Messung der kapillären Blutungszeit

Zur Messung der kapillären Blutungszeit wurde im Bereich des Unterarms eine Blutdruck-manschette angelegt, im medialen Bereich der 2. Vorderzehe das Haar am Übergang zum Ballenhorn geschoren und eine hyperämisierende Salbe (Finalgon®, Essex Pharma, München)

aufgetragen. Nach 1 min wurde die Salbe mit einem Tupfer entfernt und die Manschette bis zu einem Druck von 70 mmHg aufgeblockt. Nach einer weiteren Minute wurden im Abstand von 0,5 cm parallel zum Ballenhorn zwei Inzisionen mittels Lanzette gesetzt und die Stoppuhr gestartet. Die Blutstropfen wurden alle 15 sek vorsichtig abgetupft bis die Blutung zum Stillstand kam. Anschließend wurde die Blutdruckmanschette wieder abgeblockt. Aus den 2 Werten wurde der Mittelwert berechnet (NOLTE et al. 1997).

3.3.10 Blutuntersuchung

3.3.10.1 Blutentnahme und Probenverarbeitung

Die Blutentnahme erfolgte aus der V. saphena oder der V. cephalica mit sterilen Einmalkanülen (0,9 x 40 mm; Becton Dickinson S.A., Fraga, Spanien), wobei für die Gewinnung von Nat-rium-Zitrat-Plasma weitlumige Kanülen (1,2 x 40 mm; Becton Dickinson S.A., Fraga, Spanien) verwendet, das Gefäß nicht oder nur kurzzeitig gestaut und die ersten Blutstropfen verworfen wurden.

Für die hämatologische Untersuchung wurden 1,3 ml Blut in Kalium- EDTA-Mikroprobengefäßen (1,6 mg EDTA/ml Blut; Fa. Sarstedt, Nürnbrecht) und für die Messung des Säure-Basen-Haushaltes, der Blutgase und der Elektrolyte 1,3 ml Blut in Lithium-Heparin-Probengefäßen (15 IE/ml Blut; Fa. Sarstedt, Nürnbrecht) aufgefangen und gleich im Anschluss analysiert.

Zur Messung der klinisch-chemischen Parameter und der Kortisolkonzentration wurden je-weils 1,3 ml Blut in Lithium-Heparin-Probengefäßen (15 IE/ml Blut; Fa. Sarstedt, Nürnbrecht), für die Analyse von PT und APTT 1,3 ml Blut in Natrium-Zitrat-Probengefäßen (0,11 ml Natrium-Zitrat-Lösung [0,11 mol/l] / ml Blut) aufgefangen, bei 10.000 x g zentrifugiert und der Überstand abpipettiert. Die klinisch-chemischen Parameter wurden sofort analysiert, für die Messung der Kortisolkonzentration und der Gerinnungsparameter wurden jeweils 1 ml Plasma in Eppendorf-Reaktionsgefäßen (3810X 1,5ml, Eppendorf AG, Hamburg) bei − 28°C eingefroren.

Für die Messung der Thrombozytenaggregation wurden jeweils 2 mit je 1 ml 3,13%iger Natriumzitrat-Lösung beschickte Röhrchen (Fa. Sarstedt, Nürnbrecht) bis zur 10 ml Marke mit Blut aufgefüllt und zur Herstellung plättchenreichen Plasmas (PRP) 30 min bei 150 x g unter

