Die meisten konsekutiven A. fumigatus-Isolate wiesen einen identischen Genotyp in der Typisierung auf. Trotzdem konnten auch Mehrfachbesiedelungen bei deutlicher STR-Marker-Abweichung sowie unterschiedlicher Resistenz-Phänotypie festgestellt werden (bspw. Patient HA2). Es konnten jedoch auch geringgradige Abweichungen von ein bis zwei Wiederholungen, vor allem im Marker STRAf3A, festgestellt werden (bspw. Patient HA15). Diese könnten einerseits auf eine Mikroevolution der Isolate hindeuten, andererseits eine bekannte methodikinhärente Ungenauigkeit bei zahlreichen Subkultivierungen aufzeigen, welche besonders bei diesem Marker beschrieben ist, wohingegen andere Marker stabile Wiederholungsanzahlen aufweisen (de Groot et al., 2019). Diese Abweichungen sind jedoch gering und im Vergleich zu anderen angewandten Verfahren wie der Multi-Locus Sequenztypisierung (MLST) oder der Methode der zufällig
vervielfältigten polymorphen DNA (RAPD) seltener. Weiterhin bietet die STR-Typisierung eine besser reproduzierbare und günstigere Methode dar, die eine bessere Diskriminierung von Isolaten ermöglicht (Vanhee et al., 2009). Gerade auch im Vergleich zur deutlich aufwendigeren Ganzgenomsequenzierung erwies sich die STR-Typisierung als stabil und gleich aussagekräftig (Hagiwara et al., 2014). Auch neu entwickelte Verfahren auf Basis von hypervariablen Tandem Repeats innerhalb von Exons wiesen bisher keinen Vorteil auf (Garcia-Rubio et al., 2018).
Es zeigte sich kein eindeutig dominierender Cluster eines jeweiligen STR-Genotypen an den einzelnen Zentren. Das Clustering einzelner Isolate von verschiedenen PatientInnen im Zentrum München (MN1 und MN3), Hannover (HA6 und HA18 sowie HA6 und HA7) und Münster (MU3 und MU4) deutet bei beschriebener Zuverlässigkeit der Methode jedoch auf eine Übertragung zwischen PatientInnen oder eine gemeinsame Infektionsquelle hin. Da im Allgemeinen der Mensch als „Endwirt“ von A. fumigatus als Atemwegsbesiedler gesehen wird, erscheint eine gemeinsame Umweltquelle zuerst plausibler. In einigen Arbeiten wurde jedoch auch eine mögliche Patient-zu-Patient-Transmission diskutiert (Engel et al., 2019; Lemaire et al., 2018).
Der Großteil der Isolate von geographisch unterschiedlich verorteten PatientInnen wies keine genotypische Übereinstimmung auf. Ausnahme bildeten hierbei ein Patient aus Essen (E15) und einer aus Hannover (HA6).
Auffällig ist hierbei die mehrfache Besiedelung des Patienten HA6 mit unterschiedlichen Genotypen, die im Laufe des Studienzeitraums nachgewiesen werden konnten.
Möglicherweise fand ein Austausch unterschiedlicher Isolate hier bei Treffen von CF-Selbsthilfegruppen oder sonstigen sozialen Veranstaltungen innerhalb der Patientengruppen statt. Außerdem wiesen die Isolate teils lediglich Abweichungen im Marker STRAf3A auf, was wiederum auf eine Zuverlässigkeit des Markers hindeuten kann.
Wäre hier eine genaue zeitliche und örtliche Verortung der einzelnen Isolate möglich, könnten womöglich einzelne Kontakte der PatientInnen entdeckt werden.
Auf der anderen Seite kann auch von einem vorherrschenden Genotyp in der Umwelt ausgegangen werden, der über zahlreiche Generationen Veränderungen im Marker STRAf3A zeigt und konsekutiv mehrere PatientInnen besiedelte.
Aufgrund fehlender weiterführender Informationen ließ sich jedoch dieser Weg einer Übertragung weder be- noch widerlegen.
