T- ZELLAKTIVIERUNG
5. METHODEN
5.1 In-vivo Studie
5.1.1 Versuchstiere
135 männliche C57/BL6-Mäuse (Zentrales Tierlabor der Medizinischen Hochschule Hannover) wurden in 17 unterschiedliche Gruppen eingeteilt. Das mittlere Körpergewicht betrug 28 h ± 4 g und das durchschnittliche Alter 6-8 Wochen. 6 Mäuse bildeten die Kontrollgruppe (K), die lediglich anästhesiert wurden. 49 Tiere wurden in 8 unterschiedliche Versuchsgruppen eingeteilt (Tab. 5.1) und mit TBC 1269 behandelt. Die übrigen 80 Mäuse zählten zur Vergleichsgruppe (Placebo-Gruppe), die gleichen experimentellen Vorgängen ausgesetzt wurden, jedoch statt einer TBC-Applikation lediglich dessen Vehikel (Placebo) verabreicht wurde (Tab. 5.2).
Die Haltung der Tiere erfolgte bei normalem circadianen Rhythmus mit Tageslicht und 22 ± 2°C. Futter und Wasser stand ihnen ad libitum zur Verfügung.
5.1.2 Versuchstiergruppen
49 Mäuse wurden in 8 unterschiedliche Gruppen (und Kontrollgruppe) wie folgt eingeteilt (Tab. 5.1):
Tabelle 5.1: Versuchsablauf der 8 Gruppen mit TBC-Behandlung und der Kontrollgruppe
Lap.=Laparotomie, I/R=Ischämie/Reperfusion, TBC=TBC 1269, CLP=caecale Ligatur und Punktion, sofort=direkt nach Laparotomie, N= Anzahl der Mäuse, h= Stunden
N Gruppe Anästhes
6 I/R4h+CLP48h Ja Ja Ja Nach 4h Nach 8h Nach 8h Nach 48h
5 I/R4h+CLP 96h Ja Ja Ja Nach 4h Nach 8h Nach 8h Nach 96h
80 Mäuse wurden in 8 unterschiedliche Gruppen, die mit Placebo behandelt wurden, wie folgt eingeteilt (Tab. 5.2):
Tabelle 5.2: Versuchsablauf der 8 Gruppen mit Placebo-Behandlung
Lap.=Laparotomie, I/R=Ischämie/Reperfusion, CLP=caecale Ligatur und Punktion, sofort=direkt nach Laparotomie, N= Anzahl der Mäuse, h= Stunden
N Gruppe Anästhes
11 I/R4h+CLP 48h Ja Ja Ja Nach 4h Nach 8h Nach 8h Nach 48h
10 I/R4h+CLP 96h Ja Ja Ja Nach 4h Nach 8h Nach 8h Nach 96h
5.2 Messparameter
5.2.1 Klinische Grundmessgrößen
Als klinische Grundmessgrößen wurden die rektale Körpertemperatur (°C) und das Körpergewicht (g) zu Beginn jeden Versuchstages einmal täglich morgens und immer zur gleichen Uhrzeit untersucht und dokumentiert. Zusätzlich wurden während der postoperativen Tage die Wundverhältnisse im Operationsgebiet begutachtet.
5.2.2 Aktivität
Das Aktivitätsniveau der Mäuse wurde täglich stets zur gleichen Uhrzeit und vor jeglicher Versuchsdurchführung und Manipulation am Tier beurteilt. Definierte Verhaltensmerkmale während eines Versuchszeitraums wurden mit dem gesunden Basislevel zu Versuchsbeginn verglichen und daraus ein individueller Aktivitätslevel der Maus erhoben (Tab. 5.3)
Tabelle 5.3: Aktivitätseinteilung der Mäuse
Level Qualität Verhaltensmerkmale
6 Sehr aktiv Kräftig, neugierig, schnelle Bewegungen
5 Aktiv Neugierig, schnell, vereinzelte Aktivitätspausen
4 Eingeschränkt aktiv Häufige Aktivitätspausen, reagiert auf externe Zuwendung
3 Ruhig Selten Aktivität, desinteressiert an Umwelt, schläfrig
2 Lethargisch Keine Aktivität, Verharren in einer Position, keine Nahrungsaufnahme
1 Moribund Keine Aktivität, Vitalfunktion (z.B. Atmung) deutlich reduziert, Tod zu erwarten
5.3 Versuchsprotokoll des Ischämie-Reperfusions-und CLP-Modells („two-hit“)
Die Narkose der Mäuse erfolgte bei erhaltener Spontanatmung mittels 100 mg/kg Körpergewicht Ketamin-Lösung und 16 mg/kg Körpergewicht Xylazin, welche subcutan injiziert wurden.
