Laut dem Verband forschender Arzneimittelhersteller (Stand Oktober 2016) werden 43 therapeutische Biopharmazeutika in E.coli exprimiert. Die jeweiligen Wirkstoffe, Hersteller und Arzneimittel können aus der verfügbaren Liste ausgelesen werden [1]. Die Marktpräsenz der einzelnen Arzneimittel kann verglichen werden, indem die jeweiligen Weltjahresumsätze der Jahre 2014 und 2015 miteinander verglichen werden. Nach der Analyse können die einzelnen Produkte aufgrund ihrer Marktpräsenz eingestuft werden. In Tabelle 3 sind die jeweiligen Produkte farblich gekennzeichnet, wobei die gelb markierten Produkte einen konstanten Weltjahresumsatz von über 1 Milliarde US-Dollar, die blau markierten Produkte einen konstanten Umsatz zwischen 500 Millionen und 1 Milliarden US-Dollar, die grün markierten Produkte einen konstanten Umsatz zwischen 100 Millionen und 500 Millionen US-Dollar und die orange markierten Produkte einen konstanten Umsatz bis 100 Millionen US-Dollar erwirtschaften. Die Produkte ohne ermittelten Umsatz sind entweder Biosimilars, die in derselben Farbe markiert wurden, wie die jeweiligen Ursprungsprodukte oder Arzneimittel, deren Weltjahresumsätze nicht ermittelt werden konnten (rote Markierung).
Tabelle 3: Liste aller E. coli Therapeutika
Wirkstoff Firma Arzneimittel Umsatz '14 Umsatz '15 Quelle Insulin glargin Sanofi-Aventis Lantus® USD
6.978.000.000,00
USD
7.029.000.000,00 [32]
Pegfilgrastim Amgen Neulasta® USD
4.596.000.000,00
USD
4.715.000.000,00 [32]
Insulin lispro Lilly Humalog® USD
2.785.200.000,00
USD
2.842.000.000,00 [32]
Ranibizumab Novartis Lucentis® USD 2.441.000.000,00
USD
2.060.000.000,00 [32]
Teriparatid Lilly Forteo® USD
Romiplostim Amgen Nplate® USD
469.000.000,00
Insulin glulisin Sanofi-Aventis Apidra® € 336.000.000,00 € 376.000.000,00 [32]
Pegvisomant Pfizer Somavert® USD
229.000.000,00
Insulin human Sanofi-Aventis Insuman® € 137.000.000,00 € 141.000.000,00 [32]
Interferon
Orphan Kepivance® USD
12.400.000,00
USD
112.000.000,00 [36]
Anakinra Biovitrum Kineret® USD
82.000.000,00
USD
96.000.000,00 [37]
Somatropin Ipsen Pharma Nutropin AQ®
USD 65.000.000,00
USD
66.000.000,00 [32]
Mecasermin Ipsen Pharma Increlex® USD 14.000.000,00
USD
22.000.000,00 [32]
Lipegfilgrastim Teva Lonquex® USD
27.000.000,00
USD
15.000.000,00 [38]
Somatropin
(Biosimilar) Sandoz GmbH Omnitrope®
Filgrastim
(Biosimilar) Sandoz Zarzio®
Filgrastim
(Biosimilar) Accord Accofil®
Filgrastim
(Biosimilar) Apotex Grastofil®
Filgrastim
(Biosimilar) Hexal Filgrastim Hexal®
Filgrastim
(Biosimilar) Hospira UK Nivestim®
Filgrastim
(Biosimilar) Ratiopharm Ratiograstim
® Filgrastim
(Biosimilar) Teva Generics Tevagrastim®
Insulin glargin Lilly Abasaglar®
Insulin glargin Sanofi-Aventis Optisulin®
Insulin lispro Lilly Liprolog®
Pegfilgrastim Amgen Ristempa®
Tasonermin Boehringer
Ingelheim Beromun®
Asparaginase Medac Spectrila®
Nebenschilddrüs
en-Hormon Nycomed Preotact®
Pegloticase Savient Pharma Krystexxa®
Reteplase Actavis Rapilysin®
Teduglutid NPS Pharma
Holdings Ltd. Revestive®
4 Prozessanalyse – Cytoplasmatisch
Bei der Aufreinigung von cytoplasmatischen Proteinen, also Proteinen, die innerhalb der Zelle gelöst sind, gibt es eine definierte Abfolge von Zielen, die für eine möglichst hohe Reinheit eingehalten werden müssen [19]. Die Abfolge besteht zunächst aus der Trennung der Zellen vom Kultivierungsmedium, dem Zellaufschluss und der anschließenden Aufreinigung des Proteins durch unterschiedliche Proteineigenschaften, wie Ladung, Gewicht, Partikelgröße, Dichte etc. Da im Rahmen dieser Arbeit keine extrazellulären Prozesse analysiert und von einem einheitlichen Medienvolumen von 30 Litern nach der Fermentation ausgegangen wird, kann der erste Schritt in der Prozessdefinition als Zentrifugation definiert werden. Der jeweils markierte Prozess in den folgenden Kapiteln soll hierbei als repräsentativ für die Aufreinigung des dazugehörigen Proteins gelten. Die Parameter für diese Zentrifugation, sowie die folgenden Parameter können aus dem in 4.2. dargestellten Prozess entnommen werden. Hierbei werden vom Fachbereich Bioengineering der FH Campus Wien die Prozesse durchgeführt und deren Ausbeuten ermittelt.
