+-Ionen im Zytoplasma und in den Organellen ab. Die zelluläre Eisenkonzentration wird durch die Anzahl der Transferrinrezeptoren – also die Eintransportrate – und die Konzentration von Ferritin, einem eisenbindenen Protein im Zytoplasma, reguliert.

Oxidativer Streß tritt im Gehirn bei der Reperfusion mit O2-haltigem Blut nach einem Infarkt

oder Schlaganfall auf. Außerdem benutzen Zellen des Immunsystems – im ZNS die Mikroglia – die Synthese von verschiedenen membranpermeablen RSV bei der Immunreaktion. Die Degeneration des ZNS ist mit pathologischen Störungen des RSV-Metabolismus verbunden. Ein Beispiel ist der Gehalt von oxidativen Streß begünstigenden Stoffen in der Substantia Nigra von Parkinsonkranken.

(13)

IONENKONZENTRATIONSGRADIENTEN ÜBER DER PLASMAMEMBRAN 7

Er ist höher und der an Antioxidantien entsprechend niedriger als im Normalfall [YOUM90]. Die Antioxidantien im ZNS sind in erster Linie in den Astrozyten zu finden, die deshalb streßtoleranter als Neuronen und Oligodendrozyten sind. Astrozyten haben die 4,5fache Katalase- und Glutathionperoxidase-Aktivität von Neuronen [DESS96]. Während die letale Dosis, bei der 50 % der Zellen sterben, (LD50) von separierten Neuronen bei 2 h mit 50 µ M

H2O2 liegt, ist die von Astrozyten zwischen 400 und 500 µM während 2 h fast zehnmal so

hoch. Durch die Inkubation von Astrozyten mit 50 µM H2O2 konnte außerdem gezeigt

werden, daß dieser Zelltyp in der Lage ist, sich durch die verstärkte Glutathionperoxidase-Expression an die erhöhte RSV-Konzentration anzupassen [IWAE99]. Im ZNS haben Astrozyten die Aufgabe, benachbarte Zellen vor oxidativem Streß zu schützen: Bei Neuronen steigt die LD50 von 100 µM H2O2 auf 300 µ M für 30 min, wenn sie mit Astrozyten

kokultiviert werden [DESS96]. Die Astrozyten bilden eine wichtige Barriere gegen oxidativen Streß im ZNS. In dieser Arbeit wird untersucht, wie die Ionen-Homöostase im Astrozytenmo-dell, den C6-(Rat-)Glioma-Zellen, an der zellulären Antwort auf oxidativen Streß beteiligt ist.

2.2 Ionenkonzentrationsgradienten über der Plasmamembran

Die Zelle sorgt unter Energieaufwand für eine Ionenkonzentrationsverteilung über der Plasmamembran, die ihr Anschwellen trotz der höheren Konzentration kleiner, negativ geladener und membranimpermeabler Moleküle im Zytoplasma verhindert.

Kalium (K+) ist mit einer Konzentration von ca. 130 mM das häufigste intrazelluläre Kation. Das zweithäufigste ist Natrium (Na+), dessen Ruhekonzentration in Gliomazellen bei 10 mM liegt. Im extrazellulären Medium sind die Verhältnisse nahezu umgekehrt, die Summe der Na+- und K+-Konzentration im extrazellulären Medium ist größer als im Zytoplasma. Die Kalziumionen spielen in bezug auf Osmolarität nur eine untergeordnete Rolle, ihre Konzentration im Medium ist 1 bis 2 mM und im Zytoplasma sogar nur ca. 100 nM. Die Konzentration von Chloridanionen (Cl-) ist im Medium 145 mM. Sie erreicht im Zytoplasma von Gliazellen 10 bis 40 mM [KETH95].

Zytoplasma und Medium sind durch die Plasmamembran getrennt. Sie besteht aus doppelschichtig angeordneten Phospholipiden mit einander zugewandten, unpolaren Seitenketten und voneinander abgekehrten, hydrophoben Kopfgruppen. Somit bildet sie für polare Substanzen eine weitgehend undurchdringbare Barriere. Die Geschwindigkeit, mit der eine Substanz die Membran passiert, ist proportional zu ihrem Konzentrationsgradienten. Die Permeabilitätskoeffizienten hängen von der Größe des Moleküls und von der Anzahl der Wasserstoffbrückenbindungen im wässrigen Milieu ab. Der Ionentransport durch die Phospholipidmembran ist mit einem Permeabilitätskoeffizienten von ca. 10-12 cm s-1 vernachlässigbar klein gegenüber dem von H2O mit 10-2 cm s-1 [ADAG95, ALBB95].

(14)

8 MATERIAL UND METHODEN

Ionen, die im wässrigen Milieu von einer Hydratationshülle umgeben sind, können die intakte Membran nur über ionenkanalbildende oder sogenannte Carrier-Proteine durchqueren. Kanalproteine bilden eine Pore in der Membran, in der das wässrige Milieu vom hydrophoben Teil der Lipiddoppelschicht abgeschirmt wird. So können Ionen die Membran nach dem „Abstreifen“ der Hydratationshülle mit Hilfe von nichtkovalenten Wechselwirkungen im Ionenkanalprotein in Richtung des Konzentrationsgradienten passieren, wenn das Kanalprote-in Kanalprote-in der geöffneten Konformation vorliegt.

Carrier-Proteine binden eine bestimmte Substanz, die dann mit Hilfe einer Reihe von Konformationsänderungen des Carrier-Proteins durch die Lipiddoppelschicht befördert wird. Im Gegensatz zu den kanalbildenden Proteinen können die Carrier-Proteine Substanzen gegen den Konzentrationsgradienten transportieren. Sie koppeln den Transportprozeß an die

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GLHGXUFKGHQ(QHUJLHVWRIIZHFKVHODQJHWULHEHQZLUG'LHJHOEHQ3IHLOH]HLJHQGLH5LFKWXQJGHU .RQ]HQWUDWLRQVJUDGLHQWHQGHU,RQHQPLWGHQK|FKVWHQ$QWHLOHQDQGHU2VPRODULWlWDQ 1DWULXP .DOLXPXQG&KORULRQHQ 'LHJUR‰H6FKULIWHQWVSULFKWKRKHQ.RQ]HQWUDWLRQHQGLHNOHLQH6FKULIW QLHGULJHQ /LQNV LVW GLH /LSLGGRSSHOVFKLFKW DEJHELOGHW *UQ VWHKW IU EHUZLHJHQG SRVWLY JHODGHQH.RSIJUXSSHQDXIGHU$X‰HQVHLWHRUDQJHIUEHUZLHJHQGQHJDWLYJHODGHQHDXIGHU ,QQHQVHLWHGHU3ODVPDPHPEUDQ:DVVHUNDQQQDKH]XXQJHKLQGHUWGXUFKGLH/LSLGGRSSHOVFKLFKW GLIIXQGLHUHQ'LHJUDXPDUNLHUWHQ7UDQVSRUWV\VWHPHVLQGDQGHU5HJXODWLRQGHU,RQHQNRQ]HQWUD WLRQHQEHWHLOLJW 6\PSRUWHXQG7DXVFKHU VSDQQXQJVXQGOLJDQGHQJHVWHXHUWH,RQHQNDQlOH

$73DVHQ 'LH.RQ]HQWUDWLRQHQYRQ:DVVHUVWRII + XQG.DO]LXPLRQHQ &D VLQGLQ%H]XJ

DXI GLH 2VPRODULWlW YHUQDFKOlVVLJEDU NOHLQ )U GLH ,QWHUSUHWDWLRQ GHU (UJHEQLVVH ZLFKWLJH 7UDQVSRUWV\VWHPHZHUGHQYRUGHQGD]XJHK|ULJHQ0HVVXQJHQJHQDXHUYRUJHVWHOOW