Nach Eintreten der Anästhesie konnte das Fell im Abdominalbereich rasiert, gereinigt und desinfiziert werden. Es folgte eine ca. 2 cm lange kraniokaudale Laparotomie in der Linea alba.
Weite Darmabschnitte wurden auf einen mit isotoner Natriumchloridlösung getränkten Tupfer hervorgelagert, um den Zugang zur Aorta abdominalis und Vena cava caudalis zu erleichtern.
Eine Ischämie (first-hit) der unteren Extremitäten konnte erreicht werden durch die 4 stündige infrarenale Ligatur der Aorta abdominalis und der Vena cava caudalis mit einem Faden aus Seide. Diese Ligatur wurde nach erneuter Anästhesie gelöst und es erfolgte die Reperfusion für weitere 4 Stunden.
Zur Vermeidung einer Thrombosierung der distalen Gefäße während der Ischämiephase wurden alle Tiere subcutan initial mit Heparin antikoaguliert (Liquemin®, 12,5 I.E./Tier).
Die caecale Ligatur und Punktion (CLP) (second-hit) wurde an der narkotisierten Maus in den Gruppen CLP 48h- und CLP 96h + TBC 1269 direkt nach der Laparotomie, in den Gruppen I/R+CLP 48h+TBC 1269 und I/R+CLP 96h+TBC 1269 zum Ende der Reperfusion über die bereits angelegte Laparotomie vorgenommen. Die Ligatur wurde distal der Ileocaecalklappe mit einem 3-0 Faden angelegt. Im Weiteren wurde das Caecum an der mesenteriumfernen Seite zweifach mit einer 23-gauge Nadel punktiert und vorsichtig caecaler Inhalt exprimiert.
Direkt nach Lösen der Ligatur (first-hit) beim Ischämie/Reperfusionsmodell wurde in den Gruppen I/R 4h, I/R 48h, I/R+CLP48h und I/R+CLP96h TBC 1269 injiziert. In der Gruppe CLP 48h und CLP 96h wurde das TBC 1269 direkt nach der caecalen Ligatur und Punktion (second-hit) verabreicht (Tabelle 5.1).
Eine TBC 1269-Stammlösung der Endkonzentration 100 mg pro ml konnte mittels steriler Ringer-Laktat-Lösung hergestellt werden. Bis zum weiteren Gebrauch erfolgte die Aliquotierung und anschließende Lagerung dieser Gebrauchslösung bei –80°C.
Die TBC-Dosis betrug 25 mg/kg Körpergewicht und wurde in die Schwanzvene injiziert. Das
Nach einer 4 stündigen Beobachtungszeit wurden die Tiere der Gruppe I/R4h getötet. Nach 8 Stunden wurden die Tiere der Gruppe R8h getötet. Die Tiere der Gruppen I/R 48h und R 48h wurden nach einem Beobachtungszeitraum von 48 Stunden getötet und nach 48h oder 96h die Tiere der Gruppen CLP 48h/96h, Laparotomie 48h/96h und I/R+CLP 48h/96h.
Den Tieren wurde während dieses Beobachtungszeitraumes 1 mal täglich 1 ml einer Ringer-Laktat-Lösung subcutan injiziert. Nach Beendigung der Laparotomie wurden die Mäuse unter eine Infrarotlichtlampe gestellt.