4.1 Analyse bestehender Prozesse 4.1.1 Fibroblast Growth Factor – 2
Fibroblast Growth Factor (FGF-2) – 2, oder auch Basic Fibroblast Growth Factor ist ein Wachstumsfaktor, welcher an Heparin bindet, in Deutschland jedoch nicht zugelassen ist. Er besitzt einen isoelektrischen Punkt von 9,6 und stimuliert die Verbreitung einer Vielzahl von Zellen im Körper [1], [39], [40]. Die Analyse aus Patenten und veröffentlichten Versuchen ergeben folgende Aufreinigungsprozess-Szenarien:
Tabelle 4: Aufreinigungsprozesse FGF-2
Veröffentlichung Prozess
Paper 1 [41] Zentrifugation > Homogenisation > Zentrifugation > CEX >
Affinitätschromatographie
Paper 2 [42] Zentrifugation > Homogenisation > Zentrifugation >
Nickel-Affinitätschromatographie > Affinitätschromatographie Paper 3 [43] Zentrifugation > Homogenisation > Zentrifugation >
Nickel-Affinitätschromatographie
Patent 1 [44] Zentrifugation > Homogenisation > Zentrifugation > CEX >
Affinitätschromatographie > SEC
Patent 2 [45] Zentrifugation > Homogenisation > Zentrifugation > CEX > HIC >
schwache AEX Repräsentativer
Produktionsprozess
Zentrifugation > Homogenisation > Zentrifugation > CEX >
Affinitätschromatographie
4.1.2 Tasonermin
Das Protein Tasonermin mit einem isoelektrischen Punkt von 6,4, welches auch als Tumor-Nekrose-Faktor-alpha-1a (TNFα-1a) bezeichnet wird, ist ein Wirkstoff, der zur Behandlung von Tumoren präventiv oder palliativ angewendet werden kann [46], [47]. Ein Arzneimittel, welches den Wirkstoff beinhaltet ist Beromun®, das von der Firma Boehringer Ingelheim vertrieben wird [1]. Die Analyse aus Patenten und veröffentlichten Versuchen ergeben folgende Aufreinigungsprozess-Szenarien:
Tabelle 5: Aufreinigungsprozesse Tasonermin
Veröffentlichung Prozess
Infosheet [46] Zentrifugation > Homogenisation > Zentrifugation > Präzipitat >
fünf Chromatographieschritte
Paper [48] Zentrifugation > Homogenisation > Zentrifugation >
Affinitätschromatographie Patent 1 [49]
Zentrifugation > Homogenisation > Zentrifugation >
Präzipitation > AEX > HIC > Affinitätschromatographie >
SEC
Buch [50, S. 15] Bestätigung der anderen Prozesse
Patent 2 [51] Zentrifugation > Homogenisation > Zentrifugation >
Affinitätschromatographie > Glasbead-Chromatographie Repräsentativer
Produktionsprozess
Zentrifugation > Homogenisation > Zentrifugation > Präzipitation
> AEX > HIC > Affinitätschromatographie > SEC
4.1.3 Interferon – α-2b
Interferon – α-2b ist ein rekombinantes Protein, das in der Krebstherapie und gegen Hepatitis B und C eingesetzt werden kann. Der isoelektrische Punkt liegt bei 6,0 [52], [53]. Es ist seit März 2000 in Deutschland unter dem Arzneimittel IntronA® der Firma Merck zugelassen [1].
