Auswertung der fluoreszenzmikroskopischen

In diesem Unterkapitel wird zunächst auf die Methode der simultanen Messung der [Ca²⁺]_i und des Zustandes der Mitochondrien eingegangen. Anschließend wird die Auswertungsme-thode am Beispiel eines Kontrollexperiments mit der Bildverarbeitungssoftware „Interactive Data Language“ erläutert (IDL, [HÄRS00], s. Anhang A.XI). Danach werden die Ergebnisse

$EE 'LH 0LWRFKRQGULHQ VLQG DQ GHU >&D@L5HJXODWLRQ DOV YRUEHUJHKHQGH 3XIIHU EHWHLOLJW 'LH >&D@ GHU PLWRFKRQGULDOHQ 0DWUL[ >&D@0 VWHXHUW GLH *HVFKZLQGJNHLW YRQ

=LWURQHQVlXUH]\NOXV XQG $WPXQJVNHWWH 'LH DQ GHU >&D@05HJXODWLRQ EHWHLOLJWHQ &D 7UDQVSRUWV\VWHPH VLQG EODX GLH (OHNWURQHQWUDQVSRUWNHWWH .RPSOH[ ,,9 URW GDUJHVWHOOW 'LH 6W|FKLRPHWULHGHU7DXVFKHULVW1D&D+&DXQG1D+'HU8QLSRUWVRUJWIUGLH PHPEUDQSRWHQWLDOJHWULHEHQH$XIQDKPHYRQ&D,P*HJHQVDW]]XP8QLSRUWLVWGHUVFKQHOOH (LQWUDQVSRUW5D0IUÅUDSLGXSWDNHPRGH´QXUZlKUHQGGHUHUVWHQ3KDVHHLQHU]\WRVROLVFKHQ

&D$QWZRUW DNWLY $XVWUDQVSRUWLHUW ZHUGHQ &D EHU GLH 7DXVFKHU RGHU EHU GLH PLWR FKRQGULDOH 3RUH GHUHQ =XVDPPHQVHW]XQJ QRFK XPVWULWWHQ LVW $17 $GHQLQ1XNOHRWLG 7UDQVORNDWRU9'$& 6SDQQXQJVDEKlQJLJHU$QLRQHQNDQDO3RULQ 3RUHQELOGHQGHV3URWHLQLQ GHUlX‰HUHQ0LWRFKRQGULHQPHPEUDQ%FO 3RUHQLQKLELWRU%D[ 3RUHQSURPRWRU

ERGEBNISSE

54

zum Zustand der Mitochondrien bei oxidativem Streß dargestellt. Um den Bezug zur simultanen Messung der [Ca²⁺]i herzustellen wird eine Auswahl der fluoreszenzmikroskopi-schen Aufnahmen mit TMRM (Zustand der Mitochondrien) und Fluo-4 ([Ca²⁺]i) zu jeder Grafik präsentiert (vgl. Kapitel 3.3.1). Dadurch ist die Möglichkeit gegeben, Korrelationen der Meßgrößen in einzelnen Zellen zu verfolgen. Am Schluß dieses Unterkapitels werden die wichtigsten Ergebnisse in Tabellenform dargestellt.

Die Methode zur simultanen Detektion des Zustands der Mitochondrien und der intrazellulären Konzentration freier Kalziumionen

Der Zustand der Mitochondrien läßt sich mit Hilfe einer TMRM-Färbung bestimmen. Der kationische und membranpermeable Fluorophor verteilt sich entsprechend der Nernstglei-chung in den Kompartimenten, die von einer Membran getrennt sind. Mitochondrien mit intaktem Membranpotential heben sich wegen der ca. 2000fachen TMRM-Konzentration im Inneren, der Matrix, deutlich vom Zytoplasma auf dem fluoreszenzmikroskopischen Bild ab (Gl. 2.3.8).Bei der simultanen Messung der TMRM- und Fluo-4-Fluoreszenz tritt folgendes Problem auf:

Die Emissionsspektren von Fluo-4 und TMRM in Suspension überlagern sich bei ei-ner Anregung mit 488 nm zwischen 570 und 700 nm. Die TMRM-Fluoreszenz soll am konfokalen Laser Scanning Mikroskop aber mit Hilfe eines Langpaßfilters für Wellen-längen > 570nm gemessen werden.

Da die Fluoreszenz von TMRM nur in bezug auf den Zustand der Mitochondrien betrachtet wird, reicht es aus, den Anteil von Fluo-4 für die Regionen intakter Mitochondrien zu minimieren:

Bei simultaner Anregung von TMRM mit 488nm und nahe dem Absorptionsmaximum mit 543 nm sinkt der Anteil der Fluo-4-Fluoreszenz auf 10% der TMRM-Fluoreszenz mit gleichen Anregungsintensitäten bei 488nm und 543 nm (s. Anhang A. I).

In den intakten Zellen sind die Konzentrationsverhältnisse anders, als in Suspension, wo 300 nM TMRM und höchstens 200 nM Fluo-4 vorliegen.

Da sich TMRM entsprechend der Nernstgleichung im Zytoplasma und in den Mito-chondrien anreichert, entspricht die Konzentration von TMRM in den MitoMito-chondrien mit bis zu 10 mM dem 50fachen der Fluo-4-Konzentration ([ATHO91], s. Gl. 2.3.7 und 8). Die Anregungsintensität von 0,45 mW bei 488 nm gegenüber 0,03 mW bei 543 nm am Laser Scanning Mikroskop führt zu einem Anteil von 1,25 % Fluo-4-Fluoreszenz an der Fluo-4-Fluoreszenzintensität von TMRM im Emissionsspektrum oberhalb von 570 nm am Ort der Mitochondrien. Diese Abschätzung beruht auf dem Maximal-wert der Ca²⁺-abhängigen Fluoreszenz von Fluo-4, die dem 80 bis 100fachen des Mi-nimalwertes entspricht (s. Material und Methoden, Tabelle 2.3.1 und Anhang A. I und II). Eine [Ca²⁺]i-Erhöhung macht sich also nur in Bereichen des Zellkerns und des Zy-toplasmas ohne Mitochondrien bemerkbar. Intakte Mitochondrien heben sich im

fluo-BOTENSTOFF KALZIUM 55 reszenzmikroskopischen Bild auch bei gleichzeitiger Messung der [Ca²⁺]i mit Fluo-4 deutlich von Zytoplasma und Zellkern ab.