5.3.1 Tötung der Tiere zur Blut- und Organentnahme
Getötet wurden die Tiere im narkotisierten Zustand mittels Exsanguation durch Punktion des retrobulbären Venenplexus der Maus. Hierfür wurde vom medialen Augenwinkel eine Hämatokrit-Glaskapillare drehend in Richtung Kiefergelenk eingeführt. Dabei wurde die Tenon’sche Kapsel, als elastischer Widerstand spürbar, überwunden und die Glaskapillare bis zum Erreichen der knöchernen Orbita vorgeschoben. Das gewonnene Vollblut wurde zentrifugiert, anschließend das Serum abpipettiert und bis zur weiteren Bearbeitung bei –80°C tiefgefroren.
Unmittelbar im Anschluss an die Blutentnahme erfolgte post mortem die Präparation und die Entnahme der Lunge und es wurde ein broncho-alveoläre Lavage (BAL) durchgeführt. Ein Lungenflügel wurde kryokonserviert (Myeloperoxidasebestimmung) und der verbleibende Teil der Lunge, nach Entnahme der BAL, über das bronchiale System mit 5% phosphat-gepuffertem Formalin infiltriert und in 5% phosphat-gepuffertem Formalin aufbewahrt (Histologie).
Daraufhin wurde die Leber entnommen, wovon der eine Teil zur weiteren Aufarbeitung kryokonserviert (Myeloperoxidasebestimmung) und der andere Teil in Formalin fixiert (Histologie) wurde. Zuletzt wurden noch die Milz und beide Nieren entnommen, die für die spätere histologische Aufbereitung in Formalin konserviert wurden.
5.3.2 Broncho-alveoläre Lavage (BAL)
Die BAL wurde durchgeführt, um Aussagen über die kapillare Permeabilität der Lunge in-vivo zu erhalten. Hierfür wurde die Trachea mit einer stumpfen Kanüle sondiert und mit einem Faden fixiert. Die Kanüle wurde bis zur Bifurcatio trachea vorgeschoben.
Anschließend wurde die Lunge mit 1 ml steriler Kochsalzlösung (NaCl 0,9%) infundiert.
Durchschnittlich 70% der infundierten Flüssigkeit konnten durch Absaugen zurückgewonnen werden. Die erhaltene Lavageflüssigkeit wurde in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur weiteren Aufarbeitung bei –80°C gelagert.
5.4 In-vitro-Studie
5.4.1 Quantitative Proteinbestimmung nach Lowry
Die Bestimmung des Gesamt-Proteingehalts im Mäuseserum und aus der BAL zur Quantifizierung des alveolären Endothelschadens erfolgte nach dem Prinzip folgender Farbreaktion: Proteine reduzieren während der Inkubationszeit Cu(II) Ionen zu Cu(I) Ionen, welche mit Phosphomolybdat-Phosphowolframat einen blau-grünen Komplex bilden, dessen Absorption bei 578 nm photometrisch bestimmt werden kann.
Zusammensetzung der Lösungen:
Lowry I
Lösung A: 2 % Na2CO3
0,02 % Na-K-Tartrat 0,4 % NaOH
Lösung B: 0,5 % CuSO4
49 Teil Lösung A + 1 Teile Lösung B
Lowry II
Folin-Ciocalteu-Phenolreagenz (Phosphomolybdat-Phosphowolframat, 1:1 mit H2O verdünnt) BSA-Eichlösung: 3,7-92 µg/ml
Durchführung:
In Zweifachansätzen wurden jeweils 50 µl Probe, 50 µl BSA-Eichlösungen und 50 µl Wasser (Kontrolle), mit Lowry I Lösung (2450 µl/Probe) versetzt und 15 Minuten bei Raumtemperatur (RT) inkubiert.
Nach Zugabe von je 200 µl Lowry II Lösung und einer 30 minütigen Inkubationszeit erfolgte die photometrische Absorptionsbestimmung bei einer Wellenlänge von 578 nm gegen den Nullwert. Die Konzentration wurde mittels Interpolation der Extinktion in der Standardkurve errechnet.