(15)

IONENKONZENTRATIONSGRADIENTEN ÜBER DER PLASMAMEMBRAN 9 energieliefernde ATP-Hydrolyse (primärer aktiver Transport) oder an den Transport einer zweiten Substanz in Richtung deren Konzentrationsgradienten (sekundärer aktiver Transport). Das dynamische Gleichgewicht der Ionenkonzentrationen über der Plasmamembran von Zellen wird mit aktiven Transportmechanismen durch die ATP-Hydrolyse aufrechterhalten. Die Na+/K+ -ATPase ist elektrogen, sie erzeugt durch den Eintransport von 2K+ und den Austransport von 3Na+ die Konzentrationsgradienten von Na+ und K+ und durch den Nettoladungstransport das Membranpotential. Durch die Aktivität der Na+/K+-ATPase werden 25 % des im menschlichem Organismus synthetisierten ATP gespalten. Bei der zellulären Volumenregulation ist die Na+/K+-ATPase ebenfalls von zentraler Bedeutung. Weitere, aber in Säugetierzellen weniger an Aufbau oder Wiederherstellung des Membranpotentials beteiligte, elektrogene Transportmechanismen sind die Ca2+-ATPase und die H+-ATPase [LEHA98].

Die organischen Bestandteile des Zytoplasmas sind neben Makromolekülen, die wenig zur intrazellulären Osmolarität beitragen, kleine organische und zumeist negativ geladene Moleküle (z. B. Phosphat). Sie sind membranimpermeabel und ziehen die entsprechenden positiv geladenen Kationen an. Durch eine erhöhte intrazelluläre Osmolarität würde H2O ins

Zytoplasma strömen. Mit der Aufrechterhaltung des Ungleichgewichts zwischen Kationen und Anionen im Zytoplasma durch den Nettoaustransport von Kationen und Chloridanionen verhindert die Zelle die unkontrollierte Zunahme ihres Volumens.

Das Membranpotential von Säugetierzellen entspricht dem Membranpotential, daß sich mit Hilfe der Nernstgleichung aus dem [K+]ex/[K+]i-Verhältnis berechnen läßt, weshalb auch vom

Kaliumpotential gesprochen wird. Frühere Messungen eines linearen K+ -Strom-Spannungsverhältnisses basierten auf der Fehlinterpretation von Experimenten mit spitzen Mikroelektroden an Zellen des ZNS. Durch unzureichende Verbindung der Membran mit der Elektrode wurde ein Leckstrom als spannungsabhängiger Diffusionsstrom ermöglicht und täuschte so eine lineare Strom-Spannungskurve vor. Im Gegensatz zu dieser vereinfachenden und, wie sich mit der besseren Patch-Clamp-Technik herausstellte, auch falschen Hypothese, besitzen Astrozyten eine Vielfalt von spannungs- und [Ca2+]i-abhängigen Kaliumkanälen mit

nichtlinearen Transporteigenschaften. Diese befähigen Astrozyten zum K+-Transport im Gewebe durch die heterogene Verteilung der Kanäle in der Membran und deuten auf die komplexe Milieuregulation durch diese Zellen im ZNS hin [KETH95]. Das vollständige Repertoire der Kanalvielfalt wird allerdings nur in Astrozyten in Nachbarschaft zu Neuronen exprimiert, weshalb hier von einem weniger komplexen Modell für die [Na+] und [K+ ]-Regulation ausgegangen werden muß [CERS96, GLOJ94].

(16)

10 MATERIAL UND METHODEN

2.3 Fluoreszenzsonden

Die Palette der verwendeten Farbstoffe und die Auswertung des Fluoreszenzsignals wird hier vorgestellt. Spezielle Anmerkungen zur Auswertung sind im Ergebnisteil zu finden. Für weitere Ergänzungen wird auf Teil A des Anhangs verwiesen.

Für die Fluoreszenzspektroskopie und Mikroskopie wurden folgende Farbstoffe verwendet:

Fluorophor Extinktion x 10³ [M-1cm-1] Anregungs-maximum [nm] Emissionsma-ximum [nm] Ion, Molekül Selektivität Dissoziations-konstante* %&(&)    S+  S.  )OXR    &D !!0J Q0 )OXR     &D !!0J Q0 )XUD    &D !!0J Q0 +'&)'$    526516   3%),    . [1D P0 6%),    1D [. P0 FDUER[\ 61$5)    S+  S.  7050      

Alle verwendeten ionensensitiven Farbstoffe wurden als membranpermeable Acetoxymethyl-esterderivate inkubiert. In den Zellen werden die Acetoxmethylestergruppen von unspezifi-schen Esterasen abgespalten. Dadurch werden die Fluorophore membranimpermeabel und reichern sich innerhalb der Inkubationszeiten von 12 min (BCECF-AM) bis 45 min (z. B. Fluo-4-AM) bei extrazellulären Konzentrationen 2-5 µM intrazellulär auf ca. 100 µM an [HAUR99]. Dabei werden Formaldehyd und Ameisensäure freigesetzt (s. Abb. 2.3.1).

7DEHOOH(LJHQVFKDIWHQGHUYHUZHQGHWHQ)OXRURKRUH

'LH'LVVR]LDWLRQVNRQVWDQWHQJHOWHQDOOHQXUIUZlVVULJH/|VXQJEHLƒ&>+$85@ )OXR ZXUGHQXULQ9RUH[SHULPHQWHQYHUZHQGHW'DV$FHWR[\PHWK\OHVWHUGHULYDWYRQ)OXRZLUGVFKQHOOHU YRQ GHQ =HOOHQ DXIJHQRPPHQ XQG GDV ([WLQNWLRQVPD[LPXP EHL  QP LVW PLW  IDVW

(17)

FLUORESZENZSONDEN 11



$EE,QNXEDWLRQYRQ$FHWR[\PHWK\OHVWHUGHULYDWHQXQG&D6RQGHQIXQNWLRQ

,PREHUHQ7HLOLVWGLH,QNXEDWLRQGHVPHPEUDQSHUPHDEOHQ$FHWR[\PHWK\OHVWHUGHULYDWHVXQG GLH$EVSDOWXQJGHU$FHWR[\PHWK\OHVWHUJUXSSHQDP%HLVSLHOYRQ)XUD$0GDUJHVWHOOW'LH $QUHLFKHUXQJ GHU )OXRURSKRUH LVW YRQ GHU $EVSDOWXQJ IU GLH =HOOHVFKlGOLFKHU 6XEVWDQ]HQ )RUPDOGHK\GXQG(VVLJVlXUHEHJOHLWHW

'HU XQWHUH 7HLO YHUGHXWOLFKW GLH =XVDPPHQVHW]XQJ XQG )XQNWLRQVZHLVH GHU &DVHQVLWLYHQ )OXRUHV]HQ]VRQGH)OXRGLHDXFKDOV$FHWR[\PHWK\OHVWHULQGLH=HOOHQJHODQJW'HUEODXH 3IHLO NHQQ]HLFKQHW GLH 5RWDWLRQVP|JOLFKNHLW GHV )OXRUHVFHLQV UHODWLY ]XP &D&KHODWRU