Mit TMRM gefärbte Regionen sind auf den Bildsequenzen zu den im Folgenden präsentierten Ergebnissen mit der Intensitätsskala von dunkelrot bis hellgelb zu erkennen. Die im zweiten Kanal simultan aufgenommene Fluoreszenz des [Ca²⁺]_i-sensitiven Fluo-4 ist auf den Bildfolgen mit der Intensitätsskala von blau über grün, gelb, rot bis rosa für den Maximalwert zu sehen. Diese Intensitätsskalen wurden für alle folgenden Darstellungen axialer und horizontaler optischer Schnitte gewählt (s. Abb. 3.3.10, zur Meßmethode s. Kapitel 2.3 bis 2.5).

$EE

,QWHUSUHWDWLRQVKLOIH]X

%LOGIROJHQ]XP

=XVWDQGGHU 0LWRFKRQGULHQXQG GHU>&D@L

,Q GHQ %LOGHUQA XQG C LVW GLH URW ELV JHOE GDUJHVWHOOWH ODWHUDOH ,QWHQVLWlWVYHUWHLOXQJ GHU 7050)OXRUHV ]HQ]LQ%LOGBGLHGHU )OXR)OXRUHV]HQ]

GHUVHOEHQ =HOOSR SXODWLRQ ]XU VHOEHQ

=HLW]XVHKHQ

%HLP 9HUJOHLFK GHU =HOOHQ PLW KRKHU >&D@L )OXR XQG GHV 0LWRFKRQGULHQVWDWXV 7050 )OXRUHV]HQ] ZLUG GHXWOLFK GD‰ LQ =HOOHQ PLW KRKHU )OXR)OXRUHV]HQ] GLH =HOONHUQUHJLRQHQ RKQH 0LWRFKRQGULHQ KHOOHU VLQG DOV LQ GHQ =HOOHQ PLW QLHGULJHU >&D@L REHQ 'LH 6LJQDOH N|QQHQ DP NRQIRNDOHQ /DVHU 6FDQQLQJ 0LNURVNRS JHWUHQQW ZHUGHQ zu C: 0XVWHU ]XP ,GHQWLIL]LHUHQLQWDNWHU =HOOHQ PLW SHULSKHUHQ LQWDNWHQ 0LWRFKRQGULHQ +LHU ZLUG DX‰HUGHP HLQ

%H]XJ]XU6HJPHQWLHUXQJPLW,'/XQG]XU$XVZHUWXQJKHUJHVWHOOWGHULQGLHVHP.DSLWHOYHUWLHIW ZLUG

ERGEBNISSE

56

Vier Parameter zur Bestimmung des Zustands der Mitochondrien einer Zellpopulation Um die Korrelation von Änderungen der [Ca²⁺]i mit dem Zustand der Mitochondrien nachzuweisen, wurden die Werte von vier Parametern zur quantitativen Auswertung der TMRM-Fluoreszenz bestimmt:

1. Die gesamte Intensität der Regionen (F_g), die sich durch erhöhte TMRM-Fluoreszenz deutlich vom zellulären Hintergrund abheben, gleichbedeutend mit intakten Mitochond-rien, ist:

∑

=

= ^m

i i

g F p

F

1

)

( 3.3.2)

mit der Fluoreszenzintensität im i-ten von insgesamt m Bildelementen (pi), die als intakte Mito-chondrien identifiziert wurden (F(pi))

2. Die gesamte Fläche (A_g) aller Regionen mit intakten Mitochondrien entspricht der Summe aller als solche erkannten Bildelemente (p) ist:

m p A

m

i i

g =

∑

=

=1

(3.3.3) Fläche des Bildelements pi auf 1 normiert

3. Die mittlere Intensität (Fd) der als intakte Mitochondrien definierten einzelnen Regionen ist:

∑ ∑

∑

=

=

= ^N = j

n

k k n

k

k

d _j

j

p p F F N

1 1 1

) 1 (

(3.3.4)

mit Anzahl der Bildpunkte der zusammenhängenden Fläche mit dem Index j (nj), mit Fluoreszenz-intensität im k-ten von insgesamt nj Bildelementen (pk), die als intakte Mitochondrien identifiziert wurden (F(pk))

4. Die Anzahl (N) ist die Anzahl der zusammenhängenden Regionen intakter Mitochondrien bzw. Mitochondriengruppen, wie sie mit der Segmentierung identifiziert wurden.

Die Parameter 1. bis 4. lassen sich durch die Segmentierung der Bilder in Regionen mit und ohne intakte Mitochondrien bestimmen. Für die Segmentierung der Fluoreszenzaufnahmen in Regionen mit intakten Mitochondrien wurde ein Bildverarbeitungsprogramm von S. Härtel angewendet, das auf der Programmiersprache IDL basiert. Dieses Programm enthält verschiedene Segmentierungsverfahren, von denen hier ein Algorithmus eingesetzt wurde, der die Intensitätsunterschiede eines Bildpunktes zu seinen Nachbarn in einem Ring mit dem Innenradius ri und dem Außenradius ra auswertet (Skalierungs-Index-Methode oder α -Transformation, s. [HÄRS00]). Durch die Wahl geeigneter r_i und r_a konnten Bereiche mit großen Intensitätsschwankungen (intakte Mitochondrien) von Bereichen homogener Intensität (Zellkerne, Zytoplasma, Hintergrund) getrennt werden. Diese Methode hat den Vorteil, daß auch Bereiche mit geringer absoluter Intensität als intakte Mitochondrien erkannt werden,

BOTENSTOFF KALZIUM 57 solange der Intensitätsunterschied zur Umgebung groß genug ist. Ein Beispiel für die Ergebnisse der Segmentierung mit der α-Transformation ist in Anhang A.XI zu finden (s.

Abb. A.XI.1, vgl. Abb. 3.3.10). Im Anschluß wird dieses Auswerteverfahren auf die Experimente, die zur Untersuchung der [Ca²⁺]_i und des Mitochondrienzustands bei oxidativem Streß durchgeführt wurden, angewandt.

Schema der Auswertung

Das Auswertungsverfahren wird im Folgenden an einem Kontrollexperiment vorgestellt.