5.4.2 Messung der Myeloperoxidaseaktivität (MPO) in murinem Lungen- und Lebergewebe
Bei der Myeloperoxidase handelt es sich um ein kationisches Enzym (Molekulargewicht:146 kD) der Lysosomen neutrophiler Granulozyten.
Es wurde die Akkumulation der neutrophilen Granulozyten anhand der MPO-Konzentration im Lungen- und Lebergewebe gemessen.
Eine direkte Beziehung zwischen der Aktivität der MPO im Gewebe und der Anzahl der dort vorhandenen neutrophilen Granulozyten ist bewiesen (ALLAN 1985).
Zunächst wurden leere Eppendorfgefäße, in der Anzahl der Gewebeproben, gewogen.
Das kryokonservierte Gewebe wurde anschließend unter flüssigem Stickstoff in der Reibschale zermahlen und in die Eppendorfgefäße gefüllt. Somit konnte das eigentliche Gewicht des Gewebes errechnet werden.
Jede Gewebeprobe wurde nun mit 1,4 ml kaltem Phosphatpuffer (0,02 M Kalium-Phosphatpuffer, pH 7,4) versetzt und auf dem Rüttler durchmischt.
Es folgte ein 15 minütiger Zentrifugationsschritt bei 14.000 rpm (ca.10.000 g).
Die erhaltenen Pellets wurden daraufhin ´“gewaschen“, indem der Überstand verworfen, danach die Pellets mit neuem Kaliumphosphatpuffer aufgefüllt, die Pellets suspendiert und zuletzt erneut zentrifugiert wurden. Dieser Vorgang wiederholte sich 3 mal.
Nach einer Inkubationszeit von 2 Stunden bei 60° C wurden die Pellets in 1 ml „warmen“
(Raumtemperatur) HTAB-Puffer (Hexadecyltrimethylammoniumbromid-Puffer) resuspendiert. Eine Ultraschall-Homogenisation erfolgte für 10 Sekunden.
In 3 Zyklen wurden dann die Proben in flüssigem Stickstoff eingefroren und wieder aufgetaut.
Anschließend wurden sie erneut für 10 Sekunden mittels Ultraschall homogenisiert und auch wieder für 15 Minuten zentrifugiert bei 14.000 rpm (ca. 10.000 g).
In einer Photoküvette wurden nun 70 µl des Überstand und 700 µl 3,3-5,5 Tetramethylbenzidine versetzt und bei 655 nm im Photometer gegen Wasser gemessen.
5.5 Histologie
5.4.1 Aufbereitung der Proben
Die nach Tötung der Tiere entnommenen Organe (Lunge, Leber, Nieren, Milz) wurden für mindestens 7 Tage in 5% phosphatgepufferter Formaldehyd-Lösung aufbewahrt.
Für die lichtmikroskopischen Untersuchungen wurden die Gewebeproben für zwölf Stunden in fließendem Leitungswasser gewässert, um das Formalin herauszuwaschen. Nach mehreren Arbeitsschritten erfolgte schließlich die Einbettung der Gewebeproben in Paraffin. Von den gewonnenen Paraffinblöcken wurden 3 µm dicke Schnitte angefertigt, die anschließend mit Hämatoxylin und Eosin angefärbt wurden.
5.5.2 Bewertung der histologischen Präparate
Lunge
Die histologischen Präparate der Lunge wurden hinsichtlich granulozytärer Infiltrationen und interstitieller Ödeme lichtmikroskopisch untersucht.
Leber
Die histologischen Präparate der Leber wurden in Hinsicht auf Granulozyteninfiltrationen, interstitielle Ödeme und hydropische Degenerationen beobachtet.
Milz
Die histologischen Präparate der Milz wurden bezüglich der Fülle der weißen Pulpa, der Abgrenzung roter von weißer Pulpa sowie nekrotischer Veränderungen untersucht.
