Tierärztliche Hochschule Hannover
Epidemiologische Untersuchungen zum Carp Edema Virus (CEV) in Deutschland
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines
Doktors der Veterinärmedizin -Doctor medicinae veterinariae-
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von Max Heling
Heinsberg
Hannover 2020
Wissenschaftliche Betreuung: Apl. Prof. Dr. Dieter Steinhagen
Abteilung Fischkrankheiten und Fischhaltung Zentrum für Infektionsmedizin
Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
Dr. Verena Jung-Schroers
Abteilung Fischkrankheiten und Fischhaltung Zentrum für Infektionsmedizin
Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
1. Gutachter: Prof. Dr. Dieter Steinhagen 2. Gutachter: Prof. Dr. Martin Runge
Tag der mündlichen Prüfung: 01.10.2020
Meinen Eltern gewidmet
Inhaltsverzeichnis
INHALTSVERZEICHNIS ... 5
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ... 9
ABBILDUNGSVERZEICHNIS ... 11
TABELLENVERZEICHNIS ... 15
1 EINLEITUNG ... 17
2 LITERATURÜBERSICHT... 20
2.1 Geschichte des Carp Edema Virus (CEV)/ der Koi-Sleepy-Disease (KSD) ... 20
2.2 Diagnostik des CEV ... 22
2.2.1 Zellkultur ... 22
2.2.2 Virusuntersuchung mittels PCR ... 23
2.3 Auswahl des Probenmaterials ... 23
2.4 Charekterisierung des Carp Edema Virus ... 24
2.5 Klinische Symptome der Erkrankung durch das Carp Edema Virus ... 25
2.6 Therapie ... 31
2.7 Mortalität ... 32
2.8 Verbreitung des Carp Edema Virus in Deutschland ... 32
2.8.1 Betroffene Fischarten ... 32
3 MATERIAL UND METHODEN ... 34
3.1 Beschaffung des Probenmaterials ... 34
3.2 Art der Proben ... 34
3.3 Molekularbiologische Untersuchungen ... 35
3.3.1 DNA- Extraktion ... 35
3.3.2 PCR- Methoden ... 37
3.3.2.1 CEFAS Endpunkt-PCR ... 37
3.3.2.2 TiHo Probe qPCR ... 40
3.3.2.3 TiHo SYBR Green qPCR ... 43
3.4 Auswertung der mit unterschiedlichen PCR-Protokollen erzielten Ergebnissen .... 47
3.5 Epidemiologische Untersuchung ... 48
4 ERGEBNISSE ... 50
4.1 Allgemeines ... 50
4.2 Verteilung der positiven Fische in Bezug zur Spezies ... 51
4.3 Rückstellproben ... 53
4.4 Ergebnisse der PCR-Methoden ... 54
4.4.1 Nachweis einer CEV-Infektion mit der CEFAS Endpunkt PCR ... 54
4.4.2 Nachweis einer CEV-Infektion mit der TiHo Probe qPCR ... 54
4.4.3 Nachweis von CEV mit der TiHo Sybr Green qPCR ... 55
4.5 Vergleich der Untersuchungsergebnisse mit unterschiedlichen PCR-Protokollen.. 56
4.5.1 Vergleich der beiden quantitativen PCR-Methoden ... 63
4.6 Ergebnisse der epidemiologischen Erhebung ... 64
4.6.1Geographische Verteilung der CEV-Nachweise... 64
4.6.2 Jahreszeitliches Auftreten von CEV–Infektionen und klinische Krankheitssymptome ... 70
4.6.3 Daten zum Krankheitsbild ... 73
4.6.3.1 Auftreten von weiteren Infektionserregern bei Karpfen und Koi mit CEV- Infektion ... 78
4.6.4 Mortalität bei CEV-Infektionen ... 79
4.6.5 Verbreitungswege des Carp Edema Virus ... 80
5 DISKUSSION ... 82
5.1 Methodik ... 82
5.2 Auswahl des Probenmaterials ... 85
5.3 Epidemiologische Untersuchungen. ... 86
5.4 Probenanzahl ... 87
5.5 Selektion der Proben und Verbreitung der Infektion... 87
5.6 Saisonales Auftreten der Infektion mit CEV und der CEV bedingten Erkrankung . 90 5.7 Auftreten einer klinischen Erkrankung und Mortalitäten bei mit CEV infizierten Karpfen und Koi... 91
5.8 Therapie der Krankheitssymptome mit Kochsalz ... 92
5.10 CEV-positive Nachweise bei anderen Fisch-Spezies als Karpfen ... 93
5.11 Verbreitungswege des Virus ... 94
6 ZUSAMMENFASSUNG ... 96
7 SUMMARY ... 99
8 ANHANG ... 101
8.1 Muster eines Erhebungsbogens ... 101
9 LITERATURVERZEICHNIS ... 107
10 DANKSAGUNG ... 114
Abkürzungsverzeichnis
% Prozent
°C Grad Celsius
Bp Basenpaare
ca. Circa
CEFAS Centre for Environment, Fisheries and Aquaculture Science
CEV Carp Edema Virus
Ct cycle treshold (Schwellenwertzyklus) CyHV-3 Cyprinides-Herpes-Virus-3 siehe auch KHV DNA desoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure) dNTP Desoxyribonukleotidtriphosphat
et al. et alii (und andere)
FLI Friedrich-Loeffler-Institut
KHV Koi-Herpesvirus
KSD koi sleepy disease (Schlafkrankheit der Koi)
LAVES Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit
mg Milligramm
ml Milliliter
ng Nanogramm
nm Nanometer
nM Nanomol
NTC non template control
PCR polymerase chain reaction (Polymerase Kettenreaktion)
QPCR quantitative polymerase chain reaction (quantitative Polymerase Kettenreaktion)
SGPV Salmon-Gill-Poxvirus
SPF spezifisch Pathogen frei
t Tonnen
TiHo Tierärztliche Hochschule Hannover
µg Mikrogramm
µl Mikroliter
µM Mirkomol
U/min Umdrehungen pro Minute
UV Ultraviolett (Licht)
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Deutlicher Enophthalmus bei einem mit CEV infizierten Koi. (Quelle: Dr.
Werner Hoedt) ... 26 Abbildung 2: Deutliche Hautulzerationen an der Ventralfläche eines mit CEV infizierten Koi. Solche Ulzerationen im Bereich der Brustflossen sind typisch für Fische, die viel am Gewässergrund liegen und stellen ein mögliches Zeichen für Apathie dar. (Quelle: Dr. Werner Hoedt) ... 27 Abbildung 3: Juvenile Speisekarpfen mit CEV-Infektion in einem Untersuchungsbecken. Die Fische zeigen, ohne jegliches Narkosemittel, Probleme ihr Gleichgewicht zu halten und wirken apathisch (schwarze Pfeile). ... 28 Abbildung 4: Kiemenspitzennekrose (schwarzer Pfeil) bei einem mit CEV infizierten, juvenilen, Speisekarpfen. ... 29 Abbildung 5: Ödematöse Veränderungen mit zusätzlicher Rötung (schwarze Pfeile) im Bereich des Anus von juvenilen Speisekarpfen, bei denen eine CEV Infektion festgestellt wurde. Zum Vergleich ein nicht ödematöser Anus links (weisser Pfeil). ... 30 Abbildung 6: Massive Hautulzeration auf der linken Seite eines mit CEV infizierten Koi, auf Höhe der Afterflosse, welche ebenfalls betroffen ist. (Quelle: Dr. Werner Hoedt) ... 31 Abbildung 7: Amplifikationsprodukte der Endpunkt PCR unter UV-Licht sichtbar gemacht.
L bezeichnet die DNA Leiter. In Spuren 1-4 sind positiven Proben aufgetragen. Spuren 5 und 6 bezeichnen negative Proben, die kein Amplifikationsprodukt bei 528 Bp aufweisen. N ist die Negativkontrolle der DNA-Extraktion. P bezeichnet die Positivkontrolle. NT ist die DNA- freie Negativkontrolle des Mastermixes. ... 40 Abbildung 8: TiHo Probe qPCR Standard-Kurve zur Quantifizierung von CEV-DNA Kopien. Die Standard-Kurve basiert auf Plasmid Standards mit einer Konzentration von 101 bis 107 Kopien des CEV p4a-Gens. Die Gleichung der Steigungsgeraden ist: Y = -3,337 x LOG(x) + 41,92. ... 42 Abbildung 9: Amplifikationskurven einer TiHo Probe qPCR. Aufgetragen ist das Fluoreszenzsignal (dRn) gegen die Anzahl der PCR-Zyklen. Zu sehen sind Amplifikationskurven von verschiedenen Proben aus den Untersuchungen der Gewebeproben. ... 43
Abbildung 10: Standardkurve der TiHo SYBR Green qPCR Standard-Kurve zur Quantifizierung von CEV-DNA Kopien. Die Standard-Kurve basiert auf Plasmid Standards mit einer Konzentration von 101 bis 107 Kopien des CEV p4a-Gens. Die Gleichung der Steigungsgeraden ist: Y = -3,570 x LOG(x) + 38,91. ... 45 Abbildung 11: Amplifikationskurve einer TiHo SYBR Green qPCR. Aufgetragen ist das Fluoreszenzsignal (dRn) gegen die Anzahl der PCR-Zyklen. Zu sehen sind Amplifikationskurven von verschiedenen Proben aus der Versuchsreihe jeweils im Doppelansatz. ... 46 Abbildung 12: Dissoziationkurve von Amplifikationsprodukten aus der TiHo SYBRR Green qPCR. Dargestellt sind Messwerte für die Änderung der Fluoreszenz in Abhängigkeit von der Temperatur. Das PCR Produkt denaturiert rechnerisch bei 75 °C, dabei wird der Fluoreszenzfarbstoff freigesetzt und das Produkt verliert die Fluoreszenz. Alle Proben, bei denen die stärkste Veränderung in der Fluoreszenzmessung im Temperaturbereich von 74°C bis 76,5°C erfolgte und deren Amplifikationskurve den Schwellenwert überstieg, wurden als positiv bewertet. ... 47 Abbildung 13: Verteilung der auf Infektion mit CEV untersuchten Fischspezies in Verhältnis zu der Gesamtzahl der untersuchten Proben ... 51 Abbildung 14: Verteilung des Nachweises von CEV-Genomsequenzen in unterschiedlichen Fischspezies bezogen auf die Gesamtzahl positiv befundeter Fische ... 52 Abbildung 15: Nachweis einer CEV-Infektion in Proben von Koi mit der TiHo Probe qPCR.
