Methodik

Der Nachweis von CEV ist dadurch erschwert, dass sich das Virus in den bekannten Fischzelllinien nicht aus Geweben von infizierten Fischen anzüchten lässt (JUNG-SCHROERS et al. 2015; LEWISCH et al. 2015). Die lichtmikroskopisch erkennbaren Veränderungen im Kiemengewebe infizierter Karpfen oder Koi lassen eine eindeutige Diagnose der Virusinfektion nicht zu (ONO et al. 1986; MIYAZAKI et al. 2005). Der Nachweis von Virionen im Zytoplasma infizierter Zellen im respiratorischen Kiemenepithel ist zwar möglich (MIYAZAKI et al. 2005), allerdings sehr aufwendig und insbesondere bei Karpfen konnten einige Labore keine Viruspartikel in Gewebe erkrankter Karpfen darstellen (WAY et al. 2017). Deshalb wurde zum Nachweis der Infektion und zur Identifizierung des Virus eine PCR durchgeführt, die von Oyamatsu et al. (1997) entworfene Primerpaare benutzte. Mit diesen Primerpaaren wird ein Fragment der Nukleotidsequenz des Gens amplifiziert, das das p4a-Protein des Virus codiert, das beim Vaccinia-Virus als wichtiges Kapsid-Protein beschrieben wurde (HELJASVAARA et al. 2001). In einigen Fällen erzeugen jedoch die von Oyamatsu entworfenen Primer unspezifische Amplifikationsprodukte von

vergleichbarer Größe wie die erwarteten Produkte, was die Interpretation der Ergebnisse erschwert (WAY et al. 2017). Deshalb wurden weitere Primerpaare entworfen, die an unterschiedlichen Regionen der bekannten Nukleotidsequenz des p4a-Gens banden und Genfragmente von unterschiedlicher Größe amplifizierten (ADAMEK et al. 2016; MATRAS et al. 2017)

Da zu Beginn der vorliegenden Studie nicht bekannt war, welche PCR sich am besten eignet, um das CEV sowohl bei Speisekarpfen als auch bei Koi nachzuweisen, wurden in der vorliegenden Untersuchung für alle Proben zwei real-Time-PCRs, die TiHo Probe qPCR (ADAMEK et al. 2016) und TiHo Sybr Green qPCR (ADAMEK et al. 2017a), sowie eine Endpunkt-PCR (CEFAS Endpoint(MATRAS et al. 2017)) verwendet. Anhand der von Adamek et al. (2017a) vorgelegten Daten wurde deutlich, dass die TiHo Probe qPCR sich lediglich zur Untersuchung auf CEV der Genogruppe IIa, die überwiegend Koi infiziert, eignete (ADAMEK et al. 2017a). Da zwischen dem CEV beim Karpfen oder dem CEV beim Koi Unterschiede in der DNA-Sequenz des Gens bestehen, konnte die Sequenz des p4a-Gens des CEV bei Speisekarpfen mit der TiHo Probe qPCR von Adamek et al. (2017a) nicht detektiert werden. Für den quantitativen Nachweis des CEV der Genogruppe I bei Speisekarpfen war in der Untersuchung von Adamek et al. (2017a) die SYBR Green qPCR geeignet, während die CEFAS Endpunkt-PCR Virussequenzen beider Genotypen amplifizieren konnte (ADAMEK et al. 2017a; MATRAS et al. 2017). Deshalb wurde in der vorliegenden Arbeit die TiHo Probe qPCR nur für die Untersuchung der Koiproben eingesetzt. Somit standen für die Untersuchung des CEV der Genogruppe IIa und IIb aus Koiproben sowohl die TiHo Probe qPCR als auch die SYBR Green qPCR zur Verfügung.