Niere
Die histologischen Präparate der Niere wurden in Bezug auf glomeruläre Infiltrationen neutrophiler Granulozyten bewertet.
Die Unterteilung der Befunde erfolgte jeweils in den Kategorien ohne besonderen Befund (-), geringgradige (+) und mittelgradige (++) pathologische Veränderungen. Die lichtmikroskopische Auswertung fand mit 20- und 40-facher Vergrößerung statt.
5.6 Durchflusszytometrische Analyse von T-Lymphozyten
Die Durchflußzytometrie dient dem Nachweis und der Differenzierung von bestimmten Subpopulationen der T-Lymphozyten, ebenso der Analyse apoptotischer T-Lymphozyten.
5.6.1 CD4-, CD8- und CD56-T-Lymphozyten und apoptotische Zellen
Als detektierte Marker sind von T-Lymphozyten exprimierte Zelloberflächenantigene verwendet worden, dazu zählen das CD4-Antigen der T-Helferzellen, das CD8-Antigen der zytotoxischen T-Zellen und das CD56-Antigen der Natürlichen Killerzellen (NK-Zellen).
Um die CD-Antigene der T-Lymphozyten zu erkennen, wurden monoklonale anti-CD-Antikörper verwendet, die mit Flureszenzfarbstoffen (Fluorochrome) konjugiert sind, hierzu zählen:
Anti-Maus-CD4-Antikörper + Fluoresceinisothiocyanat (FITC), anti-Maus-CD8-Antikörper + Phycoerythrin (PE), anti-Maus-Ly49-Antikörper + FITC (entspricht dem anti-CD56-Antikörper des Menschen).
Anschließend wurden pro Maus 3 FACS-Röhrchen vorbereitet. Darunter befanden sich ein Kontrollröhrchen ohne Antikörper für den Leerwert, ein Röhrchen mit je 5 µl anti-CD4-und anti-CD8-Antikörpern gefüllt und eins mit 5 µl anti-Ly49-Antikörper. Nach Aufarbeitung der Blutzellen und Milzsuspension erfolgten noch mehrere Zentrifugationsschritte bis zur eigentlichen FACSScan-Analyse.
Zur Identifizierung apoptotischer Zellen wurde an Fluorochrom FITC konjugiertes Annexin V verwendet, welches eine frühzeitige Analyse apoptotischer Prozesse ermöglicht. Annexin, als calciumabhängiges und Phospholipid-bindendes Protein, hat eine hohe Affinität zu Phosphatidylserin (PS) und bindet an Zellen, die PS exponiert haben (WUCHER 1997). Diese Veränderung ist ein frühzeitiges Merkmal des programmierten Zelltodes. Zur weiteren Differenzierung spät-apoptotischer und nekrotischer Zellen, die für Annexin V ebenfalls positiv erscheinen, wurde der Farbstoff Propidiumiodid (PI) hinzugezogen.
Für die duchflusszytometrische Untersuchung der Milzsuspension und Blutzellen wurde je ein FACS-Röhrchen pro Maus mit 5µl Annexin V und 5 µl PI versetzt und daraufhin der oben erwähnten FACScan-vorbereitenden Aufarbeitung unterzogen.
5.7 Messung von Interleukinen in murinem Serum
Inwieweit TBC 1269 Einfluß auf den pathophysiologischen Prozess des Ischämie/Reperfusionsschadens (first-hit) und der durch CLP ausgelösten Sepsis (second-hit) der Mäuse nimmt, sollte mit Hilfe des BDTM Cytometric Bead Array (Mouse Inflammation CBA, BD Biosciences, San Diego) bestimmt werden. Hierbei wurde auf durchflußzytometrischer Grundlage die Plasmakonzentrationen folgender Zytokine bestimmt:
MCP-1, TNF-α, INF-γ, IL-6, IL-10,IL-12p70.
Bei dieser durchflußzytometrische Analyse werden die in Suspension befindlichen Zellen in einem schmalen Flüssigkeitsstrom an einem Mikroskopzytophotometer unter Messung der Fluoreszenz vorbeigeführt.