Dargestellt ist die Anzahl Proben mit Virus-Genomlasten von 1 bis 1 x10 E6 Genomkopien . ... 55 Abbildung 16: Anzahl der mit der TiHo Sybr Green als CEV positiv befundeter Proben und die Anzahl CEV-Genom-Kopien pro Probe ... 56 Abbildung 17: Verhältnis positiver zu negativer Proben bei Verwendung der unterschiedlichen PCR-Protokolle im Vergleich mit dem Endergebnis. Die Ergebnisse zusammen betrachtet (Gesamtzahl der Säule) ergeben die gesamte mit dem PCR-Protokoll untersuchten Probenzahl. Diese ist bei der TiHo Probe qPCR deutlich geringer, weil ausschließlich Koi mit dieser PCR-Methode untersucht wurden. ... 57 Abbildung 18: Nachweis von CEV in den untersuchten Proben mit unterschiedlichen PCR- Protokollen. Dargestellt ist der Anteil der Proben, in denen eine CEV-Infektion mit allen
verwendeten PCR-Protokollen oder nur bei Verwendung einzelner Protokolle nachweisbar war. ... 58 Abbildung 19: Anzahl der Virus-DNA Nachweise durch die unterschiedlichen PCR- Methoden und deren Zusammensetzung ... 60 Abbildung 20: Nachweis einer CEV-Infektion mit den in dieser Arbeit verwendeten PCR- Protokollen in Koiproben ... 61 Abbildung 21: Verteilung der Anzahl Kopien CEV-spezifischer DNA, ermittelt mit beiden quantitativen PCR-Methoden, in Proben, in denen mit der CEFAS Endpunkt-PCR kein Amplifikationsprodukt nachweisbar war. ... 62 Abbildung 22: Vergleich des CEV-Nachweises mit der TiHo Probe qPCR (ADAMEK et al.
2016) und der TiHo SYBR Green qPCR (ADAMEK et al. 2017). Als Vergleich wurde der Schwellenwertzyklus (Ct) verwendet, an dem die Amplifikationskurve den Schwellenwert der Fluoreszenz überstieg. Verglichen wurden 170 Proben, in denen mindestens eine der beiden quantitativen PCR Methoden ein Amplifikationsprodukt aufweisen konnte ... 64 Abbildung 23: Geographische Verteilung der eingesandten Proben und der positiven Nachweise einer CEV-Infektion. ... 65 Abbildung 24: Geographische Verteilung von Proben zur CEV-Untersuchung von Fischen aus privaten Gartenteichen. Die Anzahl CEV-positiver privater Gartenteiche ist in den Klammern angegeben. ... 66 Abbildung 25: Geographische Verteilung der für eine CEV-Untersuchung eingesandten Proben aus dem Zierfischeinzelhandel in Deutschland. CEV-positive Proben aus dem Zierfischeinzelhandel sind in den Klammern angegeben ... 68 Abbildung 26: Geographische Verteilung der zur CEV-Untersuchung eingesandten Proben aus Karpfenteichwirtschaften in Deutschland. Die Anzahl CEV-positiver Karpfenteichwirtschaften ist in den Klammern angegeben. ... 69 Abbildung 27: Monatliche Verteilung der eingesandten Proben und Darstellung des Untersuchungsergebnisses. Pos: CEV-Nachweis positive, neg: kein CEV-Nachweis. ... 71 Abbildung 28: Histogramm der Wassertemperatur, bei der CEV-positive Koibestände klinische Symptomen zeigten ... 72 Abbildung 29: Histogramm der Wassertemperatur, bei der CEV-positive Karpfenbestände klinische Symptome aufwiesen ... 73
Abbildung 30: Histogramm zum prozentualen Anteil der Koi im Bestand mit Krankheitssymptomen im Verhältnis zum Gesamtbestand und die Anzahl Proben mit klinisch erkrankten Koi ... 74 Abbildung 31: Auftreten von Symptomen einer Erkrankung in Beständen von Speisekarpfen mit CEV-Infektion. Dargestellt ist der prozentuale Anteil der Fische im Bestand mit Krankheitssymptomen (Klink in %) und die Anzahl Proben mit klinisch erkrankten Karpfen.
... 75 Abbildung 32: Auftreten unterschiedlicher Krankheitssymptome bei mit CEV-infizierten Karpfen und Koi in Abhängigkeit der Viruslast, ermittelt als Anzahl Kopien der Virus-DNA ... 76 Abbildung 33: Odds-Ratio und 95% Konfidenzintervall für die im Erhebungsbogen abgefragten Symptome bei CEV-positiven Koi und Karpfen ... 78 Abbildung 34: Auftreten prozentualer Verluste in CEV-positiven Koibeständen ... 79 Abbildung 35: Auftreten prozentualer Verluste in CEV-positiven Karpfenbeständen ... 80
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Anzahl der beprobten Fischarten ... 35 Tabelle 2: Primersequenzen der CEFAS Endpunkt-PCR (MATRAS et al. 2017), der TiHo Probe qPCR (ADAMEK et al. 2016) und der TiHo SYBR Green qPCR (ADAMEK et al.
2017b) ... 38 Tabelle 3: Pipettierschema für die CEFAS Endpunkt-PCR (MATRAS et al. 2017) bezogen auf eine Probe ... 38 Tabelle 4: Pipettierschema für die TiHo Probe qPCR (ADAMEK et al. 2016) ... 41 Tabelle 5: Pipettierschema für die TiHo SYBR Green qPCR (ADAMEK et al. 2017b)... 44 Tabelle 6: Verhältnis CEV-positiver Proben zur Gesamtzahl der untersuchten Proben aus Koi und Karpfen und anderen Fischspezies. ... 53
1 Einleitung
Das Carp Edema Virus (CEV), welches die Schlafkrankheit der Koi (Koi Sleepy Disease;
KSD) verursacht, ist ein Pocken-ähnliches Virus (MIYAZAKI et al. 2005; NYLUND et al.
2008). CEV ist schon seit der Mitte der 1970er Jahre in Japan bekannt, dort wurde es vorerst durch die Infektion von juvenilen Farbkarpfen (Koi, Cyprinus carpio) bekannt (OYAMATSU et al. 1997; MIYAZAKI et al. 2005). Seit Anfang der 2000er Jahre gab es auch außerhalb von Japan immer häufiger Fälle von Erkrankungen von Koi und Speisekarpfen (Cyprinus carpio), in denen die Fische eine der Koi-Herpes-Virus- Infektion (KHV, CyHV-3) sehr ähnliche klinische Symptomatik zeigten, jedoch nicht positiv auf das KHV getestet werden konnten. Es folgten Nachweise des Carp Edema Virus in Großbritannien (2009), Polen (2013), Niederlande (2013), Frankreich (2013), Österreich (2014), China (2015) und in Indien im Jahr 2015 (HAENEN et al. 2013; WAY u. STONE 2013; LEWISCH et al. 2015; BIGARRÉ et al. 2016; SWAMINATHAN et al. 2016; MATRAS et al. 2017; ZHANG et al. 2017). Im Frühjahr des Jahres 2014 gab es die ersten Nachweise des Carp Edema Virus in Deutschland durch die Abteilung Fischkrankheiten und Fischhaltung der Tierärztlichen Hochschule Hannover (JUNG-SCHROERS et al. 2015). Bis zu den oben genannten Zeitpunkten war in Europa noch nicht viel bekannt über die KSD.
Da dieses Virus neben den Farbkarpfen auch einige Bestände von Speisekarpfen infizierte und das zum Teil große Verluste nach sich zog, bestand großes Interesse darin, mehr über dieses Virus herauszufinden. Bis dahin war bekannt, dass eine Infektion von Karpfen mit CEV zum Teil eine sehr ähnliche Symptomatik auslöst wie eine Infektion mit KHV. Das äußerte sich vor allem in Symptomen wie Kiemennekrosen, Enophthalmus und Apathie.
Besonders der Apathie verdankt das CEV den Namen der Erkrankung, Koi Sleepy Disease.
Betroffene Koi legten sich zum Teil auf den Gewässergrund und verharrten dort völlig regungslos, sie konnten nur durch Aufscheuchen zur Bewegung gebracht werden. In der Diagnostik der Abteilung Fischkrankheiten und Fischhaltung der Tierärztlichen Hochschule Hannover wurden seit Beginn des Jahres 2015 somit standardmäßig bei jeder Untersuchung von Koi und Speisekarpfen eine Kiemenbiopsie zur Untersuchung auf Infektion mit dem Carp
Edema Virus entnommen. Ebenso wurde in Zusammenarbeit mit dem Friedrich-Loeffler- Institut (FLI) und dem Niedersächsischen Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (LAVES) ein Erhebungsbogen zur Schlafkrankheit der Koi entworfen.
Der Erhebungsbogen behandelt viele Fragestellungen zu den Beständen, den klinischen Symptomen, dem Verlauf dieser Symptome und weitere Bereiche, die epidemiologisch von großer Relevanz sein könnten. Dieser Erhebungsbogen wurde auf der Website der Tierärztlichen Hochschule online gestellt. Praktizierende Tierärzte und Teichbesitzer in ganz Deutschland sowie alle Fischgesundheitsdienste, hatten fortan die Möglichkeit Probenmaterial in Kombination mit dem Erhebungsbogen an die Abteilung Fischkrankheiten und Fischhaltung einzusenden. Die Erhebungsbögen wurden ebenfalls bei den in der hauseigenen Diagnostik-Sprechstunde entnommenen Proben durch den behandelnden Tierarzt ausgefüllt.
