3. Eigene Untersuchungen
3.2 Material und Methodik
3.4.11 Messung längerkettigerFettsäuren
3.4.11.1 Zielsetzung
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, eine Methode zur Messung mittel- und langkettiger Fettsäuren (C6 – C24) im Pansensaft (PAS) mit möglichst einfacher Probenaufbereitung (ohne großen apparativen Aufwand) und rascher Durchführbarkeit (große Probenzahlen) zu erarbeiten.
10 ml Fermenterflüssigkeit
Zentrifugation bei 200 xg *
Bodensatz mit 10 ml Aqua bidest aufrühren; 3 ml dieser Lsg. + 3 ml 20 %ige TCA → PPB1
Zentrifugation von 5 ml Überstand bei 30 000 xg **
Bodensatz mit 5 ml 9%iger NaCl-Lsg aufrühren; erneute Zentrifugation bei 30 000 xg **, 5 min; Bodensatz mit 5 ml Aqua bidest. aufrühren; 3 ml dieser Lsg.
+ 3 ml 20 %ige TCA → BB1
3 ml des Überstandes + 3 ml 20 %ige TCA → BfB1
Die von OUTEN et al. (1976) entwickelte und von SUKHIJA u. PALMQUIST (1988) modifizierte Ein-Schritt-Methode zur Fettsäuremessung wird oben genannten Kriterien für die Untersuchung in Futtermitteln (OUTEN et al. 1974, 1976), Plasma (LEPAGE u. ROY 1986, 1988), in Blättern (BROWSE et al. 1986), Gewebe (MacGEE u. ALLEN 1974, SHIMASAKI et al. 1977, HAAN et al. 1979) Ölsaaten, Ca-Seifen, Milch und Kotproben (SUKHIJA u.
PALMQUIST 1988) gerecht. Die bestehende Methode mußte deshalb für Pansensaft adaptiert werden (s. Tab. 3.7).
3.4.11.2 Prinzip der Methode
Das Prinzip der Methode ist die kombinierte Ein-Schritt-Extraktion mit gleichzeitiger Methylisierung.
3.4.11.3 Material
Die für die Modifikation der Arbeitsvorschrift von SUKHIJA u. PALMQUIST (1988) benötigten Reagenzien, Gerätschaften und Apparate sind in Tabelle 3.7 und 3.8 aufgeführt.
Tab. 3.7: Verwendete Reagenzien, Lösungen und eingesetzte Mengen im Vergleich zur Originalvorschrift (Modifikation fettgedruckt; SUKHIJA u. PALMQUIST 1988)
erarbeitete Methode Originalvorschrift
Reagenzien hergestellte Lösung eingesetzte Menge
0,2 mg/1ml Toluol 1 ml
3 ml Toluol (Merck; Art.-Nr.
1.08331.1000) HCl (20 ml Acetylchlorid/
100 ml wasserfreies
Abb. 3.3: Chromatogramm des internen Standards (vgl. Tabelle 3.7)
Tab. 3.8: Verwendete Gerätschaften und Apparate für die Messung langkettiger Fettsäuren im Pansensaft
Gerätschaften bzw. Apparate Hersteller bzw. Bezugsquelle Pyrex - Glasröhrchen 13 % 100 mm, mit
Schraubkappen und Tefloninlett
Fischer-Scientific; Art.–Nr. 9826-13 Glasröhrchen, 16 % 160 mm, mit
Schraub-kappen;
entsprechende Tefloninletts
LAT; Best.–Nr. 192317521 LAT; Best.–Nr.132924811 Teflonbeschichtete Wägeschale Euro Lab, Katalog- Nr. 1125 Pasteurpipetten 150 mm LAT; Best.–Nr. 197734145 Thermoblock (Durchmesser des
Stahl-Reagenz-glaseinsatzes: 17,2 cm ; Temperaturregler von 0 °C - 200 °C)
Fa. Liebisch; Best.-Nr. CH 20/30/17
Vortex-Rüttler Fa. IDL, Typ RS1
Zentrifuge Fa. Christ, Typ UJ 3s
Trockenschrank Fa. Memmmert, Typ U 15
Dispergierer, Mikra-D8; mit Schneidmesserrotor Ds30/P6 SmR
Fa. ART moderne Labortechnik GC-17A Gas-Chromatograph
Detektorart: FID; Analysebedingungen:
Injektionsvol.: 4 µl; Temperaturprogramm:
Start: 50 °C (1 min); dann Steigerung um
jeweils 20 °C/min bis auf 90 °C (2 min), weitere Zunahme um 5 °C/min bis auf 260 °C (34 min);
totales Zeitprogramm 55 min/Probe. Detektor-Temp.: 270 °C; Injektionsmethode: Splittless;
Trägergas: N2: 30ml/min; H2: 50 ml/min;
Synthetische Luft: 500 ml/min)
Verarbeitungsparameter des Integrators:
Width: 0,2 sec; Threshold (= Slope): 500 µV/min; Minimum Area: 20000 counts; Stop time: 54 min; Methode: ext. St.; Attenuation:
256 mV; Trace Limits: y-Achse Minimum:
- 0,0101; Maximum: 0,3
Shimadzu Europa – GmbH, Deutschland;
Trägergas: Stickstoff (5.0 Messer Griesheim); Synthetische Luft (Messer Griesheim); Wasserstoff (Messer Griesheim)
AOC – 20 s Autosampler Shimadzu Europa – GmbH, Deutschland GC – Säule: SPBTM – PUFA, Silica Capillary
Column (30 m % 0,25 mm % 0,2 µm film)
Supelco Park: Best.-Nr. 2-4314 Bearbeitung u. Integration: Class-VP
Chromatography Data – System, Version 4.3 Shimadzu Class VPTM; Copyright 1998 Shimadzu Scientific Instruments (s. 3.4.11.4)
Shimadzu Europa – GmbH, Deutschland
3.4.11.4 Probenaufbereitung
Als Probenmaterial diente frisch entnommener, nicht filtrierter Pansensaft (PAS, 400 ml, zur Entnahme s. a. 3.2.3). Unter ständigem Rühren (Magnetrührer) wurden jeweils 5 ml PAS in exakt gewogene (auf 0,1 mg) Wägeschälchen überführt.