Bisher lagen jedoch keine vergleichenden Untersuchungen zur Sensitivität oder Spezifität der PCR-Protokolle vor. Aus diesem Grund wurde in der vorliegenden Untersuchung jede Probe im Endresultat als positiv bewertet, wenn sie auch nur in einer der eingesetzten PCR-Protokolle ein Amplifikationsprodukt aufweisen konnte. Von den insgesamt 174 Koiproben, die auf diese Weise als CEV-positiv befundet wurden, ließ sich das Virus mit der CEFAS-Endpunkt-PCR bei 118 Proben nachweisen, mit der TiHo Probe qPCR in 148 Proben und mit der TiHo-SYBr-Green PCR in 149 Proben. In der Mehrzahl der Proben, die mit der CEFAS-Endpunkt-PCR als negativ und mit den beiden quantitativen PCR-Protokollen als positiv befundet wurden, ergab sich rechnerisch eine Viruslast von einer bis etwa 10 Viruskopien,

was darauf hindeuten könnte, dass es sich um falsch-positive Ergebnisse handeln könnte.

Wenn nur mit einem qPCR–Protokoll ein Amplifikationsprodukt erzielt werden konnte, ließ sich das Ergebnis aufgrund des kleinen Amplifikationsprodukts nicht durch Sequenzierung verifizieren. Alle Proben die in der CEFAS Endpunkt-PCR ein Amplifikat aufwiesen, wurden sequenziert und konnten somit auch als CEV-positiv verifiziert werden. Aufgrund dessen kann ein Großteil der positiven Ergebnisse auch als gesichert angesehen werden. Darüber hinaus könnte das Ausbleiben eines Amplifikationsprodukts mit der CEFAS Endpunkt-PCR in Koiproben mit geringer Viruslast an einer zu geringen Sensitivität der PCR liegen. Die Sensitivität ließe sich durch eine Nested-PCR steigern, die sensitiver ist als die herkömmliche Endpunkt-PCR. Allerdings wird dadurch auch die Wahrscheinlichkeit eines falsch-positiven Ergebnisses erhöht. Allerdings ist zu bedenken, dass bei allen aktuell verwendeten PCR-Protokollen jeweils nur ein Fragment des p4a-Gen des Carp Edema Virus amplifiziert wird und es bleibt ungewiss, ob weitere Virusvarianten, die mit den zur Verfügung stehenden PCR-Protokollen nicht erfasst werden, in den untersuchten Fischen vorliegen. Hierfür wäre ein Protokoll samt Primer notwendig, welches einen anderen Bereich der Virus-DNA des Carp Edema Virus amplifiziert. Um entsprechende Nukleotidsequenzen der Virus-DNA auszuwählen, die in der PCR amplifiziert werden sollen, wäre die vertiefte Kenntnis der Virus-DNA notwendig, z. B. durch eine vollständige Sequenzierung der Carp-Edema-Virus DNA, was bisher jedoch noch nicht erfolgt ist.

In der vorliegenden Untersuchung konnte bei insgesamt 170 Proben das Untersuchungsergebnis mit zwei unterschiedlichen quantitativen PCR-Protokollen verglichen werden. In etwa 55 % der Proben (93 Proben) wurde mit beiden Protokollen etwa das gleiche Ergebnis erzielt, bei 11 % der Proben ergab die Untersuchung mit der TiHo SYBR Green qPCR eine signifikant geringere Viruslast als bei Untersuchung mit der TiHo Probe qPCR, in 15 % der Proben ergab die TiHo Probe qPCR eine niedrigere Viruslast als die TiHo SYBR-Green PCR. Auf Unterschiede in der Sensitivität der beiden quantitativen PCR-Protokolle insbesondere bei Proben mit geringer Viruslast wurde bereits von Adamek et al. (2017a) bei einer geringeren untersuchten Probenzahl hingewiesen.

Leider ist es bis jetzt noch nicht gelungen, das Virus in einer Zellkultur anzuzüchten (ONO et al. 1986; JUNG-SCHROERS et al. 2015; SWAMINATHAN et al. 2016). Bisher konnten

lediglich geringe Mengen viraler RNA in Primärkulturen von Kiemengeweben nach Inokulation von CEV-haltigen Organmaterial mittels PCR nachgewiesen werden (ADAMEK et al. 2017b) eine Virusreplikation in kontinuierlichen Zelllinien wurde bisher nicht beobachtet (JUNG-SCHROERS et al. 2015; LEWISCH et al. 2015). Aufgrund dieses Problems gestaltet sich die Erforschung des Virus als relativ schwierig. Um noch mehr über das Virus zu erfahren, ist es zwingend notwendig, die Forschung im Bereich der CEV Diagnostik und der Kultivierung des Virus zu intensivieren.

