3.3. M ETHODEN
3.3.13. Mikrosatelliten-PCR zur Genotypisierung
Sogenannte Mikrosatelliten oder auch Short Tandem Repeats (STR) sind kurze, nichtcodierende DNA-Sequenzen von zwei bis sechs Basenpaaren Länge, die sich mehrfach innerhalb des Genoms an gleicher Stelle wiederholen. Die Anzahl der Wiederholungen variiert in jedem genetisch distinkten Individuum einer Spezies, sind jedoch innerhalb der Zellen eines Organismus stabil. Dadurch können sie zur sicheren Unterscheidung zwischen zwei individuellen Organismen derselben Spezies dienen (J. L. Weber, 1990). Diese Mikrosatelliten wurden auch bei A. fumigatus gefunden und werden schon seit ca. 20 Jahren zur Typisierung unterschiedlicher Isolate auch im klinischen Bereich genutzt (Bart-Delabesse et al., 1998). Da A. fumigatus einen haploiden Chromosomensatz aufweist, ist nur eine Ausprägung jedes STRs vorhanden. So ist jedem Merkmal ein Wert zugeordnet, der üblicherweise in der Anzahl der Wiederholungen der repetitiven Sequenz angegeben wird.
An Subkulturen des Centralbureau voor Schimmelcultures (CBS) konnte gezeigt werden, dass die Merkmale über zahlreiche Generationen stabil bleiben (Bart-Delabesse et al., 1998).
Für die vorliegende Arbeit wurde die 2005 erstbeschriebene Methode der Typisierung mittels neun verschiedener Mikrosatellitenmarker angewandt. Hierfür wurden jeweils drei Loci von sich wiederholenden, nicht unterbrochenen Di-, Tri- und Tetra-nukleotidsequenzen ausgewählt. Es wurden im Besonderen Loci mit hohen Wiederholungsraten gewählt. Zur Amplifikation der Sequenzen von Interesse wurden verschiedene fluoreszenzmarkierte Vorwärts-Primer genutzt, um einen Multiplexansatz zu ermöglichen. Als Carboxyfluoreszin wurde für die Dinukleotidsequenzen 6-FAM™, für die Trinukleotidsequenzen VIC® und für die Tetranukleotidsequenzen NED™ als Markierung genutzt (siehe Tabelle 9, alle ThermoFisher Scientific, Wesel, Deutschland).
Es wurde durch de Valk et al. (2005) gezeigt, dass die gewählten Mikrosatelliten-Regionen von A. fumigatus-Isolaten über mindestens 30 Subkulturen stabil bleiben.
Tabelle 9: Absorptions- und Emissionsmaxima der verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe (ThermoFisher)
Farbstoff Absorpotions-maximum [nm]
Emissions-maximum [nm]
Relative Intensität [RFU]
6-FAM 494 522 100
VIC 538 554 100
NED 546 575 40
LIZ 638 655 50
Um die Reliabilität der Multiplex-Methode zu überprüfen, wurde zuerst ein SinglePlex-PCR der drei Isolate M7 (München) 2133 (Essen) und H601 (Hannover) durchgeführt und die Ergebnisse mit dem Multiplex-Ansatz nach der Auswertung verglichen (Tabelle 10).
Tabelle 10: Vergleich der Fragmentlängenanalyse zwischen Singleplex- und Multiplex-Ansatz
STRAf [in bp]
Anschließend wurde die PCR für alle Proben in jeweils 3 einzelnen Multiplex-Ansätzen (M2 = STRAf 2 A,B,C; M3 = STRAf 3 A,B,C; M4 = STRAf 4 A,B,C) durchgeführt. Bei Auswertung aller neun Mikrosatelliten-Markern erreicht diese Methode einen Simpson-Diversitäts-Index von D=0,9994. Dies bedeutet, dass die Methode eine hohe diskriminatorische Kraft besitzt, um zwischen verschiedenen Isolaten sicher zu unterscheiden (Simpson, 1949). Den größten Einfluss haben dabei die Trinukleotid-Mikrosatelliten-Marker.