%DSWD:HQQ&DDQ%DSWDJHEXQGHQZLUGYHUlQGHUWVLFKGLH6WUXNWXUGHV0ROHNOVGXUFK

GLH.lILJELOGXQJYRQ%DSWDXP&D ,RQ'LSRO:HFKVHOZLUNXQJPLW]ZHL1XQGYLHU2 VR

GD‰ GLH 5RWDWLRQ XQG GDPLW GLH 0|JOLFKNHLW IU VWUDKOXQJVORVH hEHUJlQJH DXV GHP DQJHUHJWHQ =XVWDQG VWDUN HLQJHVFKUlQNW LVW 'DGXUFK QLPPW GLH )OXRUHV]HQ]LQWHQVLWlW LQ $EKlQJLJNHLWGHU>&D@]X

(18)

12 MATERIAL UND METHODEN

2.3.1 Berechnung der Ionenkonzentration

Grynkiewicz et al. [GRYG85] haben eine Gleichung zur Berechnung der Ionenkonzentration aus der Fluoreszenzintensität der ionensensitiven Farbstoffe auf der Basis des Massenwir-kungsgesetzes und der Stöchiometrie des Fluorophors mit den Ionen abgeleitet. Das Massenwirkungsgesetz beschreibt das Konzentrationsverhältnis von aneinander gebundenen zu ungebundenen Substanzen in einer Lösung. Angewandt auf den Fall der ionensensitiven Fluorophore ist es:

d frei gebunden K Ion C C = ⋅[ ] (2.3.1)

mit der Konzentration gebundener Fluorophore Cgebunden, derjenigen freier Fluorophore Cfrei,

der Ionenkonzentration [Ion] und der Dissoziationskonstanten Kd

Dabei ergibt sich die Fluoreszenzintensität des Fluorophors (F) bei der Anregungs- oder Emissionswellenlänge (λi) aus der Summe der gebundenen und ungebundenen Zustände:

geb i geb frei i frei i F C F C F(λ)= (λ) + (λ) (2.3.2)

Setzt man nun Gleichung 2.3.2 in Gleichung 2.3.1 ein und löst diese nach der Konzentration der freien Ionen auf ergibt sich

) ( ) ( ] [ max min F F F F K Ion d − − ⋅ = (2.3.3)

mit der Fluoreszenzintensität bei nur ungebundenem Fluorophor (Fmin) und der Fluoreszenz-

intensität von vollständig gebundenem Fluorophor (Fmax)

für Fluorophore mit ionenkonzentrationsabhängiger Fluoreszenzintensität bei einer Anregungs- und/oder Emissionswellenlänge (λi) und

) ( ) ( ) ( ) ( ] [ max min 2 2 R R R R F F K Ion geb frei d − − ⋅ = λ λ (2.3.4) mit i = 1,2 und ) ( ) ( ) ( ) ( 2 2 1 1 λ λ λ λ Str F Str F R − − = (2.3.5) mit Autofluoreszenz und Streuung der Probe (Str(λi))

für Fluorophore mit ionenkonzentrationsabhängiger Verschiebung des Fluoreszenzintensi-tätsmaximums im Anregungs- und/oder Emissionsspektrum. Der intrazelluläre pH (pHi) ergibt sich mit der Anwendung des Logarithmus auf Gl. 2.3.4:

    − − +         + = ) ( ) ( log ) ( ) ( log max min 2 2 R R R R F F pK pH geb frei s i λ λ (2.3.6)

(19)

FLUORESZENZSONDEN 13 Fluorophore mit ionenkonzentrationsabhängiger Verschiebung des Fluoreszenzintensitätsma-ximums im Anregungs- und/oder Emissionsspektrum haben den Vorteil Ergebnisse unabhängig von der Fluorophorkonzentration zu liefern. Die Berechnungen der Ionenkon-zentrationen basieren u.a. auf der Dissoziationskonstanten der Fluorophore, die neben der Temperatur auch vom Milieu abhängig ist und deshalb in situ bestimmt werden sollte.

Die im Spektrometer verwendeten ionensensitiven Fluoreszenzsonden BCECF und FURA-2 mit einer ionenkonzentrationsabhängigen Verschiebung im Anregungsspektrum und SNARF-1 (konfokale Laser Scanning Mikroskopie) mit einer Verschiebung im Emissionsspektrum sind Farbstoffe, die eine Messung der Ionenkonzentrationen unabhängig von der Fluoreszenz-intensität (vorausgesetzt die FluoreszenzFluoreszenz-intensität ist groß gegen die Autofluoreszenz) erlauben. Fluo-3 und Fluo-4, die für die Messung der Änderungen der [Ca2+]i am konfokalen

Laser Scanning Mikroskop verwendet wurden lassen, sich nur in situ eichen, wenn Auswaschen und Ausbleichen des Fluorophors vernachlässigt oder im Kontrollexperiment bestimmt werden kann.

Das ist bei der Dauer der Experimente über 100 min nicht der Fall (s. Abb. 2.5.3). Die Kinetik des Farbstoffverlusts unterscheidet sich von Zelle zu Zelle. Eine pauschale Bewertung aller Zellen ist deshalb problematisch. Auf die Eichung der [Ca2+]i-sensitiven Fluorophore wird in

Kapitel 3.3 eingegangen. Fazit ist, daß zur Berechnung der [Ca2+]i bei Messungen mit Fluo-4

die vom Hersteller angegebene Dissoziationskonstante verwendet wurde. Die minimale Fluoreszenzintensität (Fmin) entspricht dem Dunkelstrom des Photomultipliers bei der

eingestellten Verstärkung, das Maximum ist der höchste mit Ionomycin gemessene Wert oder der Sättigungswert der Photomultiplier (Fmax). Das Verhältnis von maximaler zu minimaler

Fluoreszenzintensität ist bei Fluo-4 100:1. Dies überschreitet je nach Fluorophorkonzentration in manchen Probenbereichen den Sättigungswert der PMT (in den Abb. 3.3.14-19 die Bereiche mit violetter Farbe). Bei den Experimenten mit 500µM H2O2 liegen diese Bereiche

in denen für die Auswertung der [Ca2+]i verwendeten. Deshalb wird dort die [Ca2+]i

unterschätzt.

Um intrazelluläre reaktive Sauerstoffverbindungen (RSV) zu detektieren eignet sich das Molekül di-Hydro-di-Chlorofluorescein Diacetat (H2DCFDA). Die Acetatgruppen machen

das Molekül membranpermeabel und werden im Zytoplasma durch intrazelluläre unspezifi-sche Esterasen abgespalten, so daß H2DCF nur noch bedingt membranpermeabel ist. Durch

die Reaktion mit RSV werden die zwei Wasserstoffionen abgespalten, dadurch wird das Molekül fluoreszent. Dieser Vorgang ist irreversibel. H2DCFDA eignet sich also nicht für die

Messung der Abbaugeschwindigkeit von intrazellulären reaktiven Sauerstoffverbindungen. Die quantitative Bestimmung der intrazellulären RSV-Dosis wird erschwert, weil DCF trotz zweier negativer Ladungen ins umgebende Medium gelangt, so daß Medium und Zellen nach ca. 1h gleichermaßen fluoreszieren (Ergebnis s. Anhang A.VIII).