$EE (UOlXWHUXQJ ]XU 'DUVWHOOXQJVZHLVH LQ $EE XQG LP

$QKDQJ$XIVI'LDJUDPP]XU'DUVWHOOXQJGHU.LQHWLNHQYRQGXUFKVFKQLWWOLFKHU)OXRUHV]HQ]

SUR )OlFKH )G JHVDPWH )OXRUHV]HQ]LQWHQVLWlW )J $Q]DKO 1 XQG )OlFKH $J 'LHVH YLHU 3DUDPHWHU GLHQHQ ]XU &KDUDNWHULVLHUXQJ GHV =XVWDQGV GHU 0LWRFKRQGULHQ 'LH .LQHWLN GHU 3DUDPHWHUZXUGHLQ.XUYHQIRUPGDUJHVWHOOWbQGHUXQJHQZXUGHQQXUDQGHQPDUNLHUWHQ3XQNWHQ DXVGHQ%LOGIROJHQEHUHFKQHWGLH.LQHWLNHQYRQ>&D@LXQGS+LN|QQHQDOV$QKDOWVSXQNWHIU GHQ9HUODXIEHLNU]HUHQ$XVZHUWXQJVLQWHUYDOOHQGLHQHQVLHKHV$EEXQG.DSLWHO II$[LDOHQRSWLVFKHQ6FKQLWWHGHU&KURQRORJLHYRQREHQQDFKXQWHQIROJHQGDQJHRUGQHW'LH ZHL‰HQ/LQLHQEHJUHQ]HQHLQH+|KHYRQ—PXQGGLHQHQ]XU$EVFKlW]XQJYRQbQGHUXQJHQ GHU =HOOK|KH 'LH ODWHUDOH $XVGHKQXQJ GHU =HOOHQ ZLUG LQ 5HODWLRQ ]XP JUQHQ %DONHQ DEJHVFKlW]W—PIII'LHODWHUDOHQ6FKQLWWH]XP'LDJUDPPEHILQGHQGLHVLFKLPXQWHUHQ 7HLO GHU IROJHQGHQ $EELOGXQJHQ 'LH D[LDOHQ RSWLVFKHQ 6FKQLWWH ZXUGHQ V VSlWHU DOV GLH ODWHUDOHQDXIJHQRPPHQ'HQ%LOGEH]HLFKQXQJHQLQDOSKDEHWLVFKHU5HLKHQIROJHVLQGGLH=HLWHQ LPUHFKWHQXQWHUHQ7HLOGHU$EELOGXQJHQ]XJHRUGQHW

ERGEBNISSE

58

Die [Ca²⁺]i-Antwort der Zellen wurde im vorherigen Unterkapitel ausführlich behandelt. Sie konnte im Gegensatz zum Zustand der Mitochondrien für einzelne Zellen bestimmt werden.

Zur Verdeutlichung von korrelierten Änderungen der [Ca²⁺]i und des Zustands der Mitochondrien in den einzelnen Zellen enthalten die Abbildungen zu jeder Streßdosis eine Bildfolge. In der Kontrolle sind nur Bilder der TMRM-Fluoreszenz zu finden. In den Grafiken zur Wirkung von oxidativem Streß sind die gleichzeitig aufgenommenen Bildfolgen von Mitochondrienzustand und [Ca²⁺]i untereinander dargestellt. Die Abbildung 3.3.11 dient zur Erläuterung der Darstellung von Auswertung und Meßergebnissen.

Im Kontrollexperiment steigen Gesamtintensität (Fg) und -fläche (Ag) zunächst an und beginnen nach drei bis vier Stunden wieder auf den Ursprungswert bzw. sogar darunter zu fallen. Die Anzahl (N) der als intakte Mitochondrien erkannten Bildpunkte nimmt nach 4 h langsam ab, gleichzeitig sinkt A_g. Über die Dauer des gesamten Experiments nimmt nur die durchschnittliche Fluoreszenzintensität pro Region intakter Mitochondrien (F_d) zu. Auf den zugehörigen Bildern ist zu sehen, daß auch die mit Zellen bewachsene Fläche abnimmt (vgl.

Abb. 3.3.12, nur TMRM).

Im Anhang ist ein Kontrollexperiment präsentiert, bei dem sich die Zellen morphologisch wenig verändern, die Parameter N und Fd sind dort annähernd konstant. Die Begründung für die morphologischen Änderungen im hier präsentierten Kontrollexperiment liegt in der Bestrahlungsdosis und der höheren Mitoserate (s. Anhang A. XIV, Abb. A.XIV.).

Die Kontrolle der Lage des Objekts in axialer Richtung zeigt, daß die hier ausgewerteten Änderungen der Fluoreszenzintensitäten nicht durch De- und Refokussierung aufgrund von Mediumwechsel zustande kommen. Die von der Einstellung der Lochblende abhängige Auflösung in axialer Richtung (∆z) ist in der Abbildungsbeschriftung zu finden (vgl. Kapitel 2.4 und Abb. 2.4.1 und 2.4.4).

Es wird nach diesem ersten Schritt der Auswertung des Kontrollexperiments deutlich, daß die Kinetiken der einzelnen Parameter Korrelationen aufweisen. Warum ein Parameter allein nicht zur Charakterisierung des Zustands der Mitochondrien einer Population ausreicht, wird im Folgenden für den Fall gezeigt, daß keine Mitochondrien depolarisieren.

Im Verlauf des Experiments runden sich die Zellen bei der Mitose und bei der Mitose benachbarter Zellen etwas ab. Dadurch werden die Mitochondrien relativ zur Fokusebene verschoben. Mitochondrien haben ellipsoide bis zylindrische Formen (Hauptachsenlänge ≈ 1 µ m, elektronenmikroskopische Aufnahmen s. Anhang A. IX). In der Fokusebene nebeneinan-der liegende Mitochondrien können als getrennte Signale erfaßt werden.

BOTENSTOFF KALZIUM 59

Übereinander liegende Mitochondrien liefern beide einen Beitrag zur Fluoreszenz eines Bildpunktes, weil die vertikale Auflösung des konfokalen Laser Scanning Mikroskops in der für TMRM verwendeten Konfiguration entweder auf ∆z = 0,77 µm oder 1,06 µm eingestellt

I

II

III

$EE,P.RQWUROOH[SHULPHQWLVWVFKRQQDFKKHLQGHXWOLFKHU$QVWLHJGHU)OlFKHLQWDNWHU 0LWRFKRQGULHQ $J XQG GHU *HVDPWLQWHQVLWlW )J IHVW]XVWHOOHQ I: 'LH $Q]DKO 1 GHU DOV 0LWRFKRQGULHQ LGHQWLIL]LHUWHQ 5HJLRQHQ EOHLEW EHU K NRQVWDQW ZlKUHQG GLHGXUFKVFKQLWWOLFKH ,QWHQVLWlW )G HQWJHJHQ GHP 7UHQG GHU DQGHUHQ GUHL 3DUDPHWHU DXFK QDFK K NRQWLQXLHUOLFK ]XQLPPWII:'LHD[LDOHQ6FKQLWWH]HLJHQHLQHJHULQJH=XQDKPHGHU=HOOVFKLFKWGLFNHXQGGLHQHQ ]XU .RQWUROOH GHU /DJH GHU )RNXVHEHQH III: 'LH ]XJHK|ULJHQ %LOGHU ]HLJHQ GHQ =XVWDQG GHU

=HOOSRSXODWLRQPLW=HOOWHLOXQJHQPDUNLHUWGXUFKZHL‰H3IHLOH

ERGEBNISSE

60

wurde (s. Anhang A. VII). Drehungen der Mitochondrien relativ zur konfokalen Ebene bewirken ebenfalls eine Änderung von Fd (s. Abb. 3.3.13).