Zur Untersuchung der gewonnenen und eingesandten Proben auf das Carp Edema Virus wurden drei verschiedene PCR-Methoden verwendet. Zum allein qualitativen Nachweis wurde eine Endpunkt-PCR verwendet, die vom Zentrum für Umwelt, Fischerei und Aquakulturwissenschaften (CEFAS) des Vereinigten Königreiches (UK) entwickelt worden war. Zum quantitativen Virusnachweis wurden zwei Real-Time PCR-Protokolle verwendet, die in der Abteilung Fischkrankheiten und Fischhaltung (ADAMEK et al. 2016; ADAMEK et al. 2017b) entwickelt wurden. Der Zeitraum, über den sich die Probenuntersuchung erstreckte, war von Januar 2015 bis Dezember 2016. In diesem Zeitraum wurden insgesamt 656 Proben mit den genannten PCR-Methoden untersucht. Zusätzliche Proben wurden im Friedrich-Loeffler-Institut auf der Insel Riems untersucht. Die diesen Proben zugehörigen Erhebungsbögen wurden, zusammen mit dem Ergebnis der PCR, an die Abteilung Fischkrankheiten und Fischhaltung der Tierärztlichen Hochschule Hannover eingesendet. Da in einzelnen Einsendungen mehrere Fische untersucht wurden, ergab sich eine betrachtete Fallzahl von 421.
Diese Arbeit soll zeigen, wie weit das CEV in Deutschland verbreitet ist, welche Fischarten betroffen sein können und welche klinischen Symptome bei Infektion mit diesem Virus auftreten. Es soll geklärt werden, ob sich bestimmte Symptome einer Infektion mit CEV zuordnen lassen und wie hoch die Morbidität und Mortalität in den in Deutschland infizierten
Beständen ist. Durch diese Arbeit soll ein größeres Wissen über das durch CEV verursachte Krankheitsgeschehen erlangt werden. Des Weiteren sollen mögliche Wege der Einschleppung und Herkunftsorte dieses Virus ergründet werden. Zudem ist zu diskutieren, welche Bedeutung diesem Virus in Europa zukommt, beziehungsweise wie Infektionen von Beständen künftig einzuordnen sind. Ein weiterer Punkt der Arbeit ist der Vergleich verschiedenen PCR-Methoden auf ihre Eignung für einen sicheren Nachweis einer Infektion mit CEV. Hierbei soll deutlich werden, welche PCR-Methode sich optimal zur Untersuchung auf das CEV eignet, und welche Schwächen die einzelnen PCR-Methoden aufweisen.
2 Literaturübersicht
Der Karpfen (Cyprinus carpio) und seine Farbvariante, der Koi, spielen eine erhebliche Rolle in der Weltwirtschaft. Der Speisekarpfen macht mit einer Produktionsmenge von 4,16 Mio.t ca. 9,0 % der weltweiten Süßwasser Aquakultur aus (WEDEKIND et al. 2016). Ebenso zählt der Koi zu den weltweit am meisten gehandelten Zierfischen (ARIEL 2005). Umso wichtiger ist es, die Gesundheitslage dieser Fischart genau im Blick zu behalten, damit es nicht, wie in den späten 1990er Jahren bei der Verbreitung des Koi Herpes Virus (KHV, CyHV-3), zur Verschleppung weiterer Infektionserreger kommt, was erhebliche Auswirkungen auf den Handel von Speisekarpfen und Koi hatte.
2.1 Geschichte des Carp Edema Virus (CEV)/ der Koi-Sleepy-Disease (KSD)
Im Jahr 1974 kam es zu einem Massensterben von juvenilen Koi, die vor allem ein starkes Ödem aufwiesen, in mehreren Zuchtstätten für Koi in der Niigata Präfektur in Japan (OYAMATSU et al. 1997). Das Massensterben fand in der Zeit von Juni bis Juli während der Regensaison statt und wiederholte sich seitdem jedes Jahr (ONO et al. 1986; OYAMATSU et al. 1997). Der Name Koi-Sleepy-Disease rührt vor allem daher, wie sich die Infektion mit CEV bei adulten Koi äußert. Die Koi liegen apathisch auf dem Teichgrund und lassen sich nur durch aktive Stimulation zur Bewegung animieren (WAY u. STONE 2013). Aufgrund dessen wirkt es so als würde der Koi schlafen, daher der Name Koi-Sleepy-Disease. Es kam häufig zu Verlusten, nachdem die Fische von natürlich belassenen Seen in künstlich angelegte Teiche zur Überwinterung und Selektion umgesetzt wurden (MIYAZAKI et al. 2005).
Ähnliche Fälle gab es in dem selben Zeitraum in den Präfekturen Hiroshima und Saitama (OYAMATSU et al. 1997). Shin-ichi Ono (ONO et al. 1986) ging zunächst davon aus, dass sich die Erkrankung nur auf juvenile Farbkarpfen beschränkte. Bei einer histopathologischen Untersuchung Mitte der 1980er Jahre wurden elektronenmikroskopisch Pockenvirus-ähnliche Partikel entdeckt, eine Isolierung des Virus auf einer Zellkultur war jedoch nicht erfolgreich (ONO et al. 1986). Nach der Analyse mit einer PCR fand man heraus, dass es sich bei dem
Carp Edema Virus um das gleiche Virus handelt, wie bei der Schlafkrankheit der Koi (MIYAZAKI et al. 2005). Der Temperaturbereich, in dem die Fische klinische Symptome zeigten, lag in Japan bei 15 bis 25 °C (MIYAZAKI et al. 2005). 2009 kam es dann zum ersten Virusnachweis von CEV bei Koi in Großbritannien und damit zum Erstnachweis auf dem europäischen Kontinent (WAY u. STONE 2013). Im Jahr 2012 wurde zum ersten Mal CEV bei Speisekarpfen in England nachgewiesen, dessen Bestand eine erhöhte Mortalität und eine klinische Symptomatik aufwies (WAY u. STONE 2013). Es folgten zeitnah Nachweise des Carp Edema Virus in Polen (2013), Niederlande (2013), Frankreich (2013), Deutschland (2014), Österreich (2014), China (2015) und in Indien im Jahr 2015 (HAENEN et al. 2013;
JUNG-SCHROERS et al. 2015; LEWISCH et al. 2015; BIGARRÉ et al. 2016;
SWAMINATHAN et al. 2016; MATRAS et al. 2017; ZHANG et al. 2017). Die Wassertemperaturen bei den bisher bekannten Fällen in Europa lag zwischen 5-22 °C (WAY u. STONE 2013; JUNG-SCHROERS et al. 2015; LEWISCH et al. 2015; BACHMANN u.
KEILHOLZ 2016). Zunächst wurde angenommen, dass sich die Erkrankung an dem Carp- Edema-Virus nur auf juvenile Koi im Juni und Juli beschränkt (ONO et al. 1986).
Mittlerweile ist klar, dass auch adulte Koi und Speisekarpfen erkranken können (WAY u.
STONE 2013) aber die klinischen Symptome stark variieren können, abhängig von Alter und Größe des Fisches (MIYAZAKI et al. 2005). Die Bedeutung der beiden Namen Carp Edema Virus und Koi Sleepy Disease liegt in unterschiedlichen Symptomen begründet. Bei juvenilen Koi fällt vor allem die Ausbildung eines Ödems auf (ONO et al. 1986; OYAMATSU et al.
1997), woher auch der Name „Carp Edema Virus“ stammt. Der Name Schlafkrankheit der Koi (Koi-sleepy-disease/KSD) stammt vom lethargischen Verhalten adulter Koi, die nur durch Stimulation dazu gebracht werden können zu schwimmen, und sonst durchgehend am Teichgrund verharren (WAY u. STONE 2013). Die enorme Ausbreitung des Carp Edema Virus bedroht die Karpfenindustrie und hat das Potential, einen großen finanziellen Schaden zu verursachen (ZHANG et al. 2017). Aus diesem Grund wird auch angeraten, die CEV_PCR zur Routinediagnostik für Karpfen und Koi hinzuzufügen (JUNG-SCHROERS et al. 2015).
2.2 Diagnostik des CEV
Grundsätzlich gibt es relativ wenige Möglichkeiten, eine Infektion mit dem Carp Edema Virus nachzuweisen. Die bisher einzig bekannten Möglichkeiten sind die Nachweise von Pocken-ähnlichen Viruspartikeln unter dem Elektronenmikroskop (MIYAZAKI et al. 2005) und die Anwendung einer Polymerasekettenreaktion (PCR) nach Isolierung der Virus-DNA (OYAMATSU 1996; MATRAS et al. 2017). Der Nachweis von Viruspartikeln unter dem Elektronenmikroskop ist, selbstverständlich, nicht eindeutig hinweisend. Ein ELISA wurde bisher nicht entwickelt.
2.2.1 Zellkultur
Auch das Aufbringen des Carp Edema Virus auf eine Zellkultur gestaltet sich relativ schwierig. Trotz der Benutzung verschiedener Zellkulturen, wie der Fathead Minnow (FHM) und Common Carp Brain (CCB) Zelllinie, war kein zytopathischer Effekt sichtbar (JUNG- SCHROERS et al. 2015). Ebenso berichtet Shin-ichi Ono davon, dass eine Isolierung des Virus auf verschiedene Zellkulturen (RTG-2, FHM und EPC) nicht erfolgreich war (ONO et al. 1986). Bei den CEV-Ausbrüchen in Indien wurden sechs Zellinien aus verschiedenen Zierfischspezies verwendet und nach 15 Tagen Bebrütung und 5 blinden Passagen war kein zytopathischer Effekt sichtbar (SWAMINATHAN et al. 2016). Der Abteilung Fischkrankheiten und Fischhaltung der Tierärztlichen Hochschule Hannover gelang, in Primärkulturen von Kiemen eine Replikation des CEV 48 Stunden nachdem die Kulturen mit dem Virus beimpft wurden (ADAMEK et al. 2017b). Die Replikation des Virus konnte mittels PCR bestimmt werden, dadurch dass man eine Vermehrung der Viruslast feststellen konnte (ADAMEK et al. 2017b). In dem gleichen Versuch probierte man ebenfalls Primärkulturen von Zellen aus Flossen mit dem CEV zu beimpfen, in diesem Fall ist jedoch keine signifikanten Änderung der Viruslast sichtbar geworden (ADAMEK et al. 2017b).