Der membranpotentialsensitive Fluorophor Tetramethylrhodamin Methylester (TMRM, s. Anhang A. X) verteilt sich aufgrund seiner positiven Ladung und seiner

(20)

Membranpermeabili-14 MATERIAL UND METHODEN tät in den zwei durch die Membran getrennten Kompartimenten entsprechend der Nernstglei-chung:     ⋅ = ∆Ψ innen außen Ion Ion F RT ] [ ] [ log (2.3.7)

mit Plasmamembranpotential ∆Ψ, Gaskonstante R, Temperatur T, Faradaykonstante F, Io-nenkonzentration [Ion] für einen definitionsgemäß nach innen gerichteten Konzentrationsgra-dienten [ADAG95]

TMRM muß deshalb immer im Medium in dem die Messung stattfindet vorhanden sein. Hier wurde mit einer Konzentration von 0,3 µM gearbeitet. Das Farbstoffkonzentrationsverhältnis in intakten Mitochondrien mit einem Membranpotential von ∆ΨM = -200mV ist

4 10 6 , 5 exp ] [ ] [ ⋅ ≈      ∆Ψ =     RT F TMRM TMRM M Matrix Zytoplasma (2.3.8)

mit TMRM-Konzentration ([TMRM]) und Membranpotential der Mitochondrien (∆ΨM)

Dementsprechend emittieren die Mitochondrien die 2000fache Intensität des Zytoplasmas (bei TMRM-Konzentrationen bis 0.6 µM im Medium [LOEL93]). Für die Messung der gleichzeitigen Intensitätsänderungen von Medium, Zytoplasma und Mitochondrien zur Berechnung des Membranpotentials wird deshalb eine logarithmische Detektorempfindlich-keit benötigt. Die Photomultiplier am LSM 410 sind dafür nicht eingerichtet [EHRB93]. Die Detektion der am stärksten fluoreszierenden intakten Mitochondrien eignet sich gut für die simultane Anwendung von TMRM bei der Messung mit dem [Ca2+]i-sensitiven Fluo-4 (s.

Kapitel 3.3.4).

2.3.2 Eichung von ionensensitiven Fluoreszenzsonden

Prinzipiell können die Spektren aller ionensensitiven Fluorophore in Suspension geeicht werden. Dazu muß die Konzentration des entsprechenden Ions bei gleichbleibender Osmolarität variiert werden. Bei dem pH und der [Ca2+] kann die Eichung durch Titration erfolgen, weil die Gesamtionenkonzentration sich dadurch nicht wesentlich ändert.

Bei den Farbstoffen, die auf Ionen mit höherer Konzentration reagieren, sind verschiedene Ansätze mit jeweils unterschiedlicher Zusammensetzung der Gesamtionenkonzentration erforderlich. Diese Methode muß bei dem natriumsensitiven Fluorophor Sodium Binding Benzofuran Isophtalate (SBFI) angewendet werden. Die Eichung der Farbstoffe in Suspension kann nicht ohne Korrekturen auf die Eigenschaften der Fluoreszenzsonden in einer lebenden Zelle übertragen werden.

Für die in situ Kalibration wird die Plasmamembran von superfundierten, adhärenten Zellen mit dem Ionophor Gramicidin permeabilisiert und durch Perfusion mit drei verschiedenen [Na+]ex wird SBFI geeicht (s. [DÜSH96]). Die Eichung des kaliumsensitiven Fluorophors

(21)

FLUORESZENZSONDEN 15 unpraktikabel, hier mußte auf die Eichung in suspendierten Zellen zurückgegriffen werden (s. [SÄUB99]).

Die Intensitäten und Intensitätsverhältnisse können je nach verwendetem Spektrometer oder Filtersatz variieren, wenn die optischen Eigenschaften der Geräte nicht übereinstimmen. Deshalb sollte, wenn möglich, zur Eichung dieselbe Meßapparatur wie zur Messung der Ionenkonzentrationen in lebenden Zellen benutzt werden.

Ein weiterer Faktor, den es bei der Kalibration zu berücksichtigen gilt, ist die Dissoziati-onskonstante der Farbstoffe. Sie hängt von den Eigenschaften des Lösungsmittels, also der mikroskopischen Umgebung der Fluorophormoleküle ab. Bei der Eichung des Fluorophors in Lösung muß deren Zusammensetzung weitestgehend der des Zytoplasmas entsprechen.

Am Beispiel der pHi-sensitiven Fluoreszenzsonde SNARF werden zwei Alternativen der

Eichung behandelt. Für die Eichung in Suspension wurden die Zellen in Suspension (107/ml) 45min mit 5µ M SNARF-AM inkubiert, abzentrifugiert und in hepesgepufferten Lösungen mit den pH 6; 6,5; 6,8; 7; 7,2; 7,5 und 8 resuspendiert (s. Anhang B). Danach wurden die Zellen mit 0,05 Vol.% Triton x-100 lysiert. Von diesen Zellysaten wurden die Emmissionsspektren in Abb. 2.3.2 und 3 aufgenommen.

   

$EE   'LH (PLVVLRQVVSHNWUHQ YRQ &DUER[\61$5) ]HLJHQ HLQH DXVJHSUlJWH S+ 6HQVLWLYLWlWEHL:HUWHQEHU JHOES+KHOOJUQS+JUQS+XQGEODXJUQS+  XQWHUKDOE YRQ VLHEHQ LVW GLH )OXRUHV]HQ]VRQGH EHL GHU $QUHJXQJ PLW GHU  QP /LQLH GHV $UJRQ/DVHUV XQJHHLJQHW JHOERUDQJH S+  RUDQJH S+  XQG URW S+  0HVVXQJ DP 3HUNLQ(OOPHU/6% 

(22)

16 MATERIAL UND METHODEN Mit Hilfe dieser Emissionsspektren wurde am Fluoreszenzspektrometer ermittelt, bei welcher der am konfokalen Mikroskop zur Verfügung stehenden Anregungswellenlängen der Fluorophor die größte pH-Sensitivität zeigt (s. Abb. 2.3.2 und 3).

Zur Eichung des Fluorophors in den Zellen müssen intra- und extrazellulärer pH equilibriert werden. Dies wurde mit Hilfe des K+/H+ -Tauschers Nigericin bei gleichzeitiger Depolarisati-on mit 142mM = [K+]ex ( [K+]ex = [K+]i ) erreicht. Die Zellen wurden mit hepesgepuffertem

Tyrode mit den pH-Werten 6; 6,5; 6,8; 7; 7,2; 7,5 und 8 superfundiert. Zur Einstellung des Gleichgewichts wurde 500µ l des jeweiligen Puffers zum Austausch des Mediums in der Zellkammer mit einem Volumen von 30 µ l verwendet und danach mindestens 10 min dort belassen.

$EE+LHUVLQGGLH(PLVVLRQVVSHNWUHQYRQ&DUER[\61$5)DQJHUHJWPLWQPGHU +H1H/DVHUOLQLHDPNRQIRNDOHQ/DVHU6FDQQLQJ0LNURVNRSVEHLGHQS+:HUWHQYRQELV]X VHKHQ'LHS+6HQVLWLYLWlWLVWDXFKEHLQLHGULJHUHQS+JHZlKUOHLVWHW 0HVVXQJDP3HUNLQ(OOPHU /6%S+URWRUDQJHJHOERUDQJHJHOEJHOEJUQJUQJUQEODX 

(23)

FLUORESZENZSONDEN 17

Die Eichkurve basiert auf Gleichung (2.3.6). Die drei Unbekannten Kd, Rmax und Rmin lassen

sich mit Hilfe von drei bekannten Ri berechnen:

) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( 1 2 3 3 3 1 2 2 2 3 1 1 1 3 2 3 1 3 2 1 3 2 2 1 3 2 1 min C C C R C C C R C C C R C C C R R C C C R R C C C R R R − + − + − − + − + − = ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( 2 1 3 1 3 2 3 2 1 3 1 3 1 2 3 3 2 1 2 2 1 max C C R C C R C C R C C R R C C R R C C R R R − + − + − − + − + − = ) ( ) ( ) ( ) ( * min max 2 2 R R R R C F F K K i i i gebunden frei d d − − = = λ λ mit i = 1,2 oder 3 (2.3.9-11) und Ci = 10-pH

Für in situ Kalibrationen ist diese Berechnung der Fluorophorsignale für maximale und minimale Ionenkonzentrationen von Vorteil, weil Nebeneffekte durch große Abweichungen von den physiologischen Ionenkonzentrationen, die mit morphologischen Änderungen der Zellen bis zur Nekrose verbunden sind, minimiert werden können [HARA89].