Anschließend fand eine Trocknung der Proben über 24 h bei 55 °C im Trockenschrank statt.
Nach der Trocknungszeit folgte einerseits die Rückwaage der Schälchen (s. Tab. 3.9;
Transport der Schälchen in Exsikkatoren) und andererseits die Einwaage der getrockneten PAS in 16 % 160 mm lange Kulturröhrchen. Die Überführung des getrockneten PAS verlief problemlos, die Teflonbeschichtung der Wägeschälchen verhinderte eine statische Aufladung, somit konnten zwischen 70 u. 95 % der Trockensubstanz des PAS eingewogen werden. Die weiteren Schritte der Probenaufbereitung werden in Abb. 3.4 dargestellt.
Fortsetzung siehe nächste Seite
Probe in 16 % 160 mm
+ 1 ml Standard + 1 ml Toluol
Proben auf Rüttler 1 min bei geringer Geschwindigkeit rütteln
2 h Thermoblock bei 90 °C; anschließend Proben auf Raumtemperatur abkühlen
+ 3 ml K2CO3 + 2 ml Toluol Röhrchen sicher verschließen
Reagenzien möglichst auf Reagenz-glasboden pipettieren, sonst unvoll-ständige Extraktion und Methylisierung;
Röhrchen sehr fest verschließen
Abb. 3.4: Fortsetzung
Abb. 3.4: Darstellung der modifizierten Probenaufbereitung nach SUKHIJA u. PALMQUIST (1988)
3.4.11.5 Überprüfung der Fettsäureerkennung
Zur Eichung des Gaschromatographen und FS-Erkennung wurden im Vorfeld der Messungen 15 Läufe mit externem Standard [Supelco 37 Component Fame Mix (Art.-Nr. 4-47885, Supelco Park, Bellefonte, PA) 1:10 mit Toluol verdünnt; s. Abb. 3.5] analysiert. Integration und Berechnung erfolgten durch die Class-VP-Software (Shimadzu; vgl. Tab. 3.8).
obere organische Phase mit Pasteurpipette entnehmen, in 13 % 100 mm große Röhrchen übertragen
+ 1 g wasserfreies Na2SO4
Proben 0,5 min rütteln (mittlere Geschwindigkeit);
1 h bei Zimmertemperatur ruhen lassen
Proben 5 min bei 1500 % xg zentrifugieren, klare obere Toluolschicht in Autosamplerflaschen abpipettieren Röhrchen sicher verschließen
Röhrchen sicher verschließen
Proben 0,5 min bei mittlerer Geschwindigkeit rütteln; 5 min bei 1500 % xg zentrifugieren
Te.* leer Rw.** 24 h Rw. 48 h Rw. 72 h Rw. 96 h Rw. 120 h minus T. leer minus T. leer minus 120 h minus 120 h) 1 ml
2,0131 2,0968 2,0981 2,0967 2,0971 2,0968 0,0837 0,0837 0,0000 0,00 0,0167
2,1571 2,2482 2,2481 2,2488 2,2480 2,2489 0,0911 0,0918 - 0,0007 0,77 0,0184
1,7767 1,8691 1,8701 1,8698 1,8700 1,8697 0,0924 0,0930 - 0,0006 0,65 0,0186
1,8873 1,9851 1,9854 1,9853 1,9852 1,9856 0,0978 0,0983 - 0,0005 0,51 0,0197
1,857 1,9483 1,9483 1,9480 1,9482 1,9479 0,0913 0,0909 0,0004 0,44 0,0182
1,8353 1,9252 1,9272 1,9252 1,9260 1,9254 0,0899 0,0901 - 0,0002 0,22 0,0180
1,9088 2,0020 2,0030 2,0030 2,0028 2,0025 0,0932 0,0937 - 0,0005 0,54 0,0187
2,0042 2,1023 2,1021 2,1019 2,1013 2,1019 0,0981 0,0977 0,0004 0,41 0,0195
1,8797 1,9700 1,9721 1,9698 1,9701 1,9700 0,0903 0,0903 0,0000 0,00 0,0181
1,8891 1,9891 1,9894 1,9905 1,9912 1,9902 0,1000 0,1011 - 0,0011 1,10 0,0202
1,9724 2,0696 2,0702 2,0701 2,0703 2,0700 0,0972 0,0976 - 0,0004 0,41 0,0195
2,009 2,0941 2,0940 2,0939 2,0932 2,0930 0,0851 0,0840 0,0011 1,29 0,0168
1,811 1,9051 1,9078 1,9072 1,9070 1,9064 0,0941 0,0954 - 0,0013 1,38 0,0191
2,001 2,0842 2,0852 2,0840 2,0841 2,0837 0,0832 0,0827 0,0005 0,60 0,0165
2,0694 2,1677 2,1678 2,6710 2,1689 2,1680 0,0983 0,0986 - 0,0003 0,31 0,0197
2,1593 2,2543 2,2543 2,2542 2,2541 2,2534 0,0950 0,0941 0,0009 0,95 0,0188
1,8807 1,9792 1,9798 1,9800 1,9795 1,9792 0,0985 0,0985 0,0000 0,00 0,0197
1,9914 2,0892 2,0904 2,0892 2,0902 2,0893 0,0978 0,0979 - 0,0001 0,10 0,0196
1,8029 1,8979 1,8978 1,8987 1,9000 1,8994 0,0950 0,0965 - 0,0015 1,58 0,0193
* Te. Teflonschale leer
** Rw. Rückwaage
85
Abb. 3.5: Chromatogramm des externen Standards
Eine qualitative Überprüfung der Peakfolge (Vergleich der Retentionszeiten) fand einerseits mit Hilfe aller Reinsubstanzen, andererseits durch Addition der Reinsubstanzen zum externen Standard statt. Die Methylveresterungen der Reinsubstanzen wurden nach Anleitung der modifizierten Methode durchgeführt.