2.2.2 Virusuntersuchung mittels PCR
Bisher beschränkten sich alle bekannten PCR-Protokolle auf die Amplifikation eines Fragmentes des Gens, das für das p4a-Gen des Carp Edema Virus codiert (OYAMATSU 1996; ADAMEK et al. 2017b; MATRAS et al. 2017). Die erste PCR-Methode wurde von Oyamatsu (OYAMATSU 1996) beschrieben. Es handelt sich hierbei um eine Nested-PCR.
Eine weitere Endpunkt-PCR wurde durch das Zentrum für Umwelt, Fischerei und Aquakulturwissenschaften (CEFAS) entwickelt (MATRAS et al. 2017). Es gibt ebenso Real- Time PCR-Protokolle zur Amplifikation des p4a-Gens. Die TiHo-Probe qPCR und die TiHo SYBR Green qPCR wurden durch Mikolaj Adamek entwickelt und beschrieben (ADAMEK et al. 2016; ADAMEK et al. 2017b). Die TiHo Probe qPCR eignet sich nur für die Detektierung von CEV der Genogruppen IIa und IIb (siehe Kapitel 2.4) und damit hautpsächlich Koi, während die TiHo SYBR Green qPCR das Carp Edema Virus sowohl bei Speisekarpfen (Genogruppe I, siehe Kapitel 2.4) als auch bei Koi detektiert (ADAMEK et al.
2017a). In der vorliegenden Studie wurden die beiden oben angegebenen Real-Time PCR- Protokolle und die CEFAS Endpunkt-PCR verwendet. Nach Beginn der Arbeit wurde ebenfalls vom Zentrum für Umwelt, Fischerei und Aquakulturwissenschaften (CEFAS) ein Real-Time PCR-Protokoll entwickelt, welches sowohl bei Koi als auch bei Speisekarpfen anwendbar ist (MATRAS et al. 2017). Beide CEFAS-Protokolle, sowohl für die Endpunkt- PCR als auch für die qPCR zeigen in vorigen Versuchen die höchste Sensitivität (ADAMEK et al. 2017a).
2.3 Auswahl des Probenmaterials
Als Probenmaterial für die PCR-Untersuchung wird entweder ein Organpool (Gehirn, Kiemen, Kopfniere, Milz) (LEWISCH et al. 2015; BACHMANN u. KEILHOLZ 2016) oder einzelne Organe verwendet. Bei genauerer Untersuchung gab es bei der Betrachtung der einzelnen Organe bessere Ergebnisse bei Kiemen oder Hautproben als bei Proben von Leber, Niere und Milz (MIYAZAKI et al. 2005; ADAMEK et al. 2017b). Auch bei der
Untersuchung mit dem Elektronenmikroskop konnten weder Viruspartikel noch andere pathogene Organismen in den Organen Milz, Niere, Pankreas und in Darmteilen dargestellt werden (OYAMATSU et al. 1997). Hingegen konnten Viruspartikel in Kiemen und auch auf der Haut mit dem Elektronenmikroskop nachgewiesen werden (OYAMATSU et al. 1997).
Auch bei der PCR wird anhand mehrerer Darstellungen deutlich, dass in Kiemenproben der Virusnachweis des CEV wesentlich häufiger gelang, verglichen mit Organproben von Hirn, Niere und Milz, wo lediglich in Einzelfällen ein Virusnachweis gelang (AMITA et al. 2002;
BACHMANN u. KEILHOLZ 2016; ADAMEK et al. 2017b). Ebenso wurde das CEV öfter in Kiemen als in der Haut bei CEV-positiven Fischen detektiert (ADAMEK et al. 2016).
Deswegen erscheint Kiemenmaterial als das zuverlässigste Probenmaterial zur Untersuchung mittels PCR auf das CEV (ADAMEK et al. 2016). Ein weiterer Vorteil von Kiemenbioptaten ist, dass man den Fisch nicht für eine Probennahme töten muss. Somit ist die Probennahme für Zierfische im Privatbesitz bei Infektionsverdacht trotzdem praktikabel.
2.4 Charekterisierung des Carp Edema Virus
Das Carp Edema Virus ist ein Virus aus der Familie der Poxviridae und mittlerweile ist auch bekannt, dass es zur Unterfamilie der Chordopoxvirinae gehört (HAENEN et al. 2016).
Ebenfalls zu den Poxviridae gehören ein Virus des Ayu (Plecoglossus altivelis) und das Salmon-Gill-Poxvirus (SGPV) (NYLUND et al. 2008; WADA et al. 2008). Das CEV ist nach phylogenetischer Analyse eine Schwesterspezies zu dem SGPV und beide Viren zeigen als eines der Hauptsymptom Veränderungen an den Kiemen (NYLUND et al. 2008; HAENEN et al. 2016). Ausgereifte Virionen in Kiemenproben sind unter dem Elektronenmikroskop betrachtet ovoid oder pleomorph, mit den Maßen von ca. 333* 413 nm, mit röhrenförmigen Einheiten von ca. 50 nm Durchmesser an ihrer Oberfläche (MIYAZAKI et al. 2005). Wie auch die Versuche mit Zellkulturen zeigten, ist das Kiemengewebe das Hauptziel dieses Virus (ADAMEK et al. 2017b). Das CEV lässt sich mittlerweile in zwei Genogruppen aufspalten.
Aufgrund einer 432 bp langen Sequenz aus dem p4a Gen ließ sich ein Stammbaum erstellen in dem die Diversitäten zwischen den Genogruppen miteinander verglichen werden konnte (MATRAS et al. 2017). Genogruppe I sind ausschließlich Sequenzen aus infizierten
Speisekarpfen. Genogruppe IIa sind Sequenzen, die hauptsächlich von Koi stammen und Genogruppe IIb von infizierten Speisekarpfen aus Polen. Die genetische Ähnlichkeit zwischen den Genogruppen I und IIa liegt zwischen 93,3 und 96,1 %, Genogruppe IIb hat zu Genogruppe I eine Ähnlichkeit von 95,4-96,5 % und zum Rest der Genogruppe II eine Ähnlichkeit von 97,5-98,6 % (MATRAS et al. 2017).
2.5 Klinische Symptome der Erkrankung durch das Carp Edema Virus
Typisch für dieses Pocken-ähnliche Virus ist der Zusammenhang mit einer proliferativen Kiemenerkrankung, wie zum Beispiel bei einem Pockenvirus bei Salmoniden (NYLUND et al. 2008). So wurde auch bei dem ostasiatischen Ayu von einem Pocken-ähnlichen Virus berichtet, welches eine proliferative Branchitis verursachte (WADA et al. 2008). Ebenso zeigten infizierte Ayu ein verringertes Schwimmverhalten und neigten dazu, sich an der Wasseroberfläche zu versammeln (WADA et al. 2008). Derzeit sind nur bei Karpfen, Salmoniden und beim Ayu Pockenvirus-Infektionen bekannt, die alle durch eine Erkrankung der Kiemen gekennzeichnet sind. Auch bei erkrankten juvenilen Koi wurde inaktives Verhalten und die Neigung dazu sich an der Wasseroberfläche oder der Teichwand zu versammeln beschrieben (OYAMATSU et al. 1997). Es gab auch Koi, die sich auf den Boden des Teiches legten und binnen der nächsten Tage verstarben, oftmals mit einem Massensterben in den nächsten 2 Wochen verbunden (MIYAZAKI et al. 2005). Vor allem ältere Fische neigten dazu, sich auf dem Boden des Teiches abzulegen und ein extrem lethargisches Verhalten zu zeigen, woher auch die Namensgebung Schlafkrankheit der Koi (KSD) stammt (WAY u. STONE 2013). Die extreme Lethargie der Fische äußert sich so stark, dass sie nur noch schwimmen, wenn sie dazu stimuliert werden (WAY u. STONE 2013). Koi die an KSD erkrankten, zeigten zudem Hauterosionen, Enophthalmus (MIYAZAKI et al. 2005), Ulzerationen im Maulbereich und nekrotische Stellen der Kiemen (WAY u. STONE 2013). Symptome wie Enophthalmus, Hauterosionen und Veränderungen an den Kiemen sind ebenso typische Symptome der Erkrankung am KHV (CyHV-3) (HEDRICK et al. 2000). Die Untersuchung auf KHV mittels PCR war, trotz der eindeutigen Symptomatik, bei allen Proben negativ (AMITA et al. 2002; HAENEN et al. 2013; JUNG-
SCHROERS et al. 2015). Ebenso gab es keine Nachweise für Parasiten oder Bakterien, die verantwortlich für diese Symptome sind, somit scheint das CEV verantwortlich für diese Symptome zu sein (ONO et al. 1986). Bei den ersten CEV-Fällen in Deutschland wurde auch eine Inflammation des Anus beobachtet (JUNG-SCHROERS et al. 2015). Mikroskopisch auffällig ist vor allem die Verschmelzung der Kiemenfilamente (ONO et al. 1986;
MIYAZAKI et al. 2005). Dadurch, dass es immer neue Erkenntnisse über Symptome und auch über Wassertemperaturen, bei denen die Fische klinische Symptome zeigen, gibt, wird die Frage nach der Bedeutung dieses Pathogens immer größer (ADAMEK et al. 2016).
Generell hängen die gezeigten klinischen Symptome von Größe und Alter des Fisches ab (MIYAZAKI et al. 2005). Ein Teil der Symptome wird in den Abbildungen 1-6 dargestellt.
Abbildung 1: Deutlicher Enophthalmus bei einem mit CEV infizierten Koi. (Quelle: Dr.