Die Werte Kd*, Rmin und Rmax wurden für jedes Experiment mit SNARF-1 am LSM 410 neu

berechnet, weil die Verstärkung der beiden Photomultiplier unabhängig voneinander auf einen optimalen Wert eingestellt wurden, wodurch zwar in jedem Experiment andere Fluoreszenz-intensitätsverhältnisse gemessen wurden, aber die Empfindlichkeit der Messung erhöht werden konnte. Das machte eine in situ Kalibration der Meßwerte nach jedem Experiment nötig.

Im Vergleich zu Abb. 2.3.4 liegt die berechnete Eichkurve der Suspensionsmessungen genau auf den Meßwerten. Die absolute Änderung des Intensitätsverhältnisses ist wegen der

$EE (LFKNXUYH YRQ&DUER[\61$5) 6LH EHUXKW DXI GHU LQ VLWX (LFKXQJ PLW  —0 1LJHULFLQ LQ 7\URGH 3XIIHUO|VXQJ LQ GHU 1D GXUFK . HUVHW]W ZXUGH 5H]HSW V $Q KDQJ% 

(24)

18 MATERIAL UND METHODEN Kombination von 488 und 543nm Anregung geringer als bei der Eichung am konfokalen Mikroskop in situ und reagiert damit unempfindlicher auf Änderungen des pH.

Vorherige Inkubationsexperimente im OT haben gezeigt, daß die Autofluoreszenz der Zellen vernachlässigbar klein gegenüber der Fluoreszenz des Farbstoffs ist, und daß 5 µM Farbstoff im Nährmedium bei 37 °C und 45 min Inkubationszeit optimale Bedingungen für die Aufnahme der Acetoxymethylesterderivate von SNARF-1 für C6-Glioma-Zellen sind. Inhomogene Färbungen der verschiedenen Zellbereiche treten bei SNARF-1 häufig noch im Verlauf des Experiments auf, geringere Temperaturen können diese Kompartimentierungen verlangsamen, führen aber gleichzeitig zu unphysiologischen Meßbedingungen (s. Anhang A.VI). Deshalb und um die Vergleichbarkeit mit anderen Experimenten zu gewährleisten wurden alle Experimente bei 37°C durchgeführt. Selbiges gilt für Fluo-4 (in situ Eichung von BCECF und zur Fura-2-Kalibration s. Anhang A.IIc und IV).

Intensitätsverhältnis der Anteile im Emissionsspektrum von SNARF-1, Anregung mit 488 und 543nm je 50%, gemessen am Perkin Ellmer LSB 50

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 6 6.2 6.4 6.6 6.8 7 7.2 7.4 7.6 7.8 8 pH I( 5 80n m )/ I( > 6 00n m ) $EE  S+(LFKXQJ LQ =HOO\VDW 'LH hEHUODJHUXQJ GHU EHLGHQ DP 6SHNWURPHWHU JHPHVVHQHQ (PLVVLRQVVSHNW UHQ ]HLJW LPPHU QRFK HLQH DXVUHLFKHQGH S+ (PSILQGOLFKNHLW ]ZLVFKHQ  XQG   GHP %HUHLFK GHU IU GLH 0HVVXQJ GHU LQWUD]HOOXOlUHQ $QVlXHUXQJ EHVRQGHUVZLFKWLJLVW 'DGXUFK VLQG ([SHULPHQWH PLW JOHLFK]HLWLJHU $QUHJXQJ HLQHV ZHLWHUHQ )DUEVWRIIV EHL QPSULQ]LSLHOOP|JOLFK

(25)

KONFOKALE MIKROSKOPIE 19

2.4 Konfokale Mikroskopie

In diesem Unterkapitel soll zunächst das Prinzip der konfokalen Mikroskopie dargestellt werden. Im Anschluß daran wird erläutert, welche Rolle die am konfokalen Mikroskop zur Aufnahme eines Fluoreszenzbildes einstellbaren Parameter bei der Minimierung des Ausbleichens der Fluorophore spielen.

Die konventionelle mikroskopische Aufnahme enthält Licht von Objektebenen unter- und oberhalb der Fokusebene. Dadurch wird das Auflösungsvermögen geringer. Bei der konfokalen Mikroskopie geht es deshalb darum, diese Anteile auszublenden und so das Auflösungsvermögen zu verbessern.

Das Auflösungsvermögen eines Mikroskops hängt von der Übertragungsfunktion der Linse eines Punktes der Objekt- auf die Bildebene ab, der sogenannten Punktstreufunktion. Um die Verteilung des Lichts aus der Objektebene in der Bildebene zu berechnen, wird zunächst die Punktstreufunktion einer vereinfachten Mikroskopoptik betrachtet (nur Kondensor- und Objektivlinse, vgl. Abb. 2.4.2).

Die Amplitude des elektromagnetischen Feldes am Ort des Objekts U(x1, y1) wird dazu mit der Amplitude am Ort des Bildes U(x3, y3) (nur für die Objektivlinse) in Beziehung gesetzt. Ohne konstante Multiplikatoren und die Variation von Phasenverschiebungen zu berücksich-tigen, ergibt sich für die Amplitude am Ort des Bildes:

1 1 3 1 3 1 1 1 3 3, ) ( , ) ( / , / ) (x y U x y h x x M y y M dxdy U =

∫∫

+ + (2.4.1)

Darin steckt die Vergrößerung M = A/F mit dem Objektabstand (A), der Brennweite der Linse ( F )und die Amplitudenstreufunktion :

)) , ( ( ) , (x y f P x2 y2 h = (2.4.2)

Die Amplitudenstreufunktion beschreibt die Amplitude des elektromagnetischen Feldes, das am Ort der Linse durch die Pupillenfunktion P(x2, y2) verändert wird.

Bei der Berechnung der Punktstreufunktion in der Bildebene wird von der Abbildung eines hellen Punktes in einer sonst dunklen Objektebene ausgegangen, weshalb die Amplitude des Objektpunktes mit der Diracschen Deltafunktion beschrieben werden kann:

) ( ) ( ) , (x1 y1 x1 y1

U =δ δ . Die Pupillenfunktion P(ρ) wird mit der Koordinateρ=r /2 a als zirkular symmetrisch angenommen (Radius der Linse (a) und radiale Koordinate für die Linsenebene (r2)). Die Intensität ( I ) ist das Quadrat der Amplitude des elektromagnetischen Feldes 2 3 3 3 3, ) ( / , / ) (x y h x M y M I = (2.4.3)

(26)

20 MATERIAL UND METHODEN 2 1 0 ( ) 0( ) 2 ) (v =

P ρ J vρ ρ dρ I (2.4.4)

Daraus ergibt sich die Intensitätsverteilung in der Bildebene eines konventionellen Mikroskops durch: 2 ) 4 / ( ) 4 / sin( ) 0 , (     = u u u I und 2 ) ( 2 ) , 0 (       = v v J v I (2.4.5a,b)

wobei J die Besselfunktion 1.Ordnung, u die axiale und v die radiale optische Koordinate ist:

α λ π 2 sin 2 z u= und α λ π sin 2 r v= mit r= x2 +y2 , Numerische Apertur des Objektivs (NA= n sinα), reale axiale Koordinate (z), Wellenlänge

(λ), Brechungsindex der Objektivlinse ( n) und Öffnungswinkel (α).