Für die Festlegung der Nachweisgrenze wurde der ext. Standard 1:100 mit Toluol verdünnt.
Sie liegt bei 0,525 µmol/l bzw. bei einer Peakfläche von 20000 counts. Für die einzelnen Fettsäuremethylester wurden folgende Variationskoeffizienten der Präzision in Serie ermittelt (Gerätepräzision; s. Tab. 3.10):
Tab. 3.10: Zusammensetzung des externen Standards, Anteile der Ester (%) und jeweils ermittelte Variationskoeffizienten (VK) der Analysenpräzision
Fettsäure (-methylester) der Anteil in (%) VK (%)
C 4 Buttersäure 4 nicht bestimmt
C 6 Capronsäure 4 3,11
C 8 Caprylsäure 4 1,55
C 10 Caprinsäure 4 2,04
C 11 Undecansäure 2 2,65
C 12 Laurinsäure 4 3,04
C 13 Tridecansäure 2 3,25
C 14:0 Myristinsäure 4 3,33
C 14:1 Myristoleinsäure 2 3,24
C 15:0 Pentdecansäure 2 3,36
C 15:1 Pentadecensäure 2 3,26
C 16:0 Palmitinsäure 6 3,02
C 16:1 Palmitoleinsäure 2 2,96
C 17:0 Heptadecansäure 2 2,91
C 17:1 Heptadecensäure 2 3,06
C 18:0 Stearinsäure 4 2,68
C 18:1 c / t Öl- u. Elaidinsäure 4 + 2 (6) 2,66
C 18:2 c Linolsäure 2 3,27
C 18:2 t Linolelaidinsäure 2 3,22
C 18:3 n6 γ-Linolensäure 2 2,49
C 18:3 n3 Linolensäure 2 2,47
C 20:0 Arachinsäure 4 2,38
C 20:2 n6 Eicosadiensäure 2 2,29
C 20:1 n9 Eicosensäure 2 2,27
C 20:3 n6 Eicosatriensäure 2 2,26
C 20:4 n6 Eicosatetraensäure 2 2,57
C 21:0 Heneicosansäure 2 2,28
C 20:3 n3 Eicosatriensäure 2 2,21
Fortsetzung siehe nächste Seite
Tab. 3.10: Fortsetzung
Fettsäure (-methylester) der Anteil in (%) VK (%)
C 20:5 n3 Eicosapentaensäure 2 2,12
C 22:0 4 1,94
C 22:1 n9 Erucasäure 2 2,04
C 22:2 2 1,85
C 23:0 2 1,79
C 22:6 n3 Docosahexaensäure 2 2,07
C 24:0 4 1,47
C 24:1 n9 Nervonsäure 2 3,00
3.4.11.6 Überprüfung des Pansensaftes
Um Matrixeffekte des Pansensaftes ausschließen zu können, wurden ebenfalls alle FS als Reinsubstanzen im Additionsverfahren mit Pansensaft überprüft. Es waren keine Veränderungen im Vergleich zum ext. Standard festzustellen (s. Abb. 3.6).
3.4.11.7 Ergebnisse der Pansensaftuntersuchungen
Durch die genaue Zuordnung der Fettsäuremethylester (Peakfolge) zu den entsprechenden Retentionszeiten konnte bei Auswertung der Pansensaft-Chromatogramme eine sichere Fettsäuremethylesterbestimmung im Pansensaft für folgende FS-Methylester vorgenommen werden:
1.) C6 5.) C16 9.) C18:2 c 13.) C24:0 2.) C12 6.) C17 10.) C18:3 n3
3.) C14 7.) C18 11.) C20:0
4.) C15 8.) C18:1 c/t 12.) C22:0
Bei Betrachtung der Ergebnisse fielen sehr große Abweichungen der einzelnen Variationskoeffizienten auf (s. Tab. 3.11). Während sich die VK des internen Standards zwischen 1,14 % u. 4,19 % bewegten, wiesen die VK der nachgewiesenen Fettsäuremethylester (C6 - C24) im Pansensaft Unterschiede von bis zu 79 % auf (s. Tab.
3.11).
Da die ermittelten VK des internen Standards z. T deutlich unter 5 % lagen, konnte von einer konstanten präparativen Probenaufbereitung ab Einwaage der PAS-TS in die 16 % 160 mm langen Röhrchen (s. Abb. 3.4) ausgegangen werden. Die Fehlerquelle wurde in der Trocknung (ungenügende Trocknungszeit, dadurch bedingte Verdünnung des Pansensaftes) oder der unzureichenden Probenentnahme der 5 ml PAS aus den Bechergläsern vermutet (starke Entmischung des PAS bzw. mangelhafte Homogenisierung).