Locus Vorwärts-Primer-Sequenz Rückwärts-Primer-Sequenz Repeat-Einheit STRAf
2A
6-FAM™-AAGGGTTATGGCCATTAGGG GACCTCCAGGCAAAATGAGA GA STRAf
2B
VIC®
-TATTGGATCTGCTCCCAAGC GAGATCATGCCCAAGGATGT AG STRAf
2C
NED™-TCGGAGTAGTTGCAGGAAGG AACGCGTCCTAGAATGTTGC CA STRAf
3A
FAM™-GCTTCGTAGAGCGGAATCAC GTACCGCTGCAAAGGACAGT TCT STRAf
3B VIC®
-CAACTTGGTGTCAGCGAAGA GAGGTACCACAACACAGCACA AAG STRAf
3C
NED™-GGTTACATGGCTTGGAGCAT GTACACAAAGGGTGGGATGG TAG STRAf
4A
FAM™-TTGTTGGCCGCTTTTACTTC GACCCAGCGCCTATAAATCA TTCT STRAf
4B VIC®
-CGTAGTGACCTGAGCCTTCA GGAAGGCTGTACCGTCAATCT CTAT STRAf NED™- ACCAACCCATCCAATTCGTAA ATGT
1. Schritt: PCR der extrahierten DNA mittels fluoreszenzmarkierter Primer Beispielprobenansatz der Mikrosatelliten-PCR für jeweils 4 Proben:
Für jeden Reaktionsansatz wurde die DNA auf eine Konzentration von 1ng/µl in 20µl nukleasefreiem Wasser verdünnt und zum jeweiligen Ansatz hinzugegeben, sodass sich 100µl ergaben. Legende: dNTP = Desoxyribonukleosidtriphosphate, H2O = Wasser, MgCl2 = Magnesiumchlorid, Taq = Thermus aquaticus.
PCR-Durchführung:
Prozess Temperatur Dauer
Initiale Denaturierung 95°C 600s Dann 24 Zyklen
95°C 30s
Primerhybridisierung 58°C 60s
Elongation 68°C 60s
Extension 68°C 600s
2. Schritt: Multiplex-Kapillarelektrophorese der amplifizierten Proben
Je 1µl Amplifikat aus der PCR wurden mit je 0,5µl GeneScan™ 1200 Liz™ Size Standard und 9µl Applied Biosystems™ Hi-Di™ Formamid versetzt und 120s bei 92°C inkubiert und sofort auf Eis für mindestens 2 Minuten gekühlt, um die Amplifikate zu denaturieren.
Anschließend wurden die Amplifikate in die Kavitäten einer geeigneten 96-Well-Platte pipettiert und mittels ABI PRISM® 3130 kapillarelektrophoretisch aufgetrennt, wobei POP-7™ Polymer als Laufmatrix genutzt wurde.
Reagenz Ansatz STRAf 2
A/B/C
Ansatz STRAf (3+4) A/B/C
Primer, gelabelt [je 3,125 µmol/l] Je 2µl Je 2µl
10x Puffer 10µl 10µl
dNTP [je 10 mmol/l] je 2µl je 2µl
MgCl2 [1,5 mmol/l] 0µl 2µl
Taq-Polymerase [5 U/µl] 0,8µl 0,8µl
H2O 55,2µl 53,2µl
Summe 80µl 80µl
3.3.14.1. Auswertung der Ergebnisse der Kapillarelektrophorese
Die erhaltenen Daten wurden mittels der Software Geneious 8.1.4 (Biomatters Limited, New Zealand) und des Microsatellite Plug-In 1.4.0 ausgewertet.
Dabei wurden die erkannten Peaks anhand des Längenstandards in die Fragmentgrößen umgerechnet. Das jeweils stärkste Signal einer Peak-Formation wurde als Wert gewählt.
Die Fragmentgrößenbestimmung wurde mittels Local Southern Algorithmus durchgeführt, der als gut geeignet für STR-Daten bekannt ist (Elder et al., 1983). Für die Zuordnung der berechneten Werte in plausible Fragmentgrößen wurden die Signale eines Bereichs mittels sogenanntem „binning“ Werten zugeordnet. Die jeweilige Breite der Bins orientierte sich an der Größe der Wiederholungseinheit (Di-, Tri- oder Tetranukleotid) sowie der bekannten Korrelation von bekannten Fragmentgrößen und dazugehöriger bekannter Anzahl der Wiederholungen einer Sequenz nach de Valk et al. (2005).
Abbildung 11: Beispiele für Elektrophorese-Peaks. Oben: Beispiel für GeneScan™ 1200 Liz™ Size Standard Peaks (rot) bei 113,120,140,160 und 180 bp Fragmentgröße. Unten: Peaks sowie Bins der Multiplex-Kapillarelektrophorese für Probe 1954 der STRAfs für Dinukleotid-Allele 2 a,b und c dargestellt. Farbkanäle für die Farbstoffe 6-FAM™ (blaue Peaks und Bins), VIC® (grüne Peaks und Bins) und NED™ (schwarze Peaks und Bins). Beide: X-Achse: Fragmentgrößen in bp; Y-Achse: relative Fluoreszenz)
3.3.14.2. Simpson-Index
Der Simpson-Index dient zur Beurteilung der Diskriminationsfähigkeit einer Methode zur Bestimmung der Biodiversität (Simpson, 1949). Werte können zwischen 0 (es gibt nur einen vorherrschenden Biotypen) und Annäherung an 1 (größtmögliche Diversität) liegen.