In den lateralen optischen Schnitten entstehen Freiflächen, wenn sich die Zellen zusammen-ziehen. Im axialen Schnitt wird deutlich, ob dies mit einer Abrundung der Zellen verbunden ist. Bei der Auswertung der Experimente zu oxidativem Streß werden deshalb die morpholo-gischen Veränderungen der Zellen berücksichtigt (Kontrollexperimente s. auch Anhang A.XIV).

Im hier präsentierten Kontrollexperiment führt die Zunahme der bewachsenen Fläche zunächst zu erhöhtem Fg und Ag. Nach 4h nehmen Fg und Ag mit der Zelldichte ab, obwohl Fd

kontinuierlich zunimmt. Die Zunahme von Fd ist auf die Überlagerung der Fluoreszenz aus intakten Mitochondrien oder deren Drehung relativ zur konfokalen Ebene zurückzuführen.

Denn die Zellhöhe nimmt während des Experiments zu, wie sich im axialen Schnitt verfolgen läßt. Diese Interpretation wird durch die Abnahme von N bestätigt.

$EE 0RUSKRORJLVFKH bQGHUXQJXQG

=XVWDQGGHU 0LWRFKRQGULHQ 'LH $XVGHKQXQJ GHU =HOOHQ LQ D[LDOHU 5LFKWXQJ YHUlQGHUW GLH 3DUDPHWHU)J)G

$J XQG 1 GHU GHWHNWLHUWHQ 0LWRFKRQGULHQ 'XUFK JOHLFK]HL WLJH'HWHNWLRQ

GHU )OXRUHV]HQ] DXV EHUHLQDQGHUOLHJHQGHQ 0LWRFKRQGULHQ HUK|KW VLFK GLH GXUFKVFKQLWWOLFKH ,QWHQVLWlW SUR )OlFKH )G 'LH $Q]DKO 1 QLPPW EHUHLWV DE ZHQQ GLH =HOOHQ EHJLQQHQ VLFK ]XVDPPHQ]X]LHKHQ XQG GLH JHVDPWH )OXRUHV]HQ] )J QRFK NRQVWDQW EOHLEW 'LH ZHLWHUH .RQWUDNWLRQIKUWGDQQ]XU $EQDKPHGHU)OlFKH$JXQGVSlWHU)J1XU)GQlKHUWVLFKHLQHP 6lWWLJXQJVZHUW 'LH )RUP GHV VHQVLWLYHQ 9ROXPHQV GHVVHQ )OXRUHV]HQ] HLQHP %LOGHOHPHQW ]XJHRUGQHWZLUGLVWGXUFKGLHNOHLQHKHOOEODXH(OOLSVHDQJHGHXWHW∆]LVWGLH'LFNHGHVRSWLVFKHQ 6FKQLWWV

BOTENSTOFF KALZIUM 61

Exkurs

zur Bedeutung der Parameter Fläche, Anzahl, Gesamtintensität und mittlere Intensität der als intakte Mitochondrien definierten Bildfläche und ihre Verwendung bei der Interpretation der Meßergebnisse zu oxidativem Streß.

Anzahl (N): Je mehr die Zellen zusammengezogen und abgerundet sind, desto schlechter lassen sich die Regionen mit Mitochondrien voneinander trennen (s. Abb. 3.3.13). In diesem Fall nimmt die Anzahl ab. Durch depolarisierte Mitochondrien, die ihre TMRM-Färbung verlieren, wird dieser Wert ebenfalls kleiner.

Fläche (A_g): Die Gesamtfläche intakter Mitochondrien bleibt konstant, auch wenn sich die Mitochondrien durch die Segmentierung nicht mehr voneinander trennen lassen. Sie verringert sich erst, wenn die Zellen sich weiter abrunden und dadurch intakte Mitochondrien übereinander geschoben werden oder wenn Mitochondrien die TMRM-Färbung durch Depolarisation verlieren.

Gesamtintensität (Fg): Fg verändert sich zum einen aus denselben Gründen wie die Fläche, zum anderen ist sie von der gesamten TMRM-Konzentration in der beobachteten Population abhängig. Steigt die Fluoreszenzintensität der Mitochondrien im Mittel wächst die F_g stärker als die Ag. Überlagern sich Mitochondrien bleibt die Fg solange konstant, wie die Dicke der Mitochondrienschicht unterhalb des Auflösungsvermögens in axialer Richtung bleibt. Fg sinkt also erst später als Ag, wenn sich die Zellen zusammenziehen.

Mittlere Intensität pro Region (Fd): Fd ändert sich nur bei Änderung der mittleren Fluoreszenzintensität aller als intakte Mitochondrien erkannten Flächen. Bei Hyperpolarisati-on des Membranpotentials der MitochHyperpolarisati-ondrien (∆ΨM) steigt Fd. Mitochondrien mit depolarisiertem ∆ΨM spielen für den Wert dieses Parameters keine Rolle mehr, F_d kann folglich ansteigen, auch wenn die Fg abnimmt. Ziehen sich die Zellen zusammen erreicht Fd

einen Sättigungswert, bei dem die Überlagerung der Mitochondrien nicht mehr zum Anstieg der Fluorophordichte im sensitiven Volumen beiträgt.

Zu F_d: Hyperpolarisation oder Überlagerung? F_d ändert sich mit der TMRM-Konzentration pro Volumenelement, dessen Fluoreszenz einem Bildelement zugeordnet wird (Voxel). F_d steigt also mit dem Anteil von Mitochondrien am Voxel und mit dem ∆ΨM der Mitochondrien im Voxel. Dabei geht die Vergrößerung des Mitochondrienvolumens pro Voxel bei konstanter Fluorophorkonzentration in den Mitochondrien linear in die Intensitäts-änderung ein. Die Hyperpolarisation bzw. die Depolarisation des ∆ΨM wirkt sich exponentiell auf die Intensität aus (s. Gl. 2.3.7). Bereits die Verdoppelung der Intensität führt aber zur Sättigung des Detektors aufgrund des begrenzten Empfindlichkeitsbereichs. Deshalb hat sowohl ∆ΨM als auch die Überlagerung deutliche Auswirkungen auf Fd.