Abb. 3.6: Chromatogramm eines Pansensafts
1 (5) 14,72 11,78 31,06 32,88 35,12 27,54 34,27 37,93 31,74 32,97 32,02 35,38 n. g.* 1,14 1 (5) 14,16 20,52 19,8 17,75 16,51 11,76 16,29 15,27 11,64 18,75 21,07 17,82 16,11 1,51 1 (5) 21,0 21,45 15,45 18,14 15,89 13,11 15,78 17,33 18,18 19,1 11,9 23,55 n. g. 1,56 1 (5) 4,21 11,52 7,06 5,82 8,32 14,62 13,21 9,02 7,86 9,44 30,03 10,92 n. g. 1,95 2 (4) 10,21 22,77 26,81 26,79 26,65 34,82 23,23 31,63 28,02 74,9 80,76 n. g. n. g. 2,82 2 (5) 7,99 10,56 39,24 42,71 45,94 28,52 37,52 43,28 n. g. 27,81 36,77 37,18 n. g. 3,75 2 (5) 36,06 15,66 13,18 14,82 14,63 22,98 13,28 11,91 15,47 13,49 n. g. n. g. n. g. 2,72 2 (5) 12,25 11,28 5,04 6,4 4,61 3,93 4,18 4,84 6,78 7,38 10,05 7,14 n. g. 1,91 2 (5) 15,88 18,5 13,56 13,16 12,82 15,87 18,47 13,84 14,3 18,23 12,63 25,09 24,11 1,19 2 (5) n. g. 11,98 11,97 12,25 14,16 18,37 13,42 14,81 n. g. 14,3 79,06 8,69 n. g. 1,67 3 (5) 21,07 21,78 16,53 16,24 14,67 17,98 16,09 15,15 12,64 11,65 14,12 15,22 n. g. 1,93 3 (5) 21,12 11,98 12,42 12,43 12,59 11,69 11,78 15,81 12,68 13,93 12,45 12,45 15,97 3,11 3 (5) 14,19 13,6 13,33 12,26 12,27 18,16 12,79 12,23 17,42 64,28 48,21 n. g. n. g. 1,46 3 (5) 23,22 7,48 11,83 23,83 24,69 18,69 25,46 25,09 27,03 28,03 17,83 31,35 13,42 1,38 3 (5) n. g. 13,51 10,17 14,03 11,91 13,16 10,81 12,12 10,88 10,96 59,92 n. g. n. g. 2,06 4 (5) 6,39 10,46 9,61 10,67 12,99 10,28 12,84 13,77 18,1 20,53 20,8 20,21 58,08 2,69 4 (5) 14,17 8,89 31,23 31,75 43,41 36,73 55,9 50,34 n. g. 46,96 51,13 68,07 54,78 4,19 4 (4) 22,52 25,91 19,77 22,12 19,94 21,52 19,52 15,71 16,83 20,11 20,41 20,41 22,22 3,42 4 (4) 20,25 18,56 28,77 27,82 29,54 32,92 32,27 26,2 3,89 68,45 48,69 27,62 n. g. 3,20 4 (4) 8,50 8,43 8,84 8,67 8,59 10,36 8,91 11,13 10,14 10,56 8,15 7,02 6,18 1,51 4 (5) n. g. 12,07 7,96 6,88 6,80 8,30 5,68 6,41 7,78 5,21 6,72 5,60 n. g. 3,00
* n. g. nicht gemessen, bzw. nicht erfaßt n = Anzahl der Messungen
90
Die Überprüfung der Trocknungsrate im Verlauf von 120 h (tägliche Rückwaage, s. Tab. 3.9) ergab, daß die Trocknungszeit von 24 h optimal gewählt war, die Abweichungen lagen zwischen 0,00 und 1,58 %.
Um Aussagen über Homogenisierungseffekte auf die Fettsäuremethylesterkonzentration machen zu können, wurde versucht, eine bessere Durchmischung (Homogenisierung) des PAS zu erreichen. Dazu wurden die Pansensäfte, nachdem sie in Bechergläser gefüllt worden waren, über einen Zeitraum von 2 min mit einem Dispergierer (39000 Umdrehungen/min) homogenisiert. Die anschließende Probenentnahme von 5 ml PAS fand unter ständigem Rühren (Magnetrührer) statt.
Die Homogenisierung der Pansensäfte führte zu einer erheblichen Reduzierung der Variationskoeffizienten der einzelnen Fettsäuren. Sie lagen nunmehr in Bereichen zwischen 1,29 % und 20,3 % (s. Tab. 3.12). Die Mittelwerte und Standardabweichungen der Fettsäure-methylester (C6 – C24) sind der Tab. 3.13 zu entnehmen.
3.4.11.8 Abschließende Wertung
Die Genauigkeit der Methode (Variationskoeffizient der Präzision in Serie des internen Standards von 1,19 % bis 4,19 %) erwies sich als sehr gut. Dies spricht für eine konstante Probenaufbereitung, Extraktion bzw. Methylisierung der FS.
Die hohen Variationskoeffizienten in unhomogenisiertem Pansensaft (PAS) wurden durch Homogenisierungsschritte mit Hilfe eines Dispergierers auf Werte zwischen 1,29 % und 20,3
% vermindert. Dennoch sind für manche Methylester (C17, C18:2c u. C20) hohe Variationskoeffizienten zu erwarten (vgl. Tab. 3.12). Mit den zur Verfügung stehenden Mitteln ließen sich diese nicht weiter senken. Niedrigere VKs sind bei Durchführung einer intensiveren Homogenisierung mittels kleinerer Schneidmesser im Dispergierer durchaus denkbar. Die Probenziehung (5 ml) unter fortwährendem Rühren für die Trocknung erwies sich als geeignet, eine zu starke Entmischung vor der Probengewinnung und damit eine Verfälschung der Ergebnisse zu verhindern.
Die erarbeitete Methode eignet sich sehr gut zur Messung mittel- und langkettiger Fettsäuren (C6 – C24) im Pansensaft, bei einfacher Probenaufbereitung, geringem Apparateaufwand, und gleichzeitig rascher Durchführbarkeit (bis zu 60 Proben/Tag). Somit wurden die in Kap.
3.4.11.1 genannten Zielsetzungen unter den bestehenden Bedingungen erreicht.
Tab. 3.12: Vergleich der FS-Methylsäureester-VKs im homogenisierten PAS zu unhomo-genisiertem PAS
FS
Gruppe 1 (n = 4)
Gruppe 2 (n = 4)
Gruppe 3 (n = 4)
Gruppe 4 (n = 4 )
Gruppe 5 (n = 12)
Gruppe 6 (n = 4)
C 6 2,85 4,88 4,24 6,44 4,95 5,41
C12 2,44 4,90 4,90 6,75 3,86 5,33
int. St. C19 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
C14 5,06 3,63 6,66 7,91 3,87 5,40
C15 4,81 2,97 7,10 6,83 5,08 5,40
C16 4,47 1,80 6,77 7,07 5,52 6,10
C17 2,95 2,04 3,13 12,95 1,94 12,11
C18 4,19 1,68 4,87 6,07 5,16 5,62
C18:1c/t 5,10 1,29 5,44 8,10 5,28 6,67
C18:2c 4,20 2,48 6,52 13,57 6,78 11,45
C18:3 n3 7,64 5,58 4,46 4,73 5,77 7,07
C20 2,47 20,31 14,76 22,34 5,14 8,90
C22 2,47 2,18 5,46 7,62 6,76 5,84
C24 1,91 7,57 9,52 9,74 10,07 9,39
grau hinterlegt: unhomogenisierter PAS 3.5 Statistische Berechnung
Alle Versuchsdaten wurden durch das Datenbankprogramm dBASE III plus (Ashton Tate) erfaßt, mit Hilfe des Programms SPSS (Datenverarbeitungsprogramm SPSS-PC-Inc Chicago) und für folgende Berechnungen herangezogen:
• T-Test für abhängige Stichproben [T-Test PAIRS = ...]