Kühlung zentrifugiert (HETTICH Zentrifuge EBA 12, Fa. Hettich, Tuttlingen). Ein Teil des an-schließend abpipettierten plättchenreichen Überstandes wurde nochmals 2 min bei 10.000 x g zur Gewinnung plättchenarmen Plasmas (PAP) zentrifugiert. Die Thrombozytenzahl des plätt-chenreichen Plasmas wurde mittels Microcellcounter (Sysmex Microcellcounter F-800 mit Sysmex Auto-Diluter AD-260, Fa. SYSMEX MEDICAL ELECTRONICS GmbH, Norder-stedt) ermittelt. Zur Herstellung einer einheitlichen Konzentration von 300.000 Thrombozyten / µl PRP wurde das plättchenreiche Plasma entweder erneut 5 min bei 1500 x g zentrifugiert, ein Teil des plättchenarmen Überstandes abpipettiert und die absedimentierten Thrombozyten vorsichtig resuspensiert oder aber verdünnt durch Zugabe plättchenarmen Plasmas. Die Thrombozytenaggregationsmessung wurde spätestens 2 h nach Blutentnahme gestartet.

3.3.10.2 Hämatologische, klinisch-chemische und endokrinologische Blutuntersuchung

Erythrozytenzahl, Hämatokrit, Hämoglobingehalt, Thrombozytenzahl, Gesamtleukozytenzahl und Differentialblutbild wurden mittels Technikon H 1E^TM (Fa. Bayer Diagnostics GmbH, München) bestimmt.

Die Messung des pH-Wertes, Sauerstoff- und Kohlendioxidpartialdruckes, der Bikarbonat-konzentration, des Basenüberschusses und der Elektrolyte des Blutes erfolgte mit dem Blutgasanalysegerät 248 Ciba (Fa. Bayer Diagnostics GmbH, München).

Glukose, Alaninaminotransferase, Glutamatdehydrogenase, Bilirubin, alkalische Phosphatase, Gesamteiweiß, Harnstoff, Kreatinin und Phosphor wurden spektralphotometrisch mit dem Hitachi 704 Automatic Analyzer (Fa. Roche Diagnostics GmbH, Mannheim) gemessen, wobei Precinorm® U (Fa. Roche Diagnostics GmbH, Mannheim) als Universalkontrollserum zur Qualitätssicherung verwendet wurde.

Zur Messung der Kortisolkonzentration wurde das Heparinplasma 2 min im Wasserbad bei 37°C aufgetaut und anschließend mittels Radioimmunoassay in der Zentrumsabteilung für Chemische Analytik und Endokrinologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover gemessen (Direktor Prof. H.O. Hoppen).

3.3.10.3 Messung der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit (APTT) und Prothrom-binzeit (PT)

Das Natrium-Zitrat-Plasma wurde 2 min im Wasserbad bei 37°C aufgetaut und mittels COAGULOMETER nach Schnitger und Gross (Amelung GmbH, Lemgo) analysiert (MISCHKE 1995, MISCHKE und NOLTE 1997, MISCHKE 2000). Es wurde jeweils eine Doppelbestimmung durchgeführt und anschließend der Mittelwert berechnet.

Zur Messung der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit wurde 100 µl Plasma mit 100 µl des mit Diethylbarbiturat-Azetat-Pufferlösung (pH 7,6; Fa. Dade Behring Diagnostics GmbH, Marburg) gelösten Aktivatorreagens (Pathromtin®, Fa. Dade Behring Diagnostics GmbH, Marburg) 2 min bei 37°C inkubiert und anschließend 100 µl Kalziumchloridlösung (CaCl2

0,025mol/l, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim) als Startreagens hinzupipettiert.

Zur Messung der Prothrombinzeit wurden 100 µl Plasma mit 100 µl Fibrinogenlösung (Hu-manfibrinogen, Plasminogen frei, 1,0 g, Fa. Haemochrom Diagnostica, Essen) bei 37°C inku-biert. Nach Zugabe von mit destilliertem Wasser aufgelöstem Kalzium-Thromboplastin (Thromobrel® S, Aktivatorreagenz für die Prothrombinzeit, Fa. Dade Behring Diagnostics GmbH, Marburg) als Startreagens wurde die Stoppuhr gestartet und die Zeit bis zum Einsetzen der Fibrinbildung bestimmt. Das Messergebnis in Sekunden wurde über eine Referenzkurve in Prozent Aktivität der Norm umgerechnet.