ERGEBNISSE

62

Alle vier Parameter beziehen sich immer auf den ganzen mit der Mikroskopie betrachteten Ausschnitt der Zellpopulation im Objektträger. Die Standardabweichung der Fd ist bei allen Experimenten kleiner als die Markierung der Meßwerte in der Grafik (<3%). Die intakten Mitochondrien einer Population reagieren folglich homogen. Die Kinetiken der Parameter N, F_g und A_g sind typisch für jeweils mindestens 3 Experimente zur H₂O₂-Dosis mit und ohne EGTA.

Oxidativer Streß, [Ca²⁺]i und die Mitochondrien

Die Auswertungsmethode wird nun auf die Meßergebnisse zu oxidativem Streß angewendet.

Dabei handelt es sich um die sechs verschiedenen Untersuchungen, die bereits bezüglich der [Ca²⁺]_i ausgewertet wurden:

Zunächst werden die Ergebnisse zum oxidativen Streß mit 100, 250, und 500 µ M H2O2 für 30 min präsentiert. Dabei wird nach dem Schema in Abb. 3.3.10 vorgegangen. Danach wird die Wirkung des Ca²⁺-Chelators auf die Mitochondrien bei oxidativem Streß dargestellt, die mit den Nährmediumszusätzen nur EGTA zur Kontrolle, 250 und 500 µM H2O2, für 30 min mit dem Ca²⁺-Chelator im Medium durchgeführt wurden. Diese Experimente zeigen, welchen Einfluß der Einstrom von Ca²⁺ bzw. der Ca²⁺-Entzug durch EGTA auf den Zustand der Mitochondrien und der Zellen hat.

Nach den graphischen Darstellungen folgt eine tabellarische Auflistung der Ergebnisse, die auch die wichtigsten Werte der Messungen der [Ca²⁺]i während oxidativem Streß enthält. Am Ende des Kapitels werden die Folgerungen aus den Meßergebnissen in bezug auf die Dosisabhängigkeit der [Ca²⁺]i-Antwort und des Zustands der Mitochondrien bei oxidativem Streß zusammengefaßt.

Die hier präsentierten Ergebnisse zu oxidativem Streß basieren alle auf Experimenten, bei denen mit gleicher Laserintensität und Scandauer gearbeitet wurde (vgl. Kapitel 2.5.2). Auf die Aufnahme einer Reihe von übereinander liegenden lateralen optischen Schnitten wurde wegen der Auswirkungen auf die Zellpopulation verzichtet (Erklärung dazu s. Anhang A.XIV). Stattdessen werden die Veränderungen der Verteilung der Mitochondrien, die durch den axialen optischen Schnitt sichtbar gemacht werden, qualitativ in die Auswertung einbezogen (in allen Abb. Teil II, s. Tabelle 3.3.1).

Die Reproduzierbarkeit der vier Parameter zur Charakterisierung des Zustands der Mitochondrien einer Zellpopulation hängt außerdem entscheidend von der Lage der Fokusebene ab, die nach jeder Aufnahme mit dem axialen Schnitt kontrolliert werden konnte.

BOTENSTOFF KALZIUM 63

I

II

III

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ERGEBNISSE

64

I

II

III

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$QIDQJVZHUW$[LDOHRSWLVFKH6FKQLWWH(II)'LH'LFNHGHU=HOOVFKLFKWEOHLEWQDKH]XNRQVWDQWGLH 6FKLFKW ZLUG DEHU OFNHQKDIW /DWHUDOHRSWLVFKH6FKQLWWH(III): 'LH )OXR)OXRUHV]HQ]LQWHQVLWlW EOHLEWLQHLQLJHQ=HOOHQKOlQJHUDOVLP.RQWUROOH[SHULPHQWHUKDOWHQ]%ZHL‰H3IHLOH,QGHQ KQDFKGHP6WUH‰JLEWHVNHLQH=HOOWHLOXQJHQPHKU'HUJUDXH3IHLOPDUNLHUWHLQH=HOOHGLH DXIJUXQG YRQ ,RQRP\FLQ HLQH (UK|KXQJ GHU >&D@L JHNRSSHOW PLW 0LWRFKRQGULHQYHUOXVW HUOHLGHW%LOG+

BOTENSTOFF KALZIUM 65

$EE=XVWDQGGHU0LWRFKRQGULHQEHL—0+2(I)—0+2YHUXUVDFKHQHLQH IUKHUH DEHU ZHQLJHU VWDUNH $EQDKPH GHU DOV LQWDNWH 0LWRFKRQGULHQ HUNDQQWHQ *HVDPWIOlFKH

$JXQGLQWHQVLWlW)JDOV—0'LHPLWWOHUH,QWHQVLWlW)GXQGLQVEHVRQGHUHGLH$Q]DKO1 EOHLEHQELV]XP([SHULPHQWHQGHK|KHUDOVGHU$QIDQJVZHUW$[LDOHRSWLVFKH6FKQLWWH(II)'LH 'LFNH GHU =HOOVFKLFKW EOHLEW QDKH]X NRQVWDQW /DWHUDOH RSWLVFKH 6FKQLWWH (III): 'LH )OXR )OXRUHV]HQ]DXVGHQLQWDNWHQ=HOOHQYHUVFKZLQGHWQDFKKIDVWYROOVWlQGLJ'LH7HLOXQJVIl KLJNHLW EOHLEW HUKDOWHQ LVW DEHU YHUULQJHUW ZHL‰HU 3IHLO =HOOHQ GLH QRFK )OXR)OXRUHV]HQ]

]HLJHQYHUOLHUHQJHJHQ(QGHGHV([SHULPHQWVGLHLQWDNWHQ0LWRFKRQGULHQJUDXHU3IHLO

I

II

III

ERGEBNISSE

66

Beschreibung wichtiger Meßergebnisse bei oxidativem Streß:

Während der Dauer der Experimente stirbt nur bei 500 µM H2O2 ein großer Teil der untersuchten Populationen. Die Chronologie der Ereignisse bei Zellen, die innerhalb der Dauer des Experiments sterben, läßt sich in sechs Stadien einteilen:

1. Erhöhung der [Ca²⁺]_i

2. Erhöhung der TMRM-Fluoreszenz pro Region, F_d steigt an

3. Einziehen der Dendriten und Schrumpfen des Zellkerns, Ag und N sinken (Durchlicht, ohne Abb.)

4. Verlust der TMRM-Fluoreszenz, Fg, Ag und N sinken

5. Anhaltende Erhöhung der [Ca²⁺]i bis die Plasmamembran an einigen aufgeblähten Stellen der Zelle platzt

6. Verlust der Fluoreszenzsonde für die [Ca²⁺]_i (Fluo-4)

Diese Abfolge entspricht den Ereignissen eines onkotischen Zelltods. Je geringer die H₂O₂ -Dosis, desto geringer ist auch die Anzahl der Zellen, die die Onkose (bzw. onkotische Nekrose) während der Dauer des Experiments durchlaufen. Gleichzeitig ist auch der Anteil der Zellen mit dauerhaft erhöhter [Ca²⁺]i geringer (zum Begriff Onkose vgl. [DARZ97], s.