Das verwendete Verfahren lieferte die folgenden Aussagen:
• Mittelwerte (x) und Standardabweichungen (s) für beide Fermentergruppen (KF/FSA)
• Signifikanzen (p)
Meßergebnisse aus einzelnen Fermentern der entsprechenden Fermenterpaare (KF und FSA) zum gleichen Zeitpunkt (Tag, Stunde), dem gleichem Entnahmeort (Fermenter, Überstand) und gleichen Fraktion (u. a. PPB1, BB1, BfB1) während der Läufe (1 - 5) mit und ohne Sulfatzulage wurden zum arithmetischen Mittelwert zusammengefaßt und miteinander verglichen.
Gruppe 1
x * 162,10 434,00 100,00 32,43 22,32 198,03 16,03 198,34 13,60 20,56 13,94 5,58 5,58 4,15
s ** 4,63 10,61 0,00 1,64 1,07 8,86 0,47 8,31 0,69 0,86 1,07 0,14 0,14 0,08
Gruppe 2
x 215,21 603,64 100,00 56,26 38,19 360,83 33,10 378,91 24,22 49,14 35,50 16,43 9,56 9,21
s 10,50 29,57 0,00 2,04 1,13 6,48 0,68 6,36 0,31 1,22 1,98 3,34 0,21 0,70
Gruppe 3
x 270,81 764,51 100,00 59,23 41,08 377,28 31,43 363,44 25,92 47,76 32,56 15,48 9,98 9,26
s 11,49 37,45 0,00 3,94 2,92 25,53 0,98 17,71 1,41 3,11 1,45 2,28 0,55 0,88
Gruppe 4
x 261,67 729,64 100,00 59,23 40,41 368,59 31,32 367,53 24,39 45,63 29,61 15,30 9,41 8,72
s 16,84 49,28 0,00 4,69 2,76 26,07 4,06 22,32 1,98 6,19 1,40 3,42 0,72 0,85
Gruppe 5
x 281,67 838,11 100,00 70,33 48,25 405,60 34,55 398,00 24,35 54,91 40,88 12,43 11,76 10,48
s 13,95 32,36 0,00 2,72 2,45 22,40 0,67 20,53 1,29 3,72 2,36 0,64 0,80 1,06
Gruppe 6
x 262,39 776,44 100,00 68,07 45,15 381,52 35,50 393,71 23,71 51,62 36,39 13,89 12,68 11,56
s 14,20 41,40 0,00 3,67 2,59 23,28 4,30 22,12 1,58 5,91 2,57 1,24 0,74 1,08
* x : Mittelwert
** s: Standardabweichung
grau hinterlegt: unhomogenisierter PAS C19: interner Standard
93
4.
Ergebnisse
In der folgenden Darstellung der Ergebnisse werden die Kontrollfermenter 1 und 2 als „KF”, die Zulagefermenter 3 und 4 als „FSA” bezeichnet. Die signifikanten Differenzen „p-KSA“
zwischen Kontroll- und Versuchsfermentern werden je nach Signifikanzgrad mit * (≤ 0,05);
** (≤ 0,01); *** (≤ 0,001; s. a. Legenden) dargestellt. Mittelwerte und Streuungen sind dem Anhang (Tab. 9.1 – 9.50) zu entnehmen.
4.1 pH-Wert (s. Abb. 4.1 u. Tab. 9.1)
Nach Erreichen des steady state (Tag 7) bewegten sich die pH-Werte in den KF und FSA bis zum 11. Versuchstag auf ähnlichem Niveau (pH 6,72 - 6,77). Unter Sulfateinfluß nahm der pH-Wert der FSA um 0,09 Einheiten zu (bis Tag 17), fiel zwischen dem 18. und 20.
Versuchstag kontinuierlich ab und lag während dieser Zeit oberhalb der KF (0,29 % - 1,32 %;
p-KSA: Tag 14 ≤ 0,05; Tag 15 ≤ 0,01; Tag 17 ≤ 0,01; Tag 18 –20 ≤ 0,05).
Im Nachlauf lagen die FSA-Gehalte zwischen 0,03 und 0,05 pH-Einheiten unter denen der KF, insgesamt aber im Bereich des Vorlaufes.
Die Standardabweichung der Mittelwerte bewegte sich in den KF und FSA zwischen 0,03 und 0,24.
Abb. 4.1: pH-Werte im Pansensaft während 25-tägiger in-vitro-Inkubation in KF-Fer-mentern () und in FSA-FerKF-Fer-mentern (− −), Na2SO4–Zulage ( ), Na2SO4- und Thiaminzulage ( ); n = 5.
* = p-KSA ≤ 0,05; = p-KSA ≤ 0,01; = p-KSA ≤ 0,001 6,65
6,68 6,71 6,74 6,77 6,8 6,83
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 Tag
pH
0
*
*
*
*
*
* *
*
*
*
*
*
4.2 Ammoniakkonzentrationen (s. Abb. 4.2 u. Tab. 9.2)
Die Ammoniakkonzentrationen lagen von Tag 7 (steady state) bis zum Versuchsende in beiden Fermentergruppen zwischen 15,8 und 19,7 mmol/l. Sie wurden durch keine der Zulagen beeinflußt (vgl. Kap.5.5.2).
Die Standardabweichung der Mittelwerte variierte in den KF und FSA zwischen 1,03 und 8,13 mmol/l.