Neben Interferon - α-2b werden auch weitere Interferon – α Proteine cytoplasmatisch aus E.
coli aufgereinigt. Die allgemeinen Aufreinigungsprozesse von Interferon – α sind in folgender Tabelle dargestellt:
Tabelle 6: Aufreinigungsprozesse Interferon - α-2b
Veröffentlichung Prozess
Patent 1 [54] Zentrifugation > Homogenisation > Zentrifugation >
Tandem-Chromatographie > Präzipitation > CEX Paper 1 [55] Zentrifugation > Homogenisation > Zentrifugation >
Bead-Filtration > Bead-Chromatographie > AEX > SEC Paper 2 [56] Zentrifugation > Homogenisation > Zentrifugation > AEX >
CEX > HIC > UF > SEC
Patent 2 [57] Zentrifugation > Homogenisation > Zentrifugation >
Affinitätschromatographie > Thrombin cleavage > SEC Patent 3 [58] Zentrifugation > Homogenisation > Zentrifugation > SEC >
HIC > CEX > AEX Repräsentativer
Produktionsprozess
Zentrifugation > Homogenisation > Zentrifugation > SEC > HIC >
CEX > AEX
4.1.4 Anakinra
Anakinra ist ein Wirkstoff, der zur Behandlung gegen Reumatoide Athritis eingesetzt wird, um Entzündungen zu hemmen [59]. Seit März 2002 ist von der Firma Swedish Orphan Biovitrum das Arzneimittel Kineret® in Deutschland zugelassen, welches Anakinra als Wirkstoff beinhaltet [1]. Der isoelektrische Punkt von Anakinra liegt bei 5,5 [60]. Die Analyse aus Patenten und veröffentlichten Versuchen ergeben folgende Aufreinigungsprozess-Szenarien:
Tabelle 7: Aufreinigungsprozesse Anakinra
Veröffentlichung Prozess
Buch [61, S. 21] Zentrifugation > Homogenisation > Zentrifugation > IEX >
Chromatographien
Paper 1 [62] Zentrifugation > Homogenisation > Zentrifugation > Expanded bed Chromatographie > AEX > Endotoxin-Chromatographie Paper 3 [63] Zentrifugation > Homogenisation > Zentrifugation >
Bead-Inkubation > Flow through Chromatographie Patent 1 [64] Zentrifugation > Homogenisation > Zentrifugation > CEX >
AEX > UF/DF
Infosheet [65] Stellt den Prozess grundsätzlich als Abfolge von Chromatographie und Filtrationsschritten dar
Repräsentativer Produktionsprozess
Zentrifugation > Homogenisation > Zentrifugation > CEX > AEX
> UF/DF
4.1.5 Asparaginase
Asparaginase ist ein Zytostatikum, das zur Therapie von Leukämie eingesetzt wird. Es baut die nicht essentielle Aminosäure Asparagin ab, wodurch Leukämiezellen angegriffen werden können [66]. Der isoelektrische Punkt liegt bei 4,7 [67]. Seit Januar 2016 ist in Deutschland das Arzneimittel Spectrila® der Firma Medac zugelassen, welches Asparaginase als Wirkstoff enthält [1]. Die Analyse aus Patenten und veröffentlichten Versuchen ergeben folgende Aufreinigungsprozess-Szenarien:
Tabelle 8: Aufreinigungsprozesse Asparaginase
Veröffentlichung Prozess
Paper 1 [68] Zentrifugation > Homogenisation > Präzipitation >
Zentrifugation > AEX > CEX > Mixen Paper 2 [69] Zentrifugation > Homogenisation > Zentrifugation >
Nickel-Affinitätschromatographie > Affinitätschromatographie Paper 3 [70] Zentrifugation > Homogenisation > Zentrifugation >
Nickel-Affinitätschromatographie Patent 1 [71]
Zentrifugation > Homogenisation > Präzipitat > Zentrifugation
> AEX > Präzipitation > Zentrifugation > CEX > Mixen mit Ethanol
Patent 2 [72] Zentrifugation > Homogenisation > Präzipitation >
Gel-Behandlung > Mixen Repräsentativer
Produktionsprozess
Zentrifugation > Homogenisation > Präzipitat > Zentrifugation >
AEX > Präzipitation > Zentrifugation > CEX > Mixen mit Ethanol
4.1.6 Prozessdefinition
Der repräsentative Prozess wurde anhand der in 4.1 analysierten Prozesse und der erforderlichen Aufreinigungsanforderungen von E. coli definiert und im Labor des Fachbereichs Bioengineering der FH Campus Wien durchgeführt. Dieser Prozess wird im folgenden Kapitel genauer beschrieben.