Abb. 4.2.1 und vgl. Anhang Abb. A.XII, Bild D16).

Der Parameter Fd sinkt nach dem starken Anstieg, der durch die Inkubation mit 500 µM H2O2

ausgelöst wurde, nur geringfügig. Die Überlagerung von Mitochondrien im optischen Schnitt kann zur Erhöhung von F_d beitragen, da die Zellen zusammengezogen sind (s. Abb. 3.3.14 und vgl. Abb. 3.3.13).

100 µM H2O2 führen zunächst zu einer stärkeren Abnahme der Gesamtfläche (Ag) und Gesamtintensität (Fg) als 250 µM H2O2. Die Anzahl N wächst hingegen stark und auch die mittlere Fluoreszenzintensität (Fd) steigt an. Die Verteilung der Mitochondrien in den Zellen ändert sich also bei 100 µ M weniger als bei 250 µ M. Wie groß der Anteil der Hyperpolarisa-tion des ∆ΨM am Anstieg von Fd ist, läßt sich aufgrund der Ergebnisse bei 250 µM H2O2 nicht sagen. Der ähnliche Verlauf von Fg und Ag bei 100 µM H2O2 spricht dafür, daß die Erhöhung von F_d auf die Hyperpolarisation des ∆ΨM zurückzuführen ist (s. Abb. 3.3.15 und 16, vgl.

Exkurs zu den Parametern).

Die gemessene Anzahl (N) steigt auch, wenn die wirkliche Anzahl in der mit 100 µM H2O2

behandelten Population konstant bleibt oder sich verringert. Der Grund dafür ist, daß durch die α-Segmentierung mehr voneinander getrennte Regionen mit intakten Mitochondrien gefunden werden, da die Schrumpfung oder auch die Depolarisation des ∆ΨM einzelner Mitochondrien den Abstand zwischen den Mitochondrien vergrößert. Außerdem ziehen sich die einzelnen Zellen weniger zusammen als bei den höheren H₂O₂-Dosierungen, wodurch sich die intakten Mitochondrien im optischen Schnitt weniger überlagern.

BOTENSTOFF KALZIUM 67 Oxidativer Streß ohne Ca²⁺-Einstrom durch die Plasmamembran

Im Folgenden wird untersucht, welchen Einfluß die Verhinderung des Eintransports von Ca²⁺

aus dem Medium auf den Zustand der Mitochondrien hat. Experimente in Nährmedium ohne freie extrazelluläre Ca²⁺ konnten nur mit Zugabe von EGTA (oder BAPTA) durchgeführt werden, weil Nährmedium mit 10 % Serum nicht Ca²⁺-frei ist. Die Herabsetzung der Konzentration ungebundener Ca²⁺ im Medium führt zu morphologischen Veränderungen in den Zellen. Die mittlere TMRM-Fluoreszenz pro Region mit intakten Mitochondrien (Fd) bleibt konstant, die Zellen ziehen sich aber zusammen (Abb. 3.3.17, F_d in Teil I und axiale und radiale Schnitte in Teil II und III). Dies hat eine irreversible Abnahme der Gesamtfläche (A_g) der intakten Mitochondrien für die Dauer des Experiments zur Folge, obwohl sich die Zellen nach der Reperfusion wieder ausdehnen (s. Anzahl (N) in der Grafik aus Abb. 3.3.17).

Die intrazellulären Auswirkungen von H2O2 ohne [Ca²⁺]ex wurden für 30 min, 250 µM und 1 h Erholungszeit sowie 30 min, 500 µM H2O2 und 4 h Erholungszeit bestimmt. Dabei wurden die Ca²⁺-Chelatoren jeweils 15 min vor und nach der Inkubation von H2O2 im Medium belassen, so daß sich die Effekte zu den Zeiten der Streßinduktion und der Reperfusion nicht überlagerten. Der Reperfusion des Objektträgers mit Nährmedium ohne Ca²⁺-Chelatoren folgt in allen Experimenten ein vorübergehender Anstieg der [Ca²⁺]_i (s. Abb. 3.3.6-8 und 3.3.17-9, Teil (III)).

Die Kombination von 4 mM EGTA mit 250 µM H2O2 führt in der einstündigen Erholungs-phase nicht zu Nekrose, die Zellen haben nach einer Stunde einen etwas besseren Zustand als direkt im Anschluß an die Reperfusion mit Kulturmedium (Fläche der intakten Mitochondrien Ag). Allerdings ist die Schrumpfung im selben Zeitintervall stärker als ohne EGTA und irreversibel. Der Zustand der Mitochondrien bezüglich aller vier Parameter ist mit EGTA schlechter als ohne (s. Tabelle 3.3.1).

4 mM EGTA und 500 µM H₂O₂ verursachen innerhalb der Streßphase bereits eine starke Abnahme der Fg und Ag sowie N, aber eine Zunahme von Fd. Die Abnahme der Fg und Ag ist geringer und Fd ist weniger angestiegen als bei 500 µM H2O2 ohne EGTA.