Werner Hoedt)
Abbildung 2: Deutliche Hautulzerationen an der Ventralfläche eines mit CEV infizierten Koi. Solche Ulzerationen im Bereich der Brustflossen sind typisch für Fische, die viel am Gewässergrund liegen und stellen ein mögliches Zeichen für Apathie dar. (Quelle: Dr. Werner Hoedt)
Abbildung 3: Juvenile Speisekarpfen mit CEV-Infektion in einem Untersuchungsbecken. Die Fische zeigen, ohne jegliches Narkosemittel, Probleme ihr Gleichgewicht zu halten und wirken apathisch (schwarze Pfeile).
Abbildung 4: Kiemenspitzennekrose (schwarzer Pfeil) bei einem mit CEV infizierten, juvenilen, Speisekarpfen.
Abbildung 5: Ödematöse Veränderungen mit zusätzlicher Rötung (schwarze Pfeile) im Bereich des Anus von juvenilen Speisekarpfen, bei denen eine CEV Infektion festgestellt wurde. Zum Vergleich ein nicht ödematöser Anus links (weisser Pfeil).
Abbildung 6: Massive Hautulzeration auf der linken Seite eines mit CEV infizierten Koi, auf Höhe der Afterflosse, welche ebenfalls betroffen ist. (Quelle: Dr. Werner Hoedt)
2.6 Therapie
Eine Therapie des Carp Edema Virus ist bislang noch nicht bekannt. Wie bei vielen viralen Infektionen ist eine symptomatische Therapie daher die einzige Lösung. Es ist bekannt, dass einige Koizüchter und Händler die Wassertemperatur erhöhen, um klinische Symptome zu lindern. Japanische Koifarmer erhöhen, nach dem Umsetzen der Koi von Naturteichen in große Becken, den Salzgehalt im Wasser auf 0,5 % (MIYAZAKI et al. 2005). Bei Import von Koi aus anderen Gegenden, werden sie sogar von den Koizüchtern in Japan über 4 Wochen in Wasser mit einem Salzgehalt von 0,5 % gehalten, um einem Ausbruch der Schlafkrankheit der Koi vorzubeugen (MIYAZAKI et al. 2005). In Relation zu dieser Vorgehensweise in Japan ist über eine mögliche Persistenz des Virus in den Koi nachzudenken. Eine mögliche stressbedingte Reaktivierung der CEV-Infektion ist in Betracht zu ziehen (ADAMEK et al.
2016).
2.7 Mortalität
Gerade aufgrund der ähnlichen Symptomatik zu KHV ist es auch wichtig zu erfahren, wie hoch die Mortalität in den Teichen bei einer Erkrankung mit dem CEV ist. Es besteht die Hypothese, dass es durch die Schädigung der Kiemen zur erschwerten Sauerstoffaufnahme kommt und damit zu einer Hypoxie, weshalb die Fische auch lethargisches Verhalten zeigen (MIYAZAKI et al. 2005). Letzten Endes sterben due Fische aufgrund des Sauerstoffmangels (MIYAZAKI et al. 2005). Aus den ersten Berichten aus Japan war eine Mortalität von bis zu 80% bekannt (OYAMATSU et al. 1997). Die mit dem CEV infizierten Speisekarpfen in Großbritannien erreichten eine Mortalität von über 50 % (WAY u. STONE 2013). In Österreich lag die Mortalität bei 16 % in einer Speisekarpfenzucht (LEWISCH et al. 2015). In polnischen Aquakulturen für Karpfen lag die Mortalität bei 90 % (MATRAS et al. 2017), was bisher die höchste beschriebene Mortalität in Europa ist. In China und Indien lag die Mortalität in mit dem Carp Edema Virus infizierten Zuchtanlagen für Koi sogar bei 95 % (ZHANG et al. 2017) beziehungsweise bei 100 % (SWAMINATHAN et al. 2016). Die Massensterblichkeit tritt meistens zwischen dem siebten und zehnten Tag nach der Infektion ein (MIYAZAKI et al. 2005).
2.8 Verbreitung des Carp Edema Virus in Deutschland
Im Jahr 2014 gab es den ersten Fall des Carp Edema Virus in Deutschland bei Koi festgestellt durch die Abteilung Fischkrankheiten und Fischhaltung der Tierärztlichen Hochschule Hannover (JUNG-SCHROERS et al. 2015). 2015 kam es zu den ersten CEV-Nachweisen bei Speisekarpfen in Baden-Württemberg und Bayern (BACHMANN u. KEILHOLZ 2016;
NARDY u. BERGMANN 2016). Die Nachweise von CEV in den direkten Nachbarländern Deutschlands lassen jedoch vermuten, dass mehr als nur diese drei Bundesländer CEV- positive Fische aufweisen können.
2.8.1 Betroffene Fischarten
Bisherigen Berichten zufolge sind nahezu ausschließlich Koi und Speisekarpfen betroffen.
Vor allem aus japanischen Berichten ist nur die Erkrankung von Farbkarpfen bekannt
(OYAMATSU et al. 1997). Dem Bericht aus England zufolge zeigten auch Speisekarpfen Symptome einer CEV-ähnlichen Erkrankung (WAY u. STONE 2013). Ebenfalls bei dem ersten CEV-Bericht aus Österreich wurden Speisekarpfen positiv auf das Virus getestet (LEWISCH et al. 2015). In Baden-Württemberg gab es 2015 einen CEV-positiv getesteten Goldfisch und eine CEV-positive getestete Karausche (NARDY u. BERGMANN 2016).
3 Material und Methoden
3.1 Beschaffung des Probenmaterials
Das Probenmaterial wurde von praktizierenden Tierärzten und Fischgesundheitsdiensten aus ganz Deutschland eingesendet oder in der Diagnostik der Abteilung Fischkrankheiten und Fischhaltung der Tierärztlichen Hochschule Hannover Fischen entnommen. Bei dem eingesandten Probenmaterial handelte es sich um Kiemenproben oder ganze verendete Fische aus erkrankten Beständen mit einer unbekannten Genese der Krankheit oder um Proben, die zur Feststellung des Gesundheitsstatus im Rahmen einer Routineuntersuchung eingesandt wurden. Dieses Probenmaterial stammte aus den Jahren 2015 und 2016. Im Jahr 2015 wurden 253 Proben untersucht, im Jahr 2016 352 Proben. Zusätzlich wurden 51 Rückstellproben untersucht, die in der Abteilung Fischkrankheiten und Fischhaltung in den Jahren 2009 bis 2014 von Koi oder Karpfen entnommen worden waren. Die Proben stammten von Fischen, die eine klinische Symptomatik, die auf eine Infektion mit dem Cypriniden-Herpes-Virus 3 (Koi-Herpesvirus, KHV) hindeutete, aufwiesen. Alle Proben wurden negativ auf das Vorliegen von KHV-Genomsequenzen getestet.
3.2 Art der Proben
Bei den Proben, die in den Jahren 2015 und 2016 zur Untersuchung auf das Carp Edema Virus entnommen oder eingeschickt wurden, handelte es sich um Kiemenproben. Die Kiemenproben wurden im tiefgefrorenen Zustand bei -20 °C oder -80 °C oder in 100 %igem Isopropanol, in einem Verhältnis Kieme zu Isopropanol von 1:10, eingeschickt und bis zur weiteren Untersuchung entweder tiefgefroren bei -80 °C oder in Isopropanol gelagert. Bei den Rückstellproben handelte es sich um Mischgewebeproben, die aus Gewebe des Gehirns, der Kiemen, der Milz, der Niere und zum Teil der Leber oder des Enddarms bestanden. Die Mischgewebeproben wurden bei -20 °C gelagert. Die Proben stammen zum größten Teil von Koi und Speisekarpfen aber auch in geringerer Anzahl von Amurkarpfen (Ctenopharyngodon
idella), Bitterlingen (Rhodeus amarus), Flussbarschen (Perca fluviatilis), Hechten (Esox lucius), Kaulbarschen (Gymnocephalus cernua), Goldfischen (Carassius auratus), Goldorfen (Leuciscus idus), Schleien (Tinca tinca), Wimpelkarpfen (Mycocyprinus asiaticus) und Zandern (Sander lucioperca), wie in Tabelle 1 dargestellt wird.
Tabelle 1: Anzahl der beprobten Fischarten
Spezies Anzahl
Amur 11
Barsch 5
Bitterling 1
Goldfisch 11
Hecht 3
Karpfen 131
Kaulbarsch 1
Koi 480
Orfe 1
Rotfeder 1
Schleie 3
Wimpelkarpfen 2
Zander 1
Nicht angegeben 5
Gesamt 656
3.3 Molekularbiologische Untersuchungen 3.3.1 DNA- Extraktion
Für die DNA-Extraktion wurden Kiemenproben, gefroren oder in 100 %igem Isopropanol gelagert, sowie Mischgewebeproben verwendet. Jeweils 25 mg Gewebe wurde zusammen mit einer autoklavierten Stahlkugel in einem 2 ml-Reaktionsgefäß (Carl Roth GmbH, Karlsruhe), bei 20 Hertz zwei Minuten in einer Kugelmühle (Tissuelyser 2, QIAGEN, Hilden) unter
Zusatz von jeweils 180 µl ATL-Puffer (QIAGEN, Hilden) und 20 µl Proteinase K (QIAGEN, Hilden) homogenisiert. Die DNA wurde anschließend aus den homogenisierten Kiemenproben oder Mischgewebeproben mittels QIAamp® DNA Mini Kit (QIAGEN, Hilden) nach dem Protokoll des Herstellers extrahiert und gewaschen. Die Zentrifugationsschritte für die DNA-Extraktion fanden alle unter Verwendung einer Thermo Scientific Heraeus Pico 21 Zentrifuge (Thermo Fisher Scientific, Waltham) statt. Als Negativkontrolle wurde ein 2 ml-Reaktionsgefäß (Carl Roth GmbH, Karlsruhe) ohne Probenmaterial bei jeder DNA-Extraktion mit bearbeitet.