Übertragen auf die Bewertung der Diskriminationsfähigkeit einer Methode bedeuten Werte näher an 0 eine schlechte Unterscheidungsfähigkeit und Werte mit Tendenz zu 1
Für die hier durchgeführte Mikrosatelliten-Analyse wurden ebenfalls die Simpson-Indizes aller Mikrosatelliten-Marker berechnet.
Dabei gilt:
" = 1 − ∑()() − 1) +(+ − 1)
Dabei steht D für den Simspon-Index, n für die Anzahl der Isolate eines Genotyps und N für die Anzahl aller Isolate.
3.3.14.3. Number of repeats
Um die Daten dieser Arbeit auch mit anderen Quellen zu vergleichen, wurden die Fragmentgrößen anhand der Vorarbeiten von de Valk et al. (2005) in Anzahl der Wiederholungen der spezifisch repetitiven Sequenz der STRs (Number of Repeats) berechnet. In Tabelle 11 ist die jeweilige Anzahl der Wiederholungen dargestellt, die durch Sanger-Sequenzierung in der genannten Arbeit exakt bestimmt und anschließend mit Fragmentgrößen der hier angewandten Methode korreliert wurden. Auf dieser Basis sind die restlichen Werte durch die bekannte Größe der Wiederholungseinheit (2,3 oder 4 bp) extrapoliert worden.
Tabelle 11: Korrelation der per Kapillarelektrophorese bestimmten Fragmentlängen mit per Snager-Sequenzierung bestimmter Anzahl der Wiederholungen (Number of Repeats) exemplarischer Di-, Tri- und Tetranukleotidmarker der definierten STR-Allele nach de Valk et al. (2005)
Allel Fragmentgröße [in bp] Number of Repeats Frequenz [in %]
STRAf2A
STRAf3A
3.3.14.5. Artefakte und Einschränkungen der Mikrosatelliten-PCR
Bekannt ist, dass bei der Elongation ein Weggleiten der Taq-DNA-Polymerase vor der abgeschlossenen Fragmentsynthese stattfinden kann (sog. Slippage). Dadurch werden Fragmente erzeugt, die zwei bis vier Basenpaare kürzer sind (Hauge et al., 1993). Diese sind in der Auswertung durch eine Kapillarelektrophorese dann als kleinere Peaks sichtbar.
Trotz der bekannten genetischen Stabilität konnte in Subkultivierungsversuchen gezeigt werden, dass die Stabilität der Mikrosatelliten-Marker über Generationen abhängig von der Wiederholungsanzahl der Basensequenzen ist (de Groot et al., 2019). Meist zeigen diese Abweichungen nach Subkulturen im zweistelligen Bereich Abweichung um ein bis zwei Wiederholungen. Eine weitere Einschränkung ist, dass die analysierten Fragmente zusätzlich zur reinen Di-, Tri- oder Tetranukleotidwiederholungssequenz Reste der primerbindenen Region enthalten, die ebenfalls amplifiziert wurden. Daher können diese die Größe des gemessenen Fragments beeinflussen und im Vergleich zum Größenstandard zu abweichenden Fragmentgrößen führen. Zusätzlich sind durch teils überschneidende Emissionsspektra der Fluoreszenzfarbstoffe teils abgeschwächte Signale aus benachbarten Farbkanälen messbar, die als kleinere Peaks auftauchen und als solche nicht gewertet werden dürfen (Abbildung 12). Gleichzeitig werden die Fluoreszenzsignale des eigentlichen Farbstoffs des Kanals teilweise abgeschwächt (Abbildung 13). In Zusammenschau mit den SinglePlex-Vortestungen sind diese systematischen Artefakte jedoch sicher zu erkennen.
Abbildung 12: Darstellung des positiven Bleeding-Effekts anhand der Multiplex-Kapillarelektrophorese für Probe 2089 der STRs für Dinukleotid-Allele. Farbkanäle für die Farbstoffe VIC® (grüne Peaks) und NED™
(schwarze Peaks). X-Achse: Fragmentgrößen in bp; Y-Achse: relative Fluoreszenz)
Abbildung 13: Darstellung des negativen Bleeding-Effekts durch den Farbstoff 6-FAM™ (blau) und Abschwächung des korrekten Kanalsignals von NED™ (schwarz) anhand der Multiplex-Kapillarelektrophorese für Probe 2089 der STRs für Dinukleotid-Allele. Farbkanäle für die Farbstoffe 6-FAM™
(blaue Peaks) und NED™ (schwarze Peaks). X-Achse: Fragmentgrößen in bp; Y-Achse: relative Fluoreszenz)