ERGEBNISSE

68

I

II

III

$EE , =XVWDQG GHU 0LWRFKRQGULHQ EHL P0 (*7$ (I) 'HU &D&KHODWRU (*7$

YHUULQJHUW GLH )OlFKH $J XQG $Q]DKO 1 GHU 0LWRFKRQGULHQ ZHLO GLH =HOOHQ VLFK DEUXQGHQ 'DEHL VWHLJW GLH GXUFKVFKQLWWOLFKH ,QWHQVLWlW )G NDXP 'LH JHVWULFKHOWHQ /LQLHQ UHFKWV LQ GHU

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=HOOHEHUOHEWGXQNHOJUDXHU3IHLO=HOOHVWLUEW

BOTENSTOFF KALZIUM 69

III

$EE,=XVWDQGGHU0LWRFKRQGULHQPLWP0(*7$EHL—0+2(I)—0+2

JHSDDUWPLWP0(7*$YHUXUVDFKHQHLQHVWlUNHUH6FKlGLJXQJYRQ0LWRFKRQGULHQDOV—0 +2DOOHLQ'LHGXUFKVFKQLWWOLFKH,QWHQVLWlW)GVWHLJWDXIDEHUGLH*HVDPWLQWHQVLWlW IOlFKH XQG $Q]DKO )J $J XQG 1IDOOHQ VWlUNHU DOV RKQH GHQ &D&KHODWRU $P (QGH GHV ([SHULPHQWV ZLUNW VLFK GLH (LFKXQJ YRQ )OXR PLW ,RQRP\FLQ XQG (*7$ QHJDWLY DXI GHQ

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=HOOK|KH]XXQGGLH%UHLWHDEQLPPW /DWHUDOHRSWLVFKH6FKQLWWH (III): 'LH6FKUXPSIXQJHLQLJHU

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$QGHUHEOHLEHQLQWDNWJUR‰H(OOLSVHYJO>&D@LLQ$EE

II I

ERGEBNISSE

70

II I

III

$EE =XVWDQGGHU0LWRFKRQGULHQPLWP0(*7$EHL—0+2(I)P0(*7$

LQ.RPELQDWLRQPLW—0+2EHZLUNHQHLQ$EQDKPHGHU$Q]DKOLQWDNWHU0LWRFKRQGULHQ1 XQG*HVDPWIOlFKH$JXQGLQWHQVLWlW)J'LHGXUFKVFKQLWWOLFKH)OXRUHV]HQ]LQWHQVLWlW)GVWHLJW DQ XQG EOHLEW HUK|KW $[LDOH (II): $E %LOG % LVW ]X VHKHQ ZLH GLH =HOOK|KH ]X XQG GLH %UHLWH DEQLPPW /DWHUDOHRSWLVFKH6FKQLWWH (III):'LH=HOOHQVFKUXPSIHQLUUHYHUVLEHOXQGYHUOLHUHQ]XP

*UR‰WHLO GLH LQWDNWHQ 0LWRFKRQGULHQ*UDXHU 3IHLO'LH =HOOH ZLUG GLUHNW QDFK GHU 5HSHUIXVLRQ QHNURWLVFK+HOOJUDXHU3IHLO=HOOHGXUFKOlXIW2QNRVH:HL‰HU3IHLOGLH=HOOHEHUOHEWDXFKGLH

%HKDQGOXQJPLW,RQRP\FLQXQG(*7$ZDVDQGHU5FNUHJXODWLRQGHU>&D@LXQGGHQLQWDNWHQ 0LWRFKRQGULHQHUNHQQEDULVW

BOTENSTOFF KALZIUM 71 Die tabellarische Auflistung der Ergebnisse zum einfacheren Vergleich vom Zustand der Mitochondrien mit und ohne Ca²⁺-Chelator (s. Abb. A.XIV.3 und 3.3.14-19).

HORIZONTALER SCHNITT BEDINGUNGEN [%] [nM]

AXIALER SCHNITT Dauer Anzahl

N

Fläche Ag

Gesamte Intensität Fg

mittlere Intensität Fd

[Ca²⁺]i

Höhe/

Breite

Intensität

Kon-trolle*

175 min 450 min

88 80

91 96

93 105

103 108

72 ± 4 51 ± 3

konstant konstant 100 µM 170 min

490 min 167 190

94 69

101 69

119 114

93 ± 7 (r) konstant geringe vorüberge-hende Zunahme 250µM 190 min

440 min 86 105

108 55

127 60

149 146

148 ± 21 (r) konstant geringe Zu-nahme, dann leicht abnehmend 500 µM 190 min 19 2 2,6 172 187 ± 18 (ir) nimmt

zu

starke Zu- dann Abnahme 0 µM +

EGTA

120 min 76 57 59 108 51 ± 3 115 ± 33

nimmt zu

wo intakt Zunahme 250 µM

H2O2

EGTA

160 min 50 50 69 119 53 ± 2 (vor) 48 ± 2 45 ± 1(nach) 118 ± 24

nimmt vorüber- gehend zu

wo intakt Zunahme

500 µM H2O2

EGTA

190 min 51 12 13 114 71 ± 2 (vor) 77 ± 2 63 ± 1(nach) 117 ± 10

nimmt zu

starke Zu- dann Abnahme

7DEHOOH =XVDPPHQIDVVXQJ GHU (UJHEQLVVH ]X >&D@L XQG =XVWDQG GHU 0LWRFKRQGULHQ EHL R[LGDWLYHP6WUH‰'LH$XIOLVWXQJGHU3DUDPHWHU$Q]DKO1*HVDPWIOlFKH$J*HVDPWLQWHQVLWlW)J XQGGXUFKVFKQLWWOLFKH,QWHQVLWlWSUR)OlFKH)GGLHQW]XUhEHUVLFKWEHUGLHTXDQWLWDWLYH$XVZHUWXQJ GHV =XVWDQGV GHU 0LWRFKRQGULHQ QDFK RGHU —0 +2 ,P =XVDPPHQKDQJ PLW VSlWHUHQ)ROJHUXQJHQLVWEHVRQGHUVGLH.RUUHODWLRQ]ZLVFKHQ)G)JXQGGHU>&D@LYRQ%HGHXWXQJ 'LH =XQDKPH GHU GXUFKVFKQLWWOLFKHQ ,QWHQVLWlW SUR )OlFKH )G EHL JOHLFK]HLWLJHU bQGHUXQJ GHV 9HUKlOWQLVVHVYRQ+|KH]X%UHLWH+%GHU=HOOHQVWW]WGLH+\SRWKHVHGHU,QWHQVLWlWV]XQDKPHGXUFK PHKU 0LWRFKRQGULHQ LP VHQVLWLYHQ 9ROXPHQ $XV GHP 9HUKDOWHQ GHU )G QDFK =XJDEH GHV &D

&KHODWRUV(*7$ZLUGMHGRFKGHXWOLFKGD‰GLHPRUSKRORJLVFKHQ9HUlQGHUXQJHQQLFKWGHQDOOHLQLJHQ

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ERGEBNISSE

72

Schlußfolgerungen für den Zustand der Mitochondrien

1. Hyper- und Depolarisation des mitochondrialen Membranpotentials verstärkt durch Ca²⁺

In der Fokusebene schrumpfende Zellen dehnen sich in axialer Richtung aus. Dies führt zur stärkeren Abrundung bei 500 µM als bei 250 µM H₂O₂. Ein Nebeneffekt der Ca²⁺-Chelatoren ist das Zusammenziehen der Zellen, was bei oxidativem Streß verstärkt wird.