Die quantitative Bestimmung der Zytokine im Plasma erfolgte anhand einer Standardreihe und Messung der Fluoreszenzintensität.
Die CBA enthält sechs sogenannte „Perlen“ (beads) von einer speziellen Oberflächenbeschaffenheit, indem sie mit dem Fluoreszenzfarbstoff Phycoerythrin (PE) konjugiert sind und für jedes Zytokin mit einem spezifischen Antikörper (capture antibodie) ausgestattet sind. Die Suspension aus Probenmaterial und „beads“ ermöglicht die Messung mehrerer Analysewerte in einem geringen Plasmavolumen, da die Proben mit den PE-konjugierten „capture beads“ einen „Sandwich-Komplex“ bilden, der dem gebräuchlichen ELISA ähnlich ist.
Prinzip des Tests:
Zu Testbeginn mußte eine Standard-Testreihe mit einzelnen Zytokin-Konzentrationen von 20 pg/ml bis 5000 pg/ml angesetzt werden. Eine Negativ-Probe mit einer Konzentration von 0 pg/ml diente zur Kontrolle. Dem Standard wurde ein testeigenes Lösungsmittel (Protein gepufferte Lösung) zugesetzt und für 15 Minuten inkubiert.
Es folgte eine Verdünnung des Standards auf Werte von 1:256, 1:128, 1:64, 1:32, 1:16, 1:8, 1:4, 1:2 und einer ohne Verdünnung. Vor dem weiteren Gebrauch der einzelnen capture beads war es erforderlich sie kräftig zu durchmischen. Jeder Standard- und Testprobe wurde hierbei jeweils 10 µl eines jeden capture beads zugegeben. Als Nächstes wurden 50 µl dieses
Antikörpergemisches in Standard-Reaktionsgefäße gegeben. Anschließend wurden 50 µl der Standardverdünnungen den Kontrollproben zugegeben und jeweils 50 µl des Probenmaterials in die Reaktionsgefäße verbracht. Ebenfalls wurden alle Proben mit 50 µl PE-Reagenz konjugiert. Es folgte eine 2 stündige Inkubation bei Raumtemperatur und ohne Lichteinwirkung. Während dieser Zeit wurden die Cytometer Setup Proben angesetzt und gemessen. Hierfür wurden je 50 µl der „Cytometer Setup Beads“ in mit A,B,C beschriftete Reaktionsgefäße gegeben.
Der Probe B wurden 50 µl der an FITC gekoppelten Antikörper hinzugefügt, der Probe C 50 µl der PE konjugierten Antikörper (PE-Positivkontrolle). Eine Inkubationszeit von 30 Minuten bei Raumtemperatur und Dunkelheit folgte.
Nun wurden die Proben B und C mit jeweils 400 µl PBS ( Phosphate Buffered Saline, ph=
7,4, Zusammensetzung: 40g NaCl, 6,9g NaH2PO4) versetzt und der Probe A 450 µl PBS zugefügt. Nach einer Inkubation von 2 Stunden erfolgte eine 1 ml PBS-Zugabe und anschließender 5 minütiger Zentrifugation. Der Überstand wurde dekantiert und mit 300 µl PBS wurde die Probe resuspendiert.
Zuletzt erfolgte die durchflußzytometrische Analyse (Fluorescent-Activated-Cell-Scanner, Becton Dickinson, Heidelberg), indem die Fluoreszensintensität der einzelnen Proben im FL3-Kanal gegen die Standardproben gemessen wurden.
5.8 Statistik
Alle statistischen Berechnungen erfolgten mit dem Programm SigmaStat® 2.0 (SPSS Inc, Chicago/Illinois). Die Überlebensrate wurde mit dem sogenannten Fisher’s Exakt-Test ermittelt. Alle anderen Parameter der Versuchsgruppen wurden zuerst mittels ANOVA getestet und post hoc mit dem Student’s t-Test geprüft, dabei wurde ein p-Wert <0,05 als signifikant angesehen.