Abb. 4.2: Ammoniakkonzentrationen (mmol/l) im Pansensaft während 25-tägiger in-vitro-Inkubation in KF-Fermentern () und in FSA-Fermentern (− −); Restlegende siehe Abb. 4.1
4.3 Gasproduktion (s. Abb. 4.3 u. Tab. 9.3)
Alle Fermenter unterlagen nach Erreichen des steady state zum Teil erheblichen Schwankungen in der täglichen Gasproduktion. Die einzelnen Volumina bewegten sich im Bereich zwischen 2369 und 2701 ml, wobei die Bildung in den FSA während des gesamten Versuchslaufes etwas niedriger war (- 1,13 %; ns).
Die Standardabweichung der Mittelwerte lag in den KF und FSA zwischen 32,9 und 290 ml.
8 10 12 14 16 18 20 22
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 Tag
mmol/l
0
Abb. 4.3: Gasproduktion (ml) im Pansensaft während 25-tägiger in-vitro-Inkubation in KF-Fermentern () und in FSA-KF-Fermentern (− −); Restlegende siehe Abb. 4.1
4.4 Methananteil an der Gasproduktion (s. Abb. 4.4 u. Tab. 9.4)
Nach Erreichen des steady state variierten die Methanwerte in den KF und den FSA zwischen 7,61 und 8,12 Vol%, wobei die FSA-Konzentration bis zu 5,9 % unter der der KF lag (Tag 10 - 12: p-KSA ≤ 0,05).
Die KF-Methankonzentration blieb bis zum Versuchsende weitestgehend konstant, für die FSA nahm sie dagegen bis zum 15. Tag unter Sulfatwirkung stetig ab (- 22 %), entwickelte zwischen dem 17. und 19. Tag ein Plateau (5,51 – 5,55 Vol%, Abnahme zwischen Tag 15 – 19 um weitere 7,2 % bei zusätzlicher Thiamingabe) und stieg im Nachlauf wieder deutlich an.
Die FSA-Gehalte lagen während der gesamten Zulagephase bis zu 33,2 % unterhalb der KF-Werte (p-KSA: Tag 13 ≤ 0,001; Tag 15 – 17 ≤ 0,001; Tag 18 ≤ 0,01; Tag 19 ≤ 0,001).
Im Nachlauf konnten die FSA weder die Ausgangs- noch die KF-Werte erreichen (- 4,9 %, bzw. - 18,2 %; p-KSA: Tag 20 ≤ 0,01; Tag 21 ≤ 0,05; Tag 23 ≤ 0,001; Tag 25 ≤ 0,05).
Die Standardabweichung der Mittelwerte bewegte sich in den KF und FSA zwischen 0,26 und 1,18 Vol%.
2350 2450 2550 2650 2750
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 Tag
ml
0
Abb. 4.4: Methananteil (Vol%) an der Gasproduktion im Pansensaft während 25-tägiger in-vitro-Inkubation in KF-Fermentern () und in FSA-Fermentern (− −);
Restlegende siehe Abb. 4.1
4.5 Wasserstoffanteil an der Gasproduktion * (s. Abb. 4.5 u. Tab. 9.25)
* Die Angabe des Wasserstoffanteils an der Gasproduktion erfolgt nicht wie die übrigen Gase in Vol%, sondern in mm2. Ursache dafür ist, daß im verwendeten Eichgas aufgrund mangelnder Stabilität kein Wasserstoff vorhanden ist. Die gaschromatographische Vol%-Bestimmung erfolgte über die Identifizierung der H2 -Peakfläche. [1 mm2 entspricht 1 E (Einheit); s. auch 3.4.4].
Während der Kontrollphase lagen die KF-Werte zwischen 26,7 und 29,7 E, die der FSA waren im Vergleich bis zu 27,8 % erhöht. Unter Sulfateinfluß fielen die KF-Gehalte um 12,7 % ab, während die der FSA deutlich um 62,5 % anstiegen (p-KSA: Tag 12 ≤ 0,05).
In der zweiten Zulagephase sank die KF-Konzentration um weitere 48,5 %, die der FSA legte abermals zu (+ 63,7 %). Insgesamt lagen die Wasserstoffanteile (KF) zwischen 25 und 202 % unter den FSA-Anteilen.
Im Nachlauf nahm die Wasserstoffkonzentration in allen Fermenterpaaren deutlich ab, so war sie in den KF durchschnittlich um bis zu 37,4 % niedriger als in der Kontrollphase, die FSA-Gehalte entsprechend um 20,9 %. Die Standardabweichung der Mittelwerte verlief in den KF und FSA zwischen 1,41 und 38,6 E.
5
Abb. 4.5: Wasserstoffanteil (E = mm2) an der Gasproduktion während 25-tägiger in-vitro-Inkubation in KF-Fermentern () und in FSA-Fermentern (− −); Restlegende siehe Abb. 4.1
4.6 Proteinkonzentrationen (s. Abb. 4.6 u. Tab. 9.26)
Nach Erreichen des steady state lagen die Proteinkonzentrationen der beiden Fermenterpaare zwischen 230 und 299 µg/ml, die FSA-Konzentrationen waren bis zu 17 % gegenüber den KF vermindert.
Die Sulfatzulage bewirkte in den FSA während der ersten Phase einen Konzentrationsanstieg von 42,5 % (p-KSA: Tag 15 u. 13 ≤ 0,05; Tag 14 ≤ 0,01; Tag 15 ≤ 0,05) und unter Thiamineinfluß um weitere 26,0 % (Tag 18), die der KF betrug unter Thiamingabe 13,9 % (p-KSA: Tag 17 – 19 ≤ 0,05).
Die KF-Konzentration stieg im Nachlauf noch einmal an und lag durchschnittlich 11,8 % über dem Niveau der Kontrollphase, währenddessen fiel die Proteinkonzentration in den FSA kontinuierlich, lag aber gegen Versuchsende noch mit 31,5 % über dem mittleren Kontrollphasenniveau.
Die Standardabweichung der Mittelwerte variierte in den KF und FSA zwischen 2,77 und 163 µg/ml.