Daher sollte diese Möglichkeit der Übertragung gerade im Falle der übereinstimmenden Genotypen in München, Hannover und Münster nicht verworfen werden, da auch
vorangegangene Arbeiten schon unerklärte genotypische Übereinstimmungen von als zusammenhangslos gewerteten Isolaten aufzeigten (de Valk et al., 2009).
Zudem wiesen die Isolate der Patienten E7 (Isolat 1954) und Patient F2 (Isolat F68) lediglich eine Differenz von einer Wiederholung im Marker STRAf3B auf, welche in manchen Arbeiten innerhalb der Toleranz als identisch bewertet werden.
7.4.1. Simpson-Index
Die angegebenen Diversitätsindices konnten in dieser Arbeit nicht gänzlich reproduziert werden. Dies liegt jedoch wahrscheinlich darin begründet, dass chronologisch konsekutive Isolate von gleichen PatientInnen gewonnen wurden, die einen erheblichen Probenanteil ausmachen. Dennoch zeigte der Marker STRAf3A wie erwartet den höchsten alleinigen Simpson-Index. Dieser Marker weist zwar eine in Diskussion befindliche Stabilität über mehrere Subkultivierungs-Generationen auf, zeigte jedoch bei Isolaten verschiedener PatientInnen wiederum eine sichere und hohe Diskriminationsfähigkeit.
7.4.2. Unterschiedliche Möglichkeiten der phylogenetischen Analyse
Die Ergebnisse der genotypischen Verwandtschaftsanalyse können durch die Art der Auswertung weiter beeinflusst werden. Hierbei ist oft entscheidend, welche Berechnungsmethode für die Nähe der Verwandtschaft genutzt wird.
In dieser Arbeit wurde die Berechnung nach UPGMA mittels Hamming-Distanz für ein hierarchisches Dendrogramm und die Methodik des Neighbour-Joinings für die Darstellung eines Minimum Spanning Tree genutzt.
Die Grundannahme der UPGMA ist die sogenannte molekulare Uhr. Hierbei wird für alle Taxa eine gleiche Evolutionsrate vorausgesetzt. Das bedeutet, dass bei mehr Unterschieden in der Nukleinsäure-Sequenz eine längere Evolutionsdauer, also eine entferntere Verwandtschaft angenommen wird. Der aus den Berechnungen entstehende phylogenetische Baum besitzt immer einen Ursprung (Wurzel) und stellt eine hierarchische Clustering-Methode dar, in der gemeinsame wahrscheinliche Vorfahren von Isolaten dargestellt werden.
Im Gegensatz dazu wird beim Neighbour-Joining von einer erhöhten Geschwindigkeit der Evolution bei deutlicher differierenden Taxa ausgegangen. Diese werden also nicht zwangsläufig als entfernter verwandt angesehen (Saitou et al., 1987). Der berechnete phylogenetische Baum wird hierbei ohne Ursprung dargestellt und wählt für jede neue Verbindung (branch) die ähnlichsten Nachbardatensätze. Dieses Verfahren wird im Allgemeinen als zuverlässiger, aber rechenintensiver angesehen (Pavlopoulos et al., 2010).
Trotzdem eigneten sich beide angewandten Verfahren zuverlässig für visuelle Darstellung von Clustern gleicher Genotypen und wiesen nur geringe Unterschiede in der Gewichtung von Abständen zu ähnlichen Genotypen auf. Beispielsweise wurde das Isolat MS135 durch UPGMA nicht in phylogenetische Nähe zum Isolat H121 gesetzt. Im Neighbour-Joining wird es dagegen in enge Beziehung gesetzt. Zusätzlich zu den erkannten gleichen Genotypen wurden Isolate mit geringem Sequenzunterschied gleichermaßen nah im Baum platziert, vor allem wenn lediglich ein bis zwei Wiederholungen als Abweichung in einem Marker vorhanden waren.
Diese Robustheit der Datensätze verdeutlicht die zuverlässige Erhebung durch die STR-Typisierung, die auch in unterschiedlichen Auswertungsmethoden zu gleichen Ergebnissen für die epidemiologisch relevanten Fragestellungen führt.