Prinzip der konfokalen Laserscanning Mikroskopie

P M T Irisblende x y In der Fokusebene oberhalb der Fokusebene

Photomultiplier Zelle (mit Zellkern)

Strahl-scan System Licht-quelle (Laser) konfokale Ebene \ ] [ Objektkoordinaten

Bei der konfokalen Mikroskopie wird insbesondere die vertikale Auflösung durch die Punktlichtquelle und den Punktdetektor, einer Lochblende im vom Objekt kommenden Lichtweg, erhöht.

Wird die Punktlichtquelle mit einem punktförmigen Detektor kombiniert, deren Strahlengän-ge sich zwischen Objektiv und Fokusebene überlappen (bzw. mit Kondensor auf einander durch Spiegelung an Objektebene abbilden lassen) liefert das Produkt der Punktstreufunktio-nen für die Quelle und den Detektor die folgendermaßen modifizierte Intensitätsverteilung in der Bildebene: $EE  6WUDKOHQJDQJ EHLP NRQIRNDOHQ 0LNURVNRS LP 5HIOH[LRQV RGHU )OXRUHV]HQ]PRGXV /LFKW DXV GHQ (EHQHQ REHUXQG XQWHUKDOE GHV RSWLVFKHQ 6FKQLWWV ZLUG GXUFKGLH/RFKEOHQGHLP (PLVVLRQVOLFKWZHJ DXVJHEOHQGHW 'LH /LFKWTXHOOH XQG GHU 'HWHNWRU VLQG ÅSXQNW I|UPLJ´ GLH 2EMHNW VFKLFKW GHU RSWLVFKH 6FKQLWW ZLUG 9ROXPHQ HOHPHQW IU 9ROXPHQ HOHPHQWEHOHXFKWHW

(27)

KONFOKALE MIKROSKOPIE 21 4 ) 4 / ( ) 4 / sin( ) 0 , (     = u u u I und 4 ) ( 2 ) , 0 (       = v v J v I (2.4.6a,b)

Diese Überlappung zweier Punktstreufunktionen ist die Begründung für das höhere Auflösungsvermögen des konfokalen Mikroskops. Die Größe des beleuchteten Volumenele-ments ist abhängig von der Anregungswellenlänge und der Numerischen Apertur des Objektivs. Bei der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie bestimmt die Emissionswellenlänge die Ausdehnung der Punktstreufunktion des Detektors. Die Numerische Apertur ist im Fluoreszenz und Reflexionsbetrieb gleich (in beiden Fällen die des Objektivs).



$EE  6WUDKOHQJlQJH EHL NRQYHQWLRQHOOHU OLQNV  XQG NRQIRNDOHU UHFKWV  0LNURVNRSLH ÅSXQNWI|UPLJH´ /LFKWTXHOOH XQG ÅSXQNWI|UPLJHU´ 'HWHNWRU HUP|JOLFKHQ GLH ÅSXQNWZHLVH´ $XIQDKPH HLQHV %LOGHV YRQ GHU 2EMHNWHEHQH EHL GHU NRQIRNDOHQ 0LNURVNRSLH 'DGXUFK VHW]W VLFK GLH ,QWHQVLWlWVYHUWHLOXQJ LQ GHU %LOGHEHQH DXV GHP hEHUODSS GHU 3XQNWVWUHXIXQNWLRQHQ EHLGHU/LQVHQ]XVDPPHQZlKUHQGVLHVLFKEHLGHUNRQYHQWLRQHOOHQ+HOOIHOGPLNURVNRSLHDXVGHU 3XQNWVWUHXIXQNWLRQIUGLH2EMHNWLYOLQVHHUJLEW $EE  .RQIRNDOHU 6SRW 5HFKWV LVW GLH GHWHNWLHUWH ,QWHQVLWlWVYHUWHLOXQJ LQ D[LDOHU 5LFKWXQJ ]  ]X VHKHQ  YRQ UHFKWV  6LH LVW HLQH hEHU ODJHUXQJ GHU $QUHJXQJV XQG (PLVVLRQVLQWHQVLWlWVYHUWHL OXQJHQ GHU Å3XQNW´OLFKWTXHOOH XQG GHV Å3XQNW´GHWHNWRUV  XQGYRQOLQNV 

(28)

22 MATERIAL UND METHODEN d M = d /f . L a s e r L o c h b le n d e

2.4.1 Konfokale Laser Scanning Fluoreszenzmikroskopie

Bei der hier verwendeten konfokalen Laser Scanning Mikroskopie wird die Objektschicht nicht mit Lichtpulsen Volumenelement für Volumenelement bestrahlt, sondern der Anregungslichtkegel wandert während der Aufnahme eines Bildes mit dem Fokus im optischen Schnitt kontinuierlich durch die Probe. Ebenso wird die Fluoreszenz aus dem optischen Schnitt gemessen. Jedem Bildpunkt wird ein gemittelter Intensitätswert aus einem Volumenelement des Objekts zugeordnet, der am LSM 410 in digitales 8-bit-Format konvertiert wird (Intensitätsskala von 0-255).

Das Volumenelement, in dem fluoreszierende Moleküle detektiert werden, ist kleiner als bei konventioneller Fluoreszenzmikroskopie. Folglich trägt eine geringere Anzahl von Fluorophoren zu der Fluoreszenzintensität bei, die einem Bildpunkt zugeordnet wird. Dementsprechend höher müssen die Anregungsintensität pro Volumenelement und/oder die Detektorempfindlichkeit sein. Wegen der höheren Anregungsintensität können Sättigungsef-fekte des Fluorophors im Volumenelement eines optischen Schnitts auftreten.

$EE  'DV $XIO|VXQJVYHUP|JHQ GHV NRQIRNDOHQ 0LNURVNRSV KlQJW LQ D[LDOHU 5LFKWXQJ YRP4XDGUDWGHV'XUFKPHVVHUV G GHU/RFKEOHQGHDELQUDGLDOHU5LFKWXQJLVWHVOLQHDULQG 'HUURWJHIlUEWH%HUHLFKVWHOOWGLH+DOEZHUWVEUHLWHGHU,QWHQVLWlWVYHUWHLOXQJLPNRQIRNDOHQ6SRW V$EE GDU

A

(29)

KONFOKALE MIKROSKOPIE 23 Die folgende Abschätzung soll die Auswirkungen dieser Sättigungseffekte verdeutlichen. Sie dient dem Überblick über die Bedeutung der am Gerät einstellbaren Parameter. Die Geräteparameter können grob in Bestrahlungsdauer und -intensität unterteilt werden:

BESTRAHLUNGSDAUER/ VOLUMENELEMENT

INTENSITÄT/

VOLUMENELEMENT Zahl der Bildpunkte Laserintensität

Scandauer (Bestrahlungsdauer für eine Aufnahme)

Objektiv (Numerische Apertur) Mittelung über mehrere Bilder

Die optimale Einstellung der in apparaturbedingten Grenzen wählbaren Geräteparameter Scandauer, Laserintensität, Pixelzahl, Mittelung über mehrere Bilder und Wahl des Objektivs soll im folgenden abgeschätzt werden.