0 20 40 60 80
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 Tag
E
Abb. 4.6: Proteinkonzentration (µg/ml) im Pansensaft während 25-tägiger in-vitro-Inkubation in KF-Fermentern () und in FSA-Fermentern (− −); Restlegende siehe Abb. 4.1
4.7 Cellulaseaktivität (s. Abb. 4.7 u. Tab. 9. 27)
Während der Kontrollphase bewegte sich die Cellulaseaktivität in allen Fermentern zwischen 33,7 und 54,2 U/l.
Unter Sulfateinfluß fiel die Aktivität in den FSA-Fermentern deutlich um 67,3 % (Tag 10 – 14), in den KF stieg sie dagegen geringgradig um 5,04 % an (p-KSA: Tag 15 ≤ 0,05). Unter Thiamingabe kristallisierte sich ein gegensätzlicher Verlauf heraus: die Aktivität steigerte sich in den FSA-Fermentern um 166 % (Tag 14 – 19), in den KF-Fermentern sank sie gleichzeitig um 21,9 %. Bis zum Versuchsende unterlagen beide Fermenterpaare täglichen Schwankungen (zwischen 19,5 und 45,7 U/l). Die Standardabweichung der Mittelwerte bewegte sich in den KF und FSA zwischen 6,59 und 36,3 U/l.
200 250 300 350 400 450 500
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 Tag
ug/ml
0
*
*
*
*
*
*
Abb. 4.7: Cellulaseaktivität (U/l) im Pansensaft während 25-tägiger in-vitro-Inkubation in KF-Fermentern () und in FSA-Fermentern (− −); Restlegende siehe Abb. 4.1
4.8 Essigsäurekonzentrationen Überstand (s. Abb. 4.8.1 u. Tab. 9.10)
Die Essigsäurekonzentrationen bewegten sich in der Kontrollphase zwischen 57,9 und 62,5 mmol/l (FSA - 3,2 % gegenüber KF).
Während sich die KF-Gehalte in der ersten Zulagephase nahezu konstant verhielten, lagen sie in der zweiten Zulagephase 6 % unter dem Niveau der Kontroll- und Nachlaufphase.
Die FSA-Werte verminderten sich unter der Sulfatgabe um bis zu 9,4 % (Tag 15; p-KSA: Tag 14 u. 15 ≤ 0,01) und während der zweiten Zulagephase um weitere 6,75 % (Tag 19: insgesamt 16,2 %; p-KSA: Tag 16 u. 18 ≤ 0,05; Tag 19 ≤ 0,01). Im Nachlauf erreichten die FSA wieder das Kontrollphasenniveau (p-KSA: Tag 21 ≤ 0,01).
Die Standardabweichung der Mittelwerte lag in den KF und FSA zwischen 1,41 und 8,56 mmol/l.
0 10 20 30 40 50 60 70 80
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 Tag
U/l
*
Abb. 4.8.1: Essigsäurekonzentrationen (mmol/l) im Überstand während 25-tägiger in-vitro-Inkubation in KF-Fermentern () und in FSA-Fermentern (− −); Restlegende siehe Abb. 4.1
Fermenter (s. Abb. 4.8.2 u. Tab. 9.9)
Die Essigsäurekonzentrationen der Fermenter waren in beiden Fermenterpaaren fast identisch (FSA: + 0,3 % gegenüber KF).
Sie bewegten sich in den KF bis zum Versuchsende auf dem Niveau der Kontrollphase (60,3 bis 65,8 mmol/l), wobei die Konzentrationen an den Tagen 16 und 19 kurzfristig abfielen (58,9 und 57,3 mmol/l).
In den FSA stellten sich bis zum Ende des Versuchsdurchlaufs entweder dieselben Konzentrationen wie in den KF ein oder lagen bis zu 13,5 % unterhalb dieser (Tag 18). Eine Ausnahme bildeten Tag 11 und Tag 19, mit 1,8 % bzw. 3,5 % höheren KF-Konzentrationen (p-KSA: Tag 15 ≤ 0,01; Tag 17 u. 18 ≤ 0,05). Die Standardabweichung der Mittelwerte verlief in den KF und FSA zwischen 1,44 und 12,1 mmol/l.
47,0 49,0 51,0 53,0 55,0 57,0 59,0 61,0 63,0 65,0
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 Tag
mmol/l
0
*
*
*
*
*
Abb. 4.8.2: Essigsäurekonzentrationen (mmol/l) im Pansensaft während 25-tägiger in-vitro-Inkubation in KF-Fermentern () und in FSA-Fermentern (− −); Restlegende siehe Abb. 4.1
4.9 Propionsäurekonzentrationen Überstand (s. Abb. 4.9 u. Tab. 9.12)
Nach anfänglich starker Zunahme fielen die Propionsäuregehalte beginnend vom 3. Tag (KF) bzw. 4. Tag (FSA) kontinuierlich von 23,1 und 22,7 mmol/l auf 17,3 (KF: Tag 11) bzw. 16,6 mmol/l (FSA: Tag 12) ab. Die Konzentrationen der FSA lagen dabei bis zu 7,6 % unterhalb der der KF (p-KSA: Tag 9 ≤ 0,01).
Während der Sulfatzulage blieben die Konzentrationen in den KF konstant zwischen 17,3 – 17,5 mmol/l, nahmen unter Thiamineinfluß um 18,3 % auf 20,7 mmol/l (Tag 20) zu, und fielen im Nachlauf langsam auf Kontrollphasenniveau ab, bzw. lagen mit 4,6 % geringgradig darüber.
Die Propionsäurekonzentrationen der FSA bewegten sich vom 12. bis zum 17. Tag zwischen 16,6 und 17,6 mmol/l und wiesen bis zu 5,1 % niedrigere Werte als die der KF-Gehalte auf (Ausnahme: Tag 13: + 1,7 %). Ab Tag 17 stiegen die Propionsäurewerte in den FSA deutlich um 19,4 % bis zum 20. Versuchstag an.
Die FSA-Gehalte verliefen vom 16. bis zum 20. Tag zwischen 0,57 und 9,14 % unterhalb der KF-Werte und ab Tag 20 bis zu 15,0 % oberhalb dieser.