Die Ansätze wurden mittels eines Vortexers gemischt (Harmony Mixer Uzusio VTX 3000L, Laboratory & Medical Supplies, Brigachtal) und anschließend wurde die Suspension eine Stunde bei 56 °C in einem Heizblock (HLC Heiz-Thermomixer MH13, Science Services GmbH, München) unter ständigem Schütteln inkubiert. Nach Lyse des Gewebes wurden 200 µl AL-Puffer (QIAGEN, Hilden) hinzugefügt und bei 70 °C im Heizblock 10 Minuten inkubiert. Zum Fällen der DNA wurden 200 µl 99%iger Ethanol (Sigma Aldrich Chemie GmbH, Steinheim) hinzugegeben. Es folgte eine Zentrifugation bei 8000 U/min für 1 Minute.
Die gesamte Probenflüssigkeit wurde auf eine Silicagel-Säule (Epoch Life Science, Missouri City) übertragen, die sich in einem 2 ml-Reaktionsgefäß befand, und bei 8000 U/min für 1 Minute zentrifugiert. Anschließend wurde die Silicagel-Säule in ein neues 2 ml- Reaktionsgefäß gehängt und das 2 ml-Reaktionsgefäß mit dem Filtrat wurde verworfen. Es wurden 500 µl AW1-Puffer (QIAGEN, Hilden) auf die Silicagel-Säule gegeben und erneut für 1 Minute bei 8000 U/min zentrifugiert. Das Filtrat wurde verworfen und die Silicagel- Säule in ein neues Reaktionsgefäß gegeben. Danach wurden 500 µl AW2- Puffer (QIAGEN, Hilden) hinzugefügt und bei 14.000 U/min für 3 Minuten zentrifugiert. Das 2 ml- Reaktionsgefäß wurde anschließend verworfen und die Silicagel-Säule in ein neues 2 ml- Reaktionsgefäß überführt. Es folgte eine erneute Zentrifugation bei 14.000 U/min für 1 Minute, um alle Reste des AW2-Puffers zu entfernen. Als nächster Schritt schloss sich die Eluierung der DNA an. Hierzu wurde die Silicagel-Säule in ein 1,5 ml-Reaktionsgefäß (Carl Roth GmbH, Karlsruhe) gehängt, 200 µl Nuclease freies Wasser (Thermo Fisher Scientific, Waltham) auf die Silicagel-Säule gegeben und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
Nach abgeschlossener Inkubation wurde bei 8000 U/min 1 Minute zentrifugiert. Danach wurde die Silicagel-Säule verworfen und das Eluat mit der Virus-DNA in ein 0,5 ml
Reaktionsgefäß (Carl Roth GmbH, Karlsruhe) überführt. In allen Eluaten wurde die DNA- Konzentration photometrisch (Nanodrop ND1000 Lab, Peqlab, Erlangen) bei 260 nm und 280 nm bestimmt. Aus den Messungen bei unterschiedlichen Wellenlängen wurde ein Quotient errechnet, der als Maß für die Reinheit der DNA gilt. Der Quotient sollte zwischen 1,8 und 2,2 liegen, um eine möglichst reine DNA vorzuweisen. Die Lagerung der Eluate bis zur weiteren Verwendung erfolgte bei -28 °C.
3.3.2 PCR- Methoden
Zum Nachweis CEV-spezifischer DNA-Sequenzen wurden drei verschieden PCR-Methoden verwendet. Zum einen wurde eine Endpunkt PCR, entwickelt durch das Zentrum für Umwelt, Fischerei und Aquakulturwissenschaften (CEFAS) des Vereinigten Königreichs (UK) und veröffentlicht durch Matras und Kollegen (MATRAS et al. 2017) zum qualitativen Nachweis verwendet. Des Weiteren wurden zur Quantifizierung der Menge der Virus-DNA die TiHo Probe qPCR, veröffentlicht durch Adamek und Kollegen (ADAMEK et al. 2016), und die TiHo Sybr Green qPCR, veröffentlicht durch Adamek und Kollegen (ADAMEK et al.
2017b), verwendet. Alle PCR-Protokolle wurden mit einer DNA-freien Negativkontrolle (non template control, NTC), einer Positivkontrolle, welche aus dem Kiemengewebe eines mit CEV infizierten Koi stammte, und zwei Negativkontrollen aus Geweben von nicht mit CEV infizierten, aus spezifisch Pathogen-freien (SPF) Koi und spezifisch Pathogen-freien (SPF) Karpfen gewonnen, durchgeführt, um eine mögliche Kontamination der Proben innerhalb des Labors auszuschließen. Mit allen verwendeten PCR-Methoden wurde eine Nucleotidsequenz, die ein Fragment des p4a-Gens des Carp Edema Virus codiert, detektiert (OYAMATSU et al.
1997; MATRAS et al. 2017).
3.3.2.1 CEFAS Endpunkt-PCR
Die CEFAS Endpunkt PCR diente als qualitativer Nachweis für CEV-spezifische DNA. Zur Durchführung der PCR wurde das KAPA2G Robust Hot Start Kit (Peqlab, Erlangen) nach der Gebrauchsanweisung des Herstellers verwendet. Das Ansetzen des Mastermixes erfolgte an
einem Arbeitsplatz, welcher sich zwischen den Arbeitsschritten mit UV-Licht bestrahlen lässt.
Das Pipettierschema der CEFAS Endpunkt PCR wird in Tabelle 4 veranschaulicht. Zur Durchführung der PCR wurden die Primer (Sigma Aldrich, Deisenhofen) verwendet, die durch das CEFAS, UK entwickelt worden waren (MATRAS et al. 2017). Die Sequenzen der Primer sind in Tabelle 2 dargestellt.
Tabelle 2: Primersequenzen der CEFAS Endpunkt-PCR (MATRAS et al. 2017), der TiHo Probe qPCR (ADAMEK et al. 2016) und der TiHo SYBR Green qPCR (ADAMEK et al.
2017b)
CEFAS Endpunkt PCR Sequenz: 5´-3´
CEFAS Forward ATGGAGTATCCAAAGTACTTAG
CEFAS Reverse CTCTTCACTATTGTGACTTTG
Größe Amplifikationsprodukt 528 Bp TiHo Probe qPCR
TiHo_qForward TTTAGGAGGACAAGTAAAGTTACCA
TiHo_qReverse GCAAGTTATTTCGATGCCAACC
TiHo_q_Sonde [FAM]CCAGCTCCTACAAGGAAAGCAATTGA
[BHQ1]
Größe Amplifikationsprodukt 167 Bp TiHo Sybr Green qPCR
TiHo_Sybr_qF CATTTCCTAGTTTGTATGGCAAG
TiHo_Sybr_qR TGATGATTGGAATAAGATGTCTGTC
Größe Amplifikationsprodukt 200 Bp
Tabelle 3: Pipettierschema für die CEFAS Endpunkt-PCR (MATRAS et al. 2017) bezogen auf eine Probe
Substanz Menge
Nuclease-freies Wasser 13,45 µl
KAPA2G Buffer A 5,0 µl
dNTPs 0,5 µl
Primer CEFAS F (0,2 µM) 0,5 µl
Primer CEFAS R (0,2 µM) 0,5 µl
Robust Hot Start Polymerase 0,05 µl
DNA (100-200 ng/µl) 5,0 µl
Endvolumen 25 µl
Die Reaktionen wurden in einem Thermocycler (LabCycler, Sensoquest, Göttingen) durchgeführt. Das Temperaturprofil begann mit einer anfänglichen Denaturierung bei 95 °C für 5 Minuten. Hierauf folgten 45 Wiederholungen der Denaturierung bei 95 °C für 30 Sekunden, der Hybridisierung bei 55 °C für 30 Sekunden und der Elongation bei 72 °C für 30 Sekunden. Am Ende schloss sich noch eine Elongation bei 72 °C für 7 Minuten an.
Die Amplifikationsprodukte wurden per Gelelektrophorese in 1 %igem Agarose-Gel mit 4 µl Gel Red DNA Marker (Biotium, Fremont, USA) aufgetrennt und unter UV-Licht mit 302 nm Wellenlänge sichtbar gemacht. Zum Vergleich der Molekülgröße der Amplifikationsprodukte wurde eine DNA-Standardleiter 100 Bp (Carl Roth GmbH, Karlsruhe) mit auf das Gel aufgetragen. Abbildung 7 zeigt ein Agarose-Gel mit positiven Amplifikationsprodukten.
Positiv wurde die PCR dann gewertet, wenn eine Bande mit einer Größe von 528 Bp sichtbar war. Unter Verwendung beider Primer (CEFAS F und CEFAS R) wurde anschließend eine Sanger-Sequenzierung der Amplifikationsprodukte durch LGC Genomics (Berlin) durchgeführt.
Abbildung 7: Amplifikationsprodukte der Endpunkt PCR unter UV-Licht sichtbar gemacht.
L bezeichnet die DNA Leiter. In Spuren 1-4 sind positiven Proben aufgetragen. Spuren 5 und 6 bezeichnen negative Proben, die kein Amplifikationsprodukt bei 528 Bp aufweisen. N ist die Negativkontrolle der DNA-Extraktion. P bezeichnet die Positivkontrolle. NT ist die DNA- freie Negativkontrolle des Mastermixes.