Der Anstieg von F_d ist dabei trotz der stärkeren Schrumpfung der Zellen weniger ausgeprägt als bei der gleichen H2O2-Dosis ohne Ca²⁺-Chelator. Die Fg bleibt dabei auf einem höheren Wert. Daraus läßt sich schließen, daß der stärkere Anstieg der Fd ohne Ca²⁺-Chelator auf eine höhere TMRM-Konzentration in den Mitochondrien zurückzuführen ist.

Insgesamt bleiben nach der Behandlung mit 500 µM H2O2 in Anwesenheit eines Ca²⁺ -Chelators mehr Mitochondrien intakt als im selben Experiment ohne Ca²⁺-Chelator.

F_d steigt also abhängig von der H₂O₂-Dosis und der [Ca²⁺]_i und zeigt damit eine dosisabhän-gige Hyperpolarisation des ∆ΨM aller intakten Mitochondrien an. Der stärkeren Hyperpolari-sation bei einer Erhöhung der [Ca²⁺]i folgt die vermehrte Depolarisation des ∆ΨM der Mitochondrien.

Desweiteren verursacht oxidativer Streß eine dosisabhängige Abnahme von N, A_g und F_g. Davon sind besonders die peripheren Mitochondrien betroffen, wie durch die Abnahme von N dokumentiert wird. Die Verwendung von Ca²⁺-Chelatoren schützt nur bei hohen H2O2-Dosen vor reaktiven Sauerstoffverbindungen.

2. Freisetzung von TMRM

Ein vorübergehender Anstieg der Gesamtfläche und der gesamten Fluoreszenzintensität, die durch 250 und 500 µM H2O2-Streß auftritt, kann durch eine reversible Schwellung der Mitochondrien oder die Freisetzung von TMRM aus den Mitochondrien verursacht werden.

Letzteres trägt dann solange zur Fluoreszenz des Zytoplasmas bei, wie die nachfolgende Einstellung der Gleichgewichtsverteilung der Membranpotentialsonde über die Plasma-membran dauert (bei TMRM bis zu 5 min).

BOTENSTOFF KALZIUM 73 Zusammenfassung

Die Zusammenfassung bietet einen Überblick über die Änderungen des Zustands der Mitochondrien bei oxidativem Streß, der auf der Basis der Parameter Ag, Fg, Fd und N ausgewertet wurde. Die quantitativen Änderungen der Werte einzelner Parameter in Tabelle 3.3.1 werden hier zur qualitativen Beschreibung des Zustands der Mitochondrien und der Zellpopulation herangezogen. Dabei werden die Messungen der [Ca²⁺]_i ebenfalls beschrieben.

Das Kontrollexperiment in Abb. 3.3.12 dient zur Verdeutlichung der Bedeutung morphologi-scher Veränderungen, die zu Fehlinterpretation der vier zur Auswertung verwendeten Parameter führen können. Die Mobilität und Zellteilung führt hier zur Entstehung großer Freiflächen zwischen dicht an- und übereinander liegenden Zellen in den Populationen, die bis vier Stunden nach Beginn des Experiments konfluent sind. Dabei ändert sich das Membranpotential der Mitochondrien der Zellen nicht (vgl. Abb. 3.3.13). Im Anhang A.XIV wird das Kontrollexperiment mit gleicher Bestrahlungsrate, wie in den Experimenten mit oxidativem Streß präsentiert. Durch die verringerte Bestrahlungsdauer verhält sich diese Zellpopulation stabil (s. Abb. A.XIV.3).

100 µM H2O2 verursacht eine geringere Hyperpolarisation der Mitochondrien als 250 oder sogar 500 µM. Die Depolarisation der Mitochondrien ist dosisabhängig. Während bei 500 µM H2O2 im weiteren Verlauf alle Mitochondrien einzelner Zellen depolarisiert werden, in denen die [Ca²⁺]i anhaltend erhöht ist, folgt der transienten Erhöhung der [Ca²⁺]i bei 250 µM H2O2

eine langsamer fortschreitende Depolarisation ohne das eine Zelle alle intakten Mitochondrien verliert. Die intakten Mitochondrien bleiben auch bei 100µ M über die Dauer der Experimente hyperpolarisiert.

Durch oxidativen Streß ziehen die Zellen sich zusammen. Dieser Effekt ist abhängig von der H2O2-Dosis und wird durch die Verwendung von 4 mM des Ca²⁺-Chelators EGTA verstärkt.

In Zellen, die mit Nährmedium mit 500 µM H2O2 inkubiert worden sind, ist nur ein niedriger und vorübergehender Anstieg der [Ca²⁺]i zu verzeichnen, die Hyper- und Depolarisationsef-fekte auf die Mitochondrien werden durch EGTA verringert. Die mit 500 µM H2O2 und EGTA behandelten Zellen blieben für die Erholungsphase von 4 h zusammengezogen, in wenigen ist die [Ca²⁺]_i irreversibel erhöht.

Bei 250 µ M H2O2 verkehrt sich der protektive Effekt von EGTA ins Gegenteil. Der Einstrom von Ca²⁺ ins Zytoplasma wird vollständig verhindert, aber die Zellen kehren nach der Reper-fusion mit Nährmedium nicht zum Ausgangszustand zurück. Ein Teil der Zellen bleibt zusammengezogen und behält eine erhöhte [Ca²⁺]i. Die Mitochondrien zeigen durch 250 µM H2O2 ohne EGTA eine stärkere Hyperpolarisation, trotzdem bleiben mehr Mitochondrien intakt.

Bei 100µ M H₂O₂ finden noch bis zum Ende des Experiments 7 h nach der Reperfusion mit Nährmedium Zellteilungen statt. Nach 250 µM H2O2 teilen sich die Zellen innerhalb der nächsten 8 h nicht mehr. Bei 500 µM gibt es schon während der Inkubation mit H2O2

nekrotisch reagierende Zellen, die Überlebensrate ist gegenüber 100 und 250 µM deutlich herabgesetzt.

Im Dokument Ionentransporte in C6-Glioma-Zellen bei oxidativem Streß (Seite 59-80)