Das galvanometrisch betriebene Strahlscansystem erlaubt eine maximale Aufnahmerate von einem Bild aus 512² Bildpunkten pro Sekunde. Dabei werden die fluoreszierenden Moleküle in jedem Volumenelement, dessen Fluoreszenzintensität einem Bildpunkt zugeordnet wird, für die Dauer ment Volumenele vermögen Auflösungs Bildpunkte der Zahl Scandauer t = ⋅ (2.4.7)

angeregt. Hierbei muß beachtet werden, daß dieses Volumenelement nicht automatisch gleich dem Auflösungsvermögen ist. Die Zahl der Bildpunkte wird sinnvollerweise so eingestellt (bzw. das Objektiv so gewählt), daß das Volumenelement dem Auflösungsvermögen entspricht. hνex hνem Intersystem-Crossing S0 S1 T1 w12 w10 α Strah-lungslos w20 Ausbleichen Energie N1 N0 N2 $EE-DEORQVNLGL DJUDPP]XU(UOlXWHUXQJGHU %HVHW]XQJV]DKOHQ VFKHPD WLVFK  *UXQG]XVWDQG 1  LP DQJHUHJWHQ =XVWDQG 1  LP 7ULSOHWW]XVWDQG 1  XQG GHQ hEHUJlQJHQ $QUHJXQJ α  (PLVVLRQ XQG VWUDKOXQJVORVHU hEHUJDQJ Z  hEHUJDQJ LQ HLQHQ 7ULSOHWW]XVWDQG Z  PLW ODQJHU /HEHQVGDXHU 3KRVSKR UHV]HQ] Z $XVEOHLFKHQ

(30)

24 MATERIAL UND METHODEN Die endliche Lebensdauer τ des Fluorophors im angeregten Zustand (N1) limitiert die Anzahl der Übergänge w10 vom angeregten in den Grundzustand (N0) im Zeitintervall t. Außerdem wird die Anzahl der fluoreszierenden Moleküle durch Übergänge w12 in den Triplettzustand (N2) verringert, weil dessen Lebensdauer t überschreitet.

Unter der Annahme, daß die Lebensdauer im T1-Zustand lang gegen das Zeitintervall t ist und so alle Fluorophore, die in T1 übergehen für die Messung verloren sind, gilt es Scandauern zu verwenden, bei denen t < 1/w12 ist. Die maximale Besetzung des angeregten Zustands wird bei α >> w10 erreicht, wodurch das Kriterium für die ideale Bestrahlungsdauer pro Volumenelement wie folgt festgelegt werden kann: w10 < t < w12. Die Lebensdauer des angeregten Zustands ist für Fluoreszenzübergänge 10-6 bis 10-9s und für Übergänge in den Triplettzustand T1 10-5 bis 10s. Für lange Lebensdauer 1/w10 und eine hohe Übergangsrate

w12 ergibt sich dann für die ideale Scanzeit pro Volumenelement 10-6 < t < 10-5.

Wird die Bestrahlungsdauer pro Pixel nach dem Kriterium 1/w10 < t <1/w12, festgelegt läßt sich die Sättigungsintensität für die Probe mit Gl. 2.4.8 bestimmen [PAWJ90]:

ν σ σ τ I w h I F f 10 1 + ≈ (2.4.8)

mit Anregungsintensität (I), Molekularer Wirkungsquerschnitt des Fluorophors (σ), Fluores-zenzlebensdauer (τf), Plancksches Wirkungsquantum (h) und Energie der eingestrahlten

Fre-quenz (ν)

Folglich erreicht die Fluoreszenzintensität die Hälfte des Sättigungswertes FSat = 1/τf bei der eingestrahlten Intensität von ISat = w10 hν/σ. Setzt man diese Werte in Gl. 2.4.8 ein resultiert daraus die Gleichung zur Beschreibung der Farbstoffeigenschaften:

      + = I I F F Sat Sat 1 1 1 (2.4.9)

Die Sättigungsintensität kann mit verschiedenen Meßwerten F(1/I)-1 für eine Probe mit konstanter Farbstoffkonzentration am Ort der Messung bestimmt werden. Die Sättigungswer-te wurden nicht bestimmt, weil die Farbstoffkonzentration in den ExperimenSättigungswer-ten mit lebenden Zellen nicht so genau reproduzierbar ist. Wichtig ist vor allem, daß die verlängerte Bestrahlungsdauer mit Wirkungen auf die Probe verbunden ist, die besonders bei langen Scanzeiten auftreten. Bei einer Anhäufung der Fluorophore im T1-Zustand entstehen vermehrt Superoxidradikale bei der Wechselwirkung von molekularem Sauerstoff mit angeregten Farbstoffmolekülen [PAWJ90]. Die Auswirkungen der Variation der Scanzeit auf C6-Glioma-Zellen werden im Anhang A.XIV dokumentiert.

(31)

DIE MEßBEDINGUNGEN 25

2.5 Die Meßbedingungen

2.5.1 Versorgung der Zellen

Zur Messung der intrazellulären Ionenkonzentration wurden zwei verschiedene Apparaturen verwendet:

Œ Ein Fluoreszenzspektrometer mit einer Küvette, die den permanenten Austausch des die adhärenten Zellen umgebenden Mediums erlaubt [DÜSH96, SÄUB99, SKRS95].

ΠEin konfokales Laser Scanning Mikroskop mit einer perfundierbaren Zellkulturkammer (s. Abb. 2.5.1).

Die Perfusionseinheit am Fluoreszenzspektrometer wurde von B. Säume im Rahmen seiner Diplomarbeit für die Verwendung von Nährmedium zur Perfusion modifiziert. Bei den daran durchgeführten Experimenten für die vorliegende Arbeit wurden die Zellen mit hepesgepuf-fertem Tyrode superfundiert. Die Messungen am Fluoreszenzspektrometer wurden mit Hilfe des Meß- und Steuerungsprogramms von J. Gäting durchgeführt. Fluoreszenzintensitäten für zwei oder vier Anregungswellenlängen wurden in 30-s-Intervallen aufgenommen.

P e rfu n d ierb a re r O b je k trä g e r a u f e in e m s c h rittm o to rg e trie b e n e n O b je k th a lte r: B eg a su n g m it 1 0 % C O2 in s y nth etisch e r L u ft P erfu sio n m it v o rge he iz te m M ed iu m z .B . D M E M 1 0 % N C S O b je k tiv h e iz u n g , T e m p e rie rt ü b er W a sse rb a d B eh e izte D o p p elg las d e ck p latte

Z e lle n

37°C

$EE  'LH 6HLWHQDQVLFKW GHV SHUIXQGLHUEDUHQ 2EMHNWWUlJHUV IU GLH 0HVVXQJ DQ DGKlUHQWHQ =HOOHQ LQ  +\GURJHQNDUERQDWSXIIHU EHJDVW PLW YRUJHKHL]WHU XQG ZDVVHUGDPSIJH