3.3.2.2 TiHo Probe qPCR
Die TiHo Probe qPCR (ADAMEK et al. 2016) ist eine der beiden Methoden, die zum quantitativen Nachweis der Virus-DNA verwendet wurden. Das Ansetzen des Maxima Probe qPCR Mastermixes (Thermo Fisher Scientific, Waltham) erfolgte ebenfalls an einem Arbeitsplatz, welcher sich zwischen den Arbeitsschritten mit UV-Licht bestrahlen lässt. Das Reaktionsgemisch wurde in 8er PCR-Kombi Strips (Biozym Scientific GmbH, Hessisch Oldendorf) gefüllt. Die DNA wurde in einer, vom Mastermix Arbeitsplatz, räumlich getrennten UV-Werkbank hinzu pipettiert. Tabelle 4 stellt das Pipettierschema der TiHo Probe qPCR dar. Die Sequenzen der Primer (Sigma Aldrich, Deisenhofen) und die Sequenz der Sonde (Sigma Aldrich, Deisenhofen) werden in Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 4: Pipettierschema für die TiHo Probe qPCR (ADAMEK et al. 2016)
Substanz Menge
Maxima Probe qPCR Mastermix (mit 10 nm ROX) (Thermo Fischer Scientific) 12,5 µl Nuclease freies Wasser (Thermo Fischer Scientific) 2,25 µl Primer Mix (TiHo_qF+TiHo_qR) (900 nM von jedem Primer) 5,25 µl
DNA (100-200 ng/µl) 5,0 µl
Endvolumen 25,00 µl
Bei jeder Durchführung der TiHo Probe qPCR wurden routinemäßig als Standards serielle Verdünnungen eines rekombinanten Plasmids, das für ein Fragment des p4a-Gens des CEV codiert, in den Konzentrationen von 107 bis zu 101 Kopien mitgeführt. Dadurch ergab sich die Möglichkeit, den bei der Amplifikation entstehenden Wert des Schwellenwert-Zyklus (Ct) zusammen mit der vorher angegebenen Konzentration des Plasmids, das für das p4a-Gen codiert, linear in einem Diagramm als Standardkurve darzustellen (Beispiel s. Abbildung 8).
Mittels der Standardkurve war es möglich, die DNA-Konzentration im Probenmaterial zu quantifizieren. Die Reaktionen wurden im Stratagene Mx3005P Thermocycler (Agilent, Santa Clara, USA) durchgeführt. Das Amplifikationsprogramm begann zunächst mit einer Denaturierung der DNA bei 95°C für 10 Minuten. Hierauf folgten 40 Wiederholungen der Denaturierung bei 95°C für 30 Sekunden und Hybridisierung bei 60°C für 30 Sekunden. Alle Daten der TiHo Probe qPCR wurden mit der Software MxPro (Version 4.10,Agilent, Santa Clara, USA) dargestellt und ausgewertet. In Abbildung 8 wird eine Amplifikationskurve der TiHo Probe qPCR dargestellt.
Abbildung 8: TiHo Probe qPCR Standard-Kurve zur Quantifizierung von CEV-DNA Kopien. Die Standard-Kurve basiert auf Plasmid Standards mit einer Konzentration von 101 bis 107 Kopien des CEV p4a-Gens. Die Gleichung der Steigungsgeraden ist: Y = -3,337 x LOG(x) + 41,92.
Abbildung 9: Amplifikationskurven einer TiHo Probe qPCR. Aufgetragen ist das Fluoreszenzsignal (dRn) gegen die Anzahl der PCR-Zyklen. Zu sehen sind Amplifikationskurven von verschiedenen Proben aus den Untersuchungen der Gewebeproben.
3.3.2.3 TiHo SYBR Green qPCR
Als weitere Methode zum quantitativen Nachweis von CEV-spezifischer DNA wurde die TiHo SYBR Green qPCR (ADAMEK et al. 2017b) verwendet. Das Ansetzen des Mastermix fand ebenfalls an einer UV-Werkbank statt. Die Sequenzen der Primer (Sigma Aldrich, Deisenhofen) sind in Tabelle 2 dargestellt. Als Grundlage wurde der Maxima SYBR Green Mastermix (Thermo Fisher Scientific, Waltham) verwendet, das Pipettierschema wird in Tabelle 5 angegeben. Das Reaktionsgemisch wurde in 8er PCR-Kombi Strips (Biozym Scientific GmbH, Hessisch Oldendorf) pipettiert.
Tabelle 5: Pipettierschema für die TiHo SYBR Green qPCR (ADAMEK et al. 2017b)
Substanz Menge
Maxima Sybr Green Mastermix (mit 10nm Rox) (Thermo Fischer Scientific)
10,0 µl
Primer TiHo_Sybr_qF (0,2 µM) 0,4 µl
Primer TiHo_Sybr_qR (0,2 µM) 0,4 µl
Nuclease freies Wasser (Thermo Fischer Scientific) 4,2 µl
DNA (100-200 ng/µl) 5,0 µL
Endvolumen 20 µl
Das Amplifikationsprogramm der TiHo SYBR Green qPCR begann mit einer Denaturierung bei 95 °C für 10 Minuten, gefolgt von 40 Wiederholungen der Denaturierung bei 95 °C für 30 Sekunden, der Hybridisierung bei 55 °C für 30 Sekunden und der Elongation bei 72 °C für 30 Sekunden. Am Ende jedes Durchgangs wurde eine Dissoziationskurve aufgenommen und Ergebnisse mit einem einzelnen Schmelzpunkt der Amplifikate bei ca. 75 °C wurden als positiv angesehen, der Toleranzbereich lag bei 74°C bis 76,5°C. Die Dissoziationskurve wird in Abbildung 12 veranschaulicht. Die Reaktion wurde im Stratagene Mx3005P Thermocycler (Agilent, Santa Clara, USA) durchgeführt. Alle entstandenen Daten wurden mit der Software MxPro (Version 4.10, Agilent, Santa Clara, USA) ausgewertet. Bei jeder Durchführung der TiHo SYBR Green qPCR wurden serielle Verdünnungen einer Lösung mit rekombinanten Plasmiden, das das p4a Gen des CEV codiert, in den Konzentrationen von 107 bis zu 101 Kopien mitgeführt. Aus den dabei entstandenen Werten des Schwellenwert-Zyklus (Ct) wurde, in Kombination mit den vorher angegebenen Konzentrationen der Kopien, eine Standardkurve erstellt (Abbildung 10). Diese diente zur Quantifizierung der Kopienzahl der Virus-DNA im Probenmaterial. Eine Amplifikationskurve der TiHo SYBR Green qPCR ist in Abbildung 11 zu sehen.
Abbildung 10: Standardkurve der TiHo SYBR Green qPCR Standard-Kurve zur Quantifizierung von CEV-DNA Kopien. Die Standard-Kurve basiert auf Plasmid Standards mit einer Konzentration von 101 bis 107 Kopien des CEV p4a-Gens. Die Gleichung der Steigungsgeraden ist: Y = -3,570 x LOG(x) + 38,91.
Abbildung 11: Amplifikationskurve einer TiHo SYBR Green qPCR. Aufgetragen ist das Fluoreszenzsignal (dRn) gegen die Anzahl der PCR-Zyklen. Zu sehen sind Amplifikationskurven von verschiedenen Proben aus der Versuchsreihe jeweils im Doppelansatz.
Abbildung 12: Dissoziationkurve von Amplifikationsprodukten aus der TiHo SYBRR Green qPCR. Dargestellt sind Messwerte für die Änderung der Fluoreszenz in Abhängigkeit von der Temperatur. Das PCR Produkt denaturiert rechnerisch bei 75 °C, dabei wird der Fluoreszenzfarbstoff freigesetzt und das Produkt verliert die Fluoreszenz. Alle Proben, bei denen die stärkste Veränderung in der Fluoreszenzmessung im Temperaturbereich von 74°C bis 76,5°C erfolgte und deren Amplifikationskurve den Schwellenwert überstieg, wurden als positiv bewertet.
3.4 Auswertung der mit unterschiedlichen PCR-Protokollen erzielten Ergebnissen
In einigen Proben konnte nicht mittels aller durchgeführten PCR-Protokollen CEV- spezifische DNA detektiert werden. In der Beurteilung wurde eine Probe als positiv
angesehen, wenn in den Proben mittels einer der drei PCR Protokolle ein Amplifikationsprodukt der CEV-DNA nachgewiesen werden konnte.
3.5 Epidemiologische Untersuchung
Zur Erhebung verschiedener Daten zum Krankheitsbild, das durch eine Infektion mit dem Carp Edema Virus verursacht wird, wurde in der Abteilung Fischkrankheiten und Fischhaltung, der Tierärztlichen Hochschule Hannover, in Kooperation mit dem Niedersächsischen Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (LAVES) und dem Friedrich-Loeffler-Institut (FLI), ein Erhebungsbogen zur Schlafkrankheit der Koi erstellt. Der Erhebungsbogen (im Anhang) umfasste die Kontaktdaten des Fischbesitzers oder des behandelnden Tierarztes, um bei eventuellen Rückfragen einen Ansprechpartner zu haben. Bestandsdaten zum Krankheitsgeschehen sowie zur Herkunft der betroffenen Fische und zur möglichen Weiterverbreitung der Infektion (Einschleppungsweg und Austragungsweg) wurden ebenfalls im Erhebungsbogen abgefragt. Die Erhebungsbögen wurden zusammen mit dem Probenmaterial von dem behandelnden Tierarzt oder dem zuständigen Fischgesundheitsdienst, in die Abteilung Fischkrankheiten und Fischhaltung der Tierärztlichen Hochschule Hannover eingesandt. Insgesamt wurden Erhebungsbögen in den gesamten Jahren 2015 und 2016 angenommen und ausgewertet. Zusätzlich wurden noch Rückstellproben der Abteilung Fischkrankheiten der TiHo aus den Jahren 2009 bis 2014 untersucht, die Erhebungsbögen wurden hierbei anhand der Angaben in den Anamnesebögen der behandelnden Tierärzte ausgefüllt. In 42 Fällen wurde die Beprobung der Fische und Untersuchung auf CEV im Friedlich-Loeffler-Institut auf der Insel Riems vorgenommen. In diesen Fällen wurden die Erhebungsbögen gemeinsam mit dem Ergebnis der PCR Untersuchungen vom Friedlich-Loeffler-Institut an die Abteilung Fischkrankheiten der TiHo übermittelt. Bei den Proben, die in der Diagnostiksprechstunde der Abteilung Fischkrankheiten der TiHo entnommen wurden, wurden die Erhebungsbögen durch den behandelnden Tierarzt der Abteilung Fischkrankheiten ausgefüllt. Die Daten der Erhebungsbögen wurden digital mit Microsoft Excel® erfasst. Eine Auswertung der Daten erfolgte im Friedrich-Loeffler-Institut auf der Insel Riems gemeinsam mit Mitarbeitern des
dortigen Institutes für Epidemiologie. Die statistischen Berechnungen wurden mit dem Programm R (Version 3.4.1, R Studio, Boston) und mit Microsoft Excel® durchgeführt. Es wurde auf Normalverteilung mit dem Kolmogorov-Smirnov-Test geprüft. Als Hypothesentests wurden der exakte Test nach Fisher, der Chi-Quadrat-Test und der Zweistichproben t-Test angewendet. Effekte wurden dann als signifikant angesehen, wenn der P-Wert < 0,05 war. Die graphischen Darstellungen wurden ebenfalls mit dem Programm R (Version 3.4.1, R Studio, Boston) und mit Microsoft Excel® vorgenommen. Die Darstellungen der geographischen Verteilung von Einsendungen und positiven CEV Nachweisen erfolgten mit dem Programm ArcMap (Version 10.3, ESRI, Kranzberg) unter Verwendung der GIS-Daten (Bundesamt für Karthographie und Geodäsie, Frankfurt am Main).