3.3.10.4 Messung der Thrombozytenaggregation

Die Messung der Thrombozytenaggregation erfolgte an einem Zwei-Kanal-Aggregometer (Automated Platelet Aggregation and Coagulations Tracer APACT mit Printer Plotter, Fa. La-bor, Laborgeräte und Analysensysteme Vertriebsgesellschaft, Hamburg) mit rechnergestützter Kurvenanalyse basierend auf der Methode von BORN (1962), modifiziert für den Einsatz beim Hund (NOLTE et al. 1997). Zu Beginn jeder Messung erfolgte die Eichung des Aggregometers mit 200 µl plättchenarmen Plasmas und 10 µl isotoner Kochsalz (NaCl)-Lösung (Fresenius Kabi Deutschland GmbH, Bad Homburg) auf 100 % Aggregation und mit 200 µl plättchenrei-chen Plasmas und 10 µl isotoner Kochsalzlösung auf 0 % Aggregation. Die Magnetrührer bei-der Messkanäle wurden auf 1000 U/min eingestellt. Jeweils 200 µl plättchenreiches Plasma wurde in Küvetten der beiden Messkanäle pipettiert und die Messung gestartet. Nach

2-minütiger Inkubationszeit bei 37°C erfolgte die Induktion der Thrombozytenaggregation mit 10 µl ADP (0,025 mol/l) (Adenonsindiphosphat (ADP) - Reagenz; Sigma-Aldrich, Taufkir-chen) bzw. Kollagen (10 µg/ml) (Kollagenreagenz Horm® mit SKF Horm® - Puffer, Nyco-med, Arzneimittel GmbH, Ismaning). Während der 12-minütigen Messung erfolgte ein ständiges Rühren der Proben mittels Magnetrührer bei 1000 U/min, wobei die Aufzeichnung der Kurven mit einer Papiervorschubgeschwindigkeit von 7,5 mm/min erfolgte. Aggregati-onsmaximum (%) und maximaler Gradient (% / min) wurden automatisch durch das Gerät ermittelt, gegebenenfalls manuell korrigiert.

3.3.11 Harnuntersuchung

Spontan-, oder Zystozenteseharn wurde mittels Teststreifen (Combur⁹–Test®, Fa. Roche Di-agnostics GmbH, Mannheim) auf pH-Wert, Protein-, Hämoglobin-, Glukose-, Leukozyten-, Ketonkörper- und Bilirubingehalt untersucht.

Das spezifische Gewicht wurde mit dem Küss-Handrefraktometer HRM 18 (Fa. Krüss, Ham-burg) ermittelt.

Zur Untersuchung des Harnsediments wurde der Urin 5 min zentrifugiert (1500 x g), gefärbt (Testsimplets®, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim) und bei 40-facher Vergrößerung mikroskopisch auf Erythrozyten, Leukozyten, Epithelzellen, Kristalle, Zylinder und Bakterien untersucht.

Nach erneuter 5-minütiger Zentrifugation (18.000 x g) wurde der Protein- und Kreatiningehalt im Hitachi 704 Automatic Analyser (Fa. Roche Diagnostics GmbH, Mannheim) bestimmt, wobei für die Messung des Kreatiningehaltes der Harn 1:10 mit isotoner Kochsalzlösung (0,9%; Fresenius Kabi Deutschland GmbH, Bad Homburg) verdünnt und Preciset® U/CSF als Kalibrationslösung (Fa. Roche Diagnostics GmbH, Mannheim) verwendet wurde. Anschlie-ßend wurde der Quotient aus Protein- und Kreatininkonzentration gemessen. Für die spätere Durchführung der SDS-PAGE-Urinelektrophorese wurde der Überstand in Eppen-dorf-Reaktionsgefäße (3810X 1,5 ml, Eppendorf AG, Hamburg) pippetiert und bei – 28 °C eingefroren.