Im Durchschnitt lagen die Konzentrationen der FSA im Nachlauf 23,2 % über den ent-sprechenden Werten der Kontrollphase (ns). Die Standardabweichung der Mittelwerte lag in den KF und FSA zwischen 0,71 und 7,44 mmol/l.
40,0 45,0 50,0 55,0 60,0 65,0 70,0 75,0
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 Tag
mmol/l
0
*
* * *
Abb. 4.9: Propionsäurekonzentrationen (mmol/l) im Überstand während 25-tägiger in- vitro-Inkubation in KF-Fermentern () und in FSA-Fermentern (− −); Restlegende siehe Abb. 4.1
Fermenter (s. Tab. 9.11)
Die FSA-Werte lagen während der Kontrollphase zwischen 3,1 und 6,2 % unter den KF-Gehalten (p-KSA: Tag 7 ≤ 0,05; der Kurvenverlauf entsprach weitgehend dem des Überstandes).
Im Gegensatz zum Überstand stiegen die Konzentrationen der Propionsäure in beiden Fermenterpaaren bis zum 24. Versuchstag an ( KF: 22,9 mmol/l; FSA: 25,4 mmol/l). Ab Tag 19 lagen die Propionsäurekonzentrationen der FSA bis zu 13,8 % über denen der KF (ns). Die Standardabweichung der Mittelwerte variierte in den KF und FSA zwischen 0,63 und 6,12 mmol/l.
4.10 i -Buttersäurekonzentrationen Überstand (s. Abb. 4.10 u. Tab. 9.14)
Nach Erreichen des steady state bewegten sich die Konzentrationen der i-Buttersäure bis zum Ende der ersten Zulagephase zwischen 0,70 und 0,75 mmol/l (p-KSA: Tag 7 u. 9 ≤ 0,05).
Die Konzentrationen waren in beiden Fermenterpaaren während der Sulfatzulage nahezu identisch, unter Thiamineinfluß stiegen sie bis zum 20. Versuchstag in den FSA auf 0,83 mmol/l (+ 16,9 %) und in den KF auf 0,77 mmol/l (+ 6,94 %) an.
Vom 18. bis zum 20. Tag waren die Konzentrationen der FSA im Vergleich zu denen der KF zwischen 2,85 und 15,5 % höher (ns). Im Nachlauf lagen die i-Buttersäuregehalte der FSA ebenso wie die der KF auf dem Niveau der Kontrollphase. Die Standardabweichung der Mittelwerte verlief in den KF und FSA zwischen 0,05 und 0,29 mmol/l.
15,0 16,0 17,0 18,0 19,0 20,0 21,0 22,0 23,0 24,0
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 Tag
mmol/l
0
*
*
Abb. 4.10: i –Buttersäurekonzentrationen (mmol/l) im Überstand während 25-tägiger in-vitro-Inkubation in KF-Fermentern () und in FSA-Fermentern (− −); Restlegende siehe Abb. 4.1
Fermenter (s. Tab. 9.13)
Die Konzentrationen der i-Buttersäure waren fast identisch mit denen der Überstände, wenn auch auf etwas höherem Niveau (Tag 8 - 10: 0,75 – 0,89 mmol/l).
Mit Beginn der zweiten Zulagephase (Tag 16) lagen die i-Buttersäurewerte der FSA 3,13%
über denen der KF und steigerten sich bis zum 19. bzw. 20. Tag auf 15,3 % und 7,94 % (ns).
Die Standardabweichung der Mittelwerte bewegte sich in den KF und FSA zwischen 0,05 und 0,98 mmol/l.
4.11 n-Buttersäurekonzentrationen Überstand (s. Abb. 4.11 u. Tab. 9.16)
Die n-Buttersäurekonzentrationen bewegten sich in der Kontrollphase zwischen 16,7 und 17,8 mmol/l, die FSA-Gehalte waren im Durchschnitt 3,39 % niedriger als die der KF (p-KSA: Tag 8 ≤ 0,05).
Die KF-Werte blieben bis zum Versuchsende konstant (17,0 – 18,1 mmol/l), mit einer Ausnahme am 19. Versuchstag (16,3 mmol/l). Die Konzentrationen der FSA zeigten unter der Sulfatgabe einen Anstieg von 7,2 % und während der Thiaminzulage eine weitere Zunahme von 2,79 % (p-KSA: Tag 11, 12 u. 15 - 18 ≤ 0,05; Tag 13 u. 14 ≤ 0,01). Im Nachlauf fielen
0,300 0,400 0,500 0,600 0,700 0,800 0,900
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 Tag mmol/l
0
*
*
die n-Buttersäurekonzentrationen der FSA allmählich ab, lagen am 24. Tag mit 12,2 % unterhalb der KF-Gehalte und 7,00 % unter denen der entsprechenden Kontrollphasenwerte.
Die Standardabweichung der Mittelwerte verlief in den KF und FSA zwischen 0,49 und 3,72 mmol/l.
Abb. 4.11: n-Buttersäurekonzentrationen (mmol/l) im Überstand während 25-tägiger in-vitro-Inkubation in KF-Fermentern () und in FSA-Fermentern
(− −); Restlegende siehe Abb. 4.1
Fermenter (s. Tab. 9. 15)
Die n-Buttersäureverläufe aller Fermenterpaare entsprachen denen der Überstände auf höherem Niveau (Kontrollphase: 17,8 - 19,0 mmol/l).
Während der Sulfatgabe lagen die FSA-Konzentrationen oberhalb der der KF (bis 3,48 %; p-KSA: Tag 19 ≤ 0,05). Im Nachlauf waren die FSA-Werte um 8,20 % niedriger als in der Kontrollphase und lagen 9,19 % unter denen der KF. Die Standardabweichung der Mittelwerte lag in den KF und FSA zwischen 0,91 und 6,12 mmol/l.
7,0 9,0 11,0 13,0 15,0 17,0 19,0 21,0
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 Tag
mmol/l
mmol/l