VlWWLJWHUV\QWKHWLVFKHU/XIWPLW&2'LH0HGLXPYHUVRUJXQJILQGHWEHUGQQH.DSLOODUHQ

VWDWW RUDQJHP3IHLOIROJHQG 6LHZLUGQXUVSRUDGLVFKEHQXW]WXPGDV0HGLXPDXV]XWDXVFKHQ hEHUGLHSRU|VH3ODWWH RUDQJHZHL‰ ZLUGGDVK\GURJHQNDUERQDWJHSXIIHUWH0HGLXPEHUGHQ =HOOHQ PLW GHU %HJDVXQJ JUQHP 3IHLO IROJHQG  HTXLOLEULHUW 'LH EHKHL]WH *ODVGHFNSODWWH YHUKLQGHUW 1LHGHUVFKODJ bQGHUXQJ GHU 2VPRODULWlW GHV 0HGLXPV  XQG HUP|JOLFKW 'XUFKOLFKWDXIQDKPHQ0LWGHU7HPSHULHUXQJEHUHLQHQDQHLQ:DVVHUEDGDQJHVFKORVVHQHQ +HL]NUHLVODXI EODX ZLUGGLH3UREHQWHPSHUDWXUVWDELODXIƒ&JHKDOWHQ

(32)

26 MATERIAL UND METHODEN

2.5.2 Konfokale Laser Scanning Mikroskopie mit dem LSM 410

Die mikrofluorimetrische Messung der intrazellulären Ionenkonzentrationen wurde insbesondere unter dem Aspekt minimaler Beeinflussung der C6-Glioma-Zellen durch die Meßbedingungen realisiert. Es wurde von D. Yew gezeigt, daß die Bestrahlung mit Lasern Veränderungen der Morphologie hervorruft [YEWD90]. Die Mechanismen aufzuklären war nicht Thema dieser Arbeit, aber es wurde mit möglichst geringen Bestrahlungsdosen gearbeitet (vgl. Anhang A.XIV).

Das bedeutet im einzelnen:

- Die Laser mit weniger als 10 % der maximalen Leistung verwendet, beim HeNe-Laser höchstens 10 % von 1 mW = 0,1 mW, beim Ar-Laser höchstens 3 % von 25 mW = 0,75 mW, solange nicht anders gekennzeichnet wurden 0,03 mW des HeNe-Lasers und 0,45 mW des Ar-Lasers verwendet.

- Die Zahl der Bildpunkte wurde, wenn nicht anders gekennzeichnet auf 512² eingestellt. - Die Scandauer pro Bild war immer < 5 s, wenn nicht anders gekennzeichnet 1 s.

- Der Zoomfaktor ist 1

Das Zoom bedeutet in diesem Fall Verringerung der Objektfläche, über die die galvanomet-risch betriebenen Spiegel des Strahlscansystems den Laserfocus bei gleichbleibender Zahl der Bildpunkte bewegen.

Die Bedeutung der Bestrahlungsdauer / Bildpunkt ist im Theorieteil genauer erläutert (s. Kapitel 2.4, vgl. Abb. 3.3.12 und Anhang A.XIV). Sie wurde so gewählt, daß das Ausblei-chen der verwendeten Fluorophore gering blieb, bei den ionensensitiven Fluorophoren SNARF-1 und Fluo-4 sogar klein gegen den Fluorophoraustransport aus den Zellen. Bei der Wahl der Meßbedingungen muß außerdem zwischen folgenden Meßgrößen abgewogen werden:

1. Zeitliche Auflösung und Anzahl der beobachteten Probenregionen 2. Zeitliche und Räumliche Auflösung

3. Räumliche Auflösung und Vergrößerung

Die Meßintervalle des konfokalen Laser Scanning Mikroskops können auf 1s für ein Bild mit 512² Punkten begrenzt werden. Die sichtbaren Veränderungen in den Zellen passieren auf der Minutenskala, so daß mit 2-min-Intervallen während der Streßphasen bis zu fünf verschiedene Regionen mit dem automatisch verschiebbaren Objekttisch am LSM 410 angesteuert werden konnten. Alle Messungen wurden mit einem 63fach Ölimmersionsobjektiv durchgeführt. Je nach Zelldichte sind bis 50 Zellen in einer ROI zu sehen (zu Auswirkung der Bestrahlung s. Anhang A.XIV).

Die hohe räumliche Auflösung ermöglicht die bestmögliche Trennung von kompartimentier-tem und zytoplasmatischem Farbstoff. Fluo-4 selbst kompartimentiert wenig, wichtig war

(33)

DIE MEßBEDINGUNGEN 27 diese Auflösung für simultane Messung mit der Membranpotentialsonde TMRM (s. Kapitel 3.3).

Für das LSM 410 mit schrittmotorgetriebenem, verschiebbarem Objekttisch wurde je nach Anforderung die Anwendbarkeit von Steuerungsprogrammen genutzt.

Allen gemeinsam ist die Implementierung der Autofokus Funktion und die Kontrolle der Lage der radialen konfokalen Ebene durch die darauffolgende axiale Aufnahme. So konnten Fehlinterpretationen von Intensitätsänderungen durch Verschiebung des Objekts vermieden werden. P M 1 P M 2 P M 3 D ur ch lich t-de te k to r L B E F D S T 3 D S T 2 D S T 1 D S T = D ic hro itis c he r S t rah lte ile r D S V = D ic hro itis c he r

S t rah lv ere inig er E F = E m is s i on s fi l te r L B = L o c hb len d e P M = P h o to m ultip lie r O b jek t iv lins e R ef le k to r P rä pa ra t S tra h l-S c a n -S y s te m x y D S V D S V In t er ne r La s er E x te rn er La s er K o n fo k a le F lu o re s ze n zm ik ro s k o p ie , L S M 4 1 0 : R G B 4 8 8 n m 5 4 3 n m ,QWHUQHU /DVHU e x te rn e r

$EE  GHU VFKHPDWLVFKH $XIEDX GHV /60  9RP $U/DVHU ZXUGH GLH  QP /LQLH ]XU $QUHJXQJYRQ)OXRXQG'&)YHUZHQGHW'LHQP/LQLHGHV+H1H/DVHUVLVWIUGLH$QUHJXQJ YRQ 7050 XQG 61$5) JXW JHHLJQHW 'XUFK HLQHQ GLFKURLWLVFKHQ 6WUDKOYHUHLQLJHU ZLUG GDV $QUHJXQJVOLFKWEHUGHQGLFKURLWLVFKHQ6WUDKOWHLOHUXQGGDV6WUDKOVFDQV\VWHPPLWGHP2EMHNWLYDXI GLH 3UREH IRNXVVLHUW (LQ 7HLO GHV )OXRUHV]HQ]OLFKWV QLPPW GHQ VHOEHQ :HJ LQ HQWJHJHQJHVHW]WHU 5LFKWXQJELV]XPGLFKURLWLVFKHQ6WUDKOWHLOHU'HQSDVVLHUWHVDXIJUXQGGHUOlQJHUHQ:HOOHQOlQJHXQG ZLUGGDQQHQWVSUHFKHQGGHU:HOOHQOlQJHQGHU]XGHWHNWLHUHQGHQ)OXRUHV]HQ]DXIPLW6WUDKWHLOHUQGLH GUHL3KRWRPXOWLSOLHUJHOHQNW9RUKHUZLUG/LFKWDXVEHUXQGXQWHUGHUNRQIRNDOHQ(EHQHOLHJHQGHQ 3UREHQUHJLRQHQ GXUFKGLHIU MHGHQ .DQDO HLQ]HOQ HLQVWHOOEDUHQ ,ULVEOHQGHQ DXVJHEOHQGHW :HUGHQ ZHQLJHUDOVGUHL)OXRUHV]HQ]NDQlOHEHQ|WLJWNDQQJOHLFK]HLWLJHLQ²QLFKWNRQIRNDOHV²'XUFKOLFKWELOG DXIJH]HLFKQHWZHUGHQ

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