5.2 Auswahl des Probenmaterials

In der vorliegenden Studie wurde als Probenmaterial entweder frisch eingefrorenes Kiemengewebe oder in 100%igem Isopropanol gelagertes Kiemengewebe verwendet.

Darüber hinaus wurden Rückstellproben untersucht, bei denen es sich um eingefrorene Organpoolproben handelte, die aus einem Gemisch von Gewebeproben des Gehirns, der Kiemen, der Milz, der Niere und zum Teil der Leber oder des Enddarms bestanden. Bisher erwies sich Kiemengewebe als das am besten geeignete Probenmaterial (AMITA et al. 2002;

ADAMEK et al. 2017b). Selbst bei klinisch an KSD erkrankten Karpfen war nur im Kiemengewebe ein hoher Gehalt an CEV-spezifischen DNA-Sequenzen nachweisbar, während in anderen Geweben keine oder nur geringe Mengen an CEV-spezifischer DNA zu finden war (ADAMEK et al. 2017b). Auch elektromikroskopisch waren Viruspartikel fast ausschließlich in Kiemenmaterial sichtbar (MIYAZAKI et al. 2005). Dass sich bei einer hohen Viruslast in infizierten Fischen Viruspartikel ebenfalls im Wasser nachweisen lassen, ist beim Cypriniden-Herpesvirus-3 erwiesen (BAUMER et al. 2013). Es ist also in Betracht zu ziehen, dass es sich durchaus ähnlich bei dem CEV verhält, zumal das Virus durch Kohabitation von gesunden Karpfen mit klinisch an KSD erkrankten Karpfen auf die gesunden Karpfen übertragen läßt, wenn sie in einem gemeinsamen Aquarium aber ohne Körperkontakt gehalten werden (ADAMEK et al. 2017b). Kiemengewebe, welches ständig mit dem umliegenden Wasser in Kontakt gerät, könnte somit durch CEV, das von erkrankten Fischen ausgeschieden wurde, kontaminiert werden und in der PCR-Untersuchung ein positives Ergebnis zeigen. Für die Diagnostik einer CEV-Infektion ergibt sich daraus die Problematik, dass bei einem qualitativen Nachweis von CEV ohne die Bestimmung der

Viruslast, nicht unterschieden werden kann, ob eine Infektion des Kiemengewebes vorliegt oder ob das Kiemengewebe durch CEV im Wasser kontaminiert wurde. In der vorliegenden Untersuchung wurde ein großer Anteil der Proben mit einem quantitativen PCR-Verfahren untersucht, was eine Bestimmung der Viruslast erlaubte. Mit beiden Verfahren, der TiHo Probe und der TiHo SybrGreen PCR wurde in etwa einem Drittel der untersuchten Karpfen oder Koi Viruslasten von bis zu 10 Kopien viraler DNA nachgewiesen. In Infektionsexperimenten mit CEV wiesen klinisch an KSD erkrankte Karpfen Viruslasten von 10.000 Kopien viraler DNA und mehr auf (ADAMEK et al. 2017b). Eine vergleichbare Viruslast wurde in der vorliegenden Untersuchung bei etwa 40 % der Proben gefunden (siehe Abbildung 32), so dass vermutlich lediglich bei diesen Karpfen oder Koi die Infektion mit CEV eine klinische Relevanz aufwies. Bei Fischen mit sehr geringer Viruslast von 10 Kopien viraler DNA oder weniger wäre eine klinische Relevanz in Frage zu stellen und eventuell sogar eine Kontamination durch Viruspartikel aus dem Wasser in Erwägung zu ziehen.