4 Ergebnisse
4.1 Allgemeines
Insgesamt wurden 656 Proben untersucht, hierunter waren 51 Rückstellproben aus den Jahren 2009 bis 2014. Aus dem Jahr 2015 wurden 254 Proben untersucht, im Jahr 2016 351 Proben. 42 Proben wurden im Friedrich-Loeffler-Institut als CEV positiv befundet und die epidemiologischen Erhebungsbögen zugesendet. Da keine der PCR-Methoden als Goldstandard angesehen werden sollte, reichte ein positiver Nachweis von CEV- Genomsequenzen mit einer der PCR-Methoden pro Probe aus, um die Probe im Endergebnis als positiv anzusehen. Von den Rückstellproben wurden 22 Proben als positiv befundet. Von den im Jahr 2015 eingesandten Proben wurden 100 als positiv befundet. Von den Proben aus 2016 wurden insgesamt 130 Proben als positiv angesehen. Insgesamt wurden somit im Zeitraum der Erhebung, vom 01. Januar 2015 bis zum 31. Dezember 2016, 252 positive Endergebnisse festgestellt. Die 656 untersuchten Proben verteilten sich auf 480 Koi, 131 Karpfen, 11 Goldfische, 11 Amurkarpfen, 5 Barsche, 3 Hechte, 3 Schleien, 2 Wimpelkarpfen, je einen Bitterling und Kaulbarsch, eine Orfe, eine Rotfeder und einen Zander. Bei 5 Proben wurde die Fischspezies nicht angegeben. Die Verteilung der untersuchten Proben wird in der Abbildung 13 veranschaulicht.
Abbildung 13: Verteilung der auf Infektion mit CEV untersuchten Fischspezies in Verhältnis zu der Gesamtzahl der untersuchten Proben
4.2 Verteilung der positiven Fische in Bezug zur Spezies
Unter den 252 als CEV positiv befundeten Fischen gab es 179 Koi, was einen prozentualen Anteil von ca. 71,0 % ausmacht. Darauf folgten, mit einem Anteil von 24,6 %, 62 positiv getestete Karpfen. Des Weiteren wurden in 4 Proben ohne Speziesangabe, in 2 Proben von Barschen, 2 Proben von Hechten, einer Probe von einem Amurkarpfen, einer Probe von einem Kaulbarsch und einer Probe von einem Zander CEV-spezifische DNA-Sequenzen nachgewiesen. Die Verteilung der positiven Proben auf die verschieden Fischspezies wird in der Abb. 14 dargestellt.
Amur Barsch Bitterling Goldfisch Hecht Karpfen Kaulbarsch Koi Orfe Rotfeder Schleie Wimpelkarpfen Zander
Nicht angegeben
Abbildung 14: Verteilung des Nachweises von CEV-Genomsequenzen in unterschiedlichen Fischspezies bezogen auf die Gesamtzahl positiv befundeter Fische
Bezogen auf die gesamte Probenzahl der jeweiligen Spezies fällt besonders auf, dass 37,3 % aller beprobten Koi ein positives Endresultat nach der PCR- Untersuchung aufwiesen, bei den Karpfen sind es mit 47,3 % beinahe die Hälfte aller beprobten Karpfen. Die Tabelle 6 stellt für die einzelnen Spezies das Verhältnis der positiv befundeten Fischen zur Gesamtzahl der untersuchten Fische dieser Spezies dar.
Koi Karpfen nicht angegeben Barsch
Hecht Amur Kaulbarsch Zander
Tabelle 6: Verhältnis CEV-positiver Proben zur Gesamtzahl der untersuchten Proben aus Koi und Karpfen und anderen Fischspezies.
Spezies Gesamt Positiv Anteil
(Prozent)
Viruslast (Anzahl CEV-Genomkopien)
Amur 11 1 9,1 4,28E+00
Barsch 5 2 40,0 3,14E+00-1,06E+01
Bitterling 1 0 0
Goldfisch 11 0 0
Hecht 3 2 66,6 1,10E+00-6,52E+01
Karpfen 131 62 47,3 1,00E+00-4,03E+06
Kaulbarsch 1 1 100,0 1,66E+01
Koi 480 179 37,3 1,00E+00- 4,82E+06
Orfe 1 0 0
Rotfeder 1 0 0
Schleie 3 0 0
Wimpelkarpfen 2 0 0
Zander 1 1 100,0 1,19E+03
4.3 Rückstellproben
Durch die Untersuchung der KHV-Rückstellproben aus der Diagnostiksprechstunde der Abteilung Fischkrankheiten und Fischhaltung der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus den Jahren 2009 bis 2014 gelang es, eine Infektion mit dem Carp Edema Virus in Koibeständen in Deutschland auf das Jahr 2009 zurück zu datieren. Die ersten Nachweise einer CEV-Infektion in Speisekarpfen konnten mit den hier untersuchten Proben jedoch nur bis auf das Jahr 2014 nachvollzogen werden.
4.4 Ergebnisse der PCR-Methoden
4.4.1 Nachweis einer CEV-Infektion mit der CEFAS Endpunkt PCR
Die CEFAS Endpunkt-PCR, beschrieben durch Matras (MATRAS et al. 2017), wurde zum qualitativen Nachweis einer CEV-Infektion verwendet. Sie eignete sich sowohl zur Detektion des Carp Edema Virus der Genogruppe I, als auch der Genogruppen IIa und IIb. Zur Auswertung wurden die Amplifikationsprodukte elektrophoretisch in einem 1 %igem Agarose-Gel aufgetrennt. Bei einem positiven Resultat wurde unter UV-Licht mit der Wellenlänge von 302 nm eine Bande auf derselben Höhe wie die Positivkontrolle, bei 528 Bp, sichtbar. Von 656 untersuchten Proben wurde mit der CEFAS Endpunkt-PCR in 180 Fällen ein Amplifikationsprodukt von 528 Bp detektiert. In einem Fall stellte sich jedoch nach Sequenzierung des Amplifikationsproduktes heraus, dass es sich um eine Sequenz aus dem Karpfen-Genom handelte. Somit wurden durch die CEFAS Endpunkt-PCR 179 positive Resultate erzielt.
4.4.2 Nachweis einer CEV-Infektion mit der TiHo Probe qPCR
Die TiHo Probe qPCR (ADAMEK et al. 2016) ist eine der zwei verwendeten PCR-Protokolle zum quantitativen Virusnachweis. Sie eignet sich zur Untersuchung auf CEV der Genogruppe IIa, die überwiegend Koi infiziert. Deswegen sollte bei einem Methodenvergleich immer die Relation zu Koi-Proben und nicht zu allen untersuchten Fischen gesehen werden. Dieses qPCR-Protokoll erwies sich in den getätigten Versuchen als relativ sensibel, da sie auch in einigen Proben nur eine Kopie der Virus-DNA detektierte. Insgesamt wurden 152 positive qPCR Resultate in 473 untersuchten Koi-Proben erzielt. Die Abbildung 15 stellt eine Verteilung der positiven CEV-Nachweise mit der TiHo Probe qPCR und die Anzahl ermittelter Genomkopien dar. In in einem Fall gab es ein Amplifikationsprodukt aus einer Kiemenprobe eines Karpfens, jedoch ist zu erwähnen, dass bei der Bestimmung der Genomkopien bei der Untersuchung dieser Probe ein Unterschied von 20 Zyklen zwischen der TiHo Probe qPCR (Ct 37,15) und der TiHo SYBR Green qPCR (Ct 17,55) bestand.
Abbildung 15: Nachweis einer CEV-Infektion in Proben von Koi mit der TiHo Probe qPCR.
Dargestellt ist die Anzahl Proben mit Virus-Genomlasten von 1 bis 1 x10 E6 Genomkopien .
4.4.3 Nachweis von CEV mit der TiHo Sybr Green qPCR
Die TiHo Sybr Green qPCR ist ebenfalls eine Methode zur quantitativen Bestimmung der Abundanz der Virus-DNA in den untersuchten Proben. Mit diesem PCR-Protokoll wurden positive CEV-Nachweise sowohl bei der CEV-Genogruppe I, als auch der CEV-Genogruppe IIa und IIb erzielt. Beschrieben wurde die TiHo Sybr Green qPCR durch Adamek (ADAMEK et al. 2017b). In der Anwendung auf die untersuchten Proben zeigte die TiHo Sybr Green qPCR auch eine gute Sensitivität, da sie ebenfalls Virus_DNA von nur einer Kopie in den Proben detektierte. Mit der TiHo Sybr Green qPCR wurden 225 Proben als CEV-positiv befundet, bei 656 insgesamt beprobten Fischen. Das amplifizierte Fragment der Nucleotidsequenz des p4a-Gens ist bei der TiHo Sybr Green qPCR ca. 200 Bp groß.
Abbildung 16 zeigt die Anzahl der positiv befundeten Proben in Relation zu der Anzahl der CEV-Genomkopien in den jeweiligen Proben.
0 5 10 15 20 25 30 35 40
1,00E+00 1,00E+01 1,00E+02 1,00E+03 1,00E+04 1,00E+05 1,00E+06
TiHo Probe QPCR
Anzahl TiHo Probe QPCR
Anzahl der Proben
Genomkopien
