Masterarbeit. Kostenevaluierung von Downstream- Produktionsprozessen von rekombinanten therapeutischen Proteinen mit Escherichia coli PKZ:

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Masterarbeit

Kostenevaluierung von Downstream- Produktionsprozessen von rekombinanten therapeutischen Proteinen mit Escherichia coli

Vorgelegt von: Alessandro Cataldo Studiengang: Bioverfahrenstechnik

PKZ: 1510540010

Semester: Wintersemester 2017/2018

Betreuender Professor: FH-Prof. Dr. Michael Maurer Zweitprüfer: Mag. Dipl.-Ing. Dr. Martin Pfeffer

Abgabedatum: 30.10.2017

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Erklärung:

Ich erkläre, dass die vorliegende Diplomarbeit von mir selbst verfasst wurde und ich keine anderen als die angeführten Behelfe verwendet bzw. mich auch sonst keiner unerlaubter Hilfe bedient habe.

Ich versichere, dass ich diese Diplomarbeit bisher weder im In- noch im Ausland (einer Beurteilerin/einem Beurteiler zur Begutachtung) in irgendeiner Form als Prüfungsarbeit vorgelegt habe.

Weiters versichere ich, dass die von mir eingereichten Exemplare (ausgedruckt und elektronisch) identisch sind.

Datum: ______________________ Unterschrift: _____________________

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Abstract

English:

The following work includes the economic downstream analysis of Escherichia coli processes and the definition of three process designs for the production of cytoplasmic, Inclusion Body based and periplasmic proteins, which should be representative for the entire range of E. coli products. This workflow is divided into three major tasks: Research and process definition, implementation into the economic evaluation software SuperPro Designer and the setting of all process parameters to complete the process simulation. The reference products were Fibroblast Growth Factor 2 (FGF-2) for cytoplasmic expressed proteins, human Insulin Growth Factor 1 (hIGF-1) for Inclusion Body based processes and Ranibizumab for periplasmic produced produced processes. The production scale refers to a 30 liter fermentation. For the FGF-2 process further scenarios were simulated to create an economic comparison between hybrid filtration methods and an anion exchange chromatography step in a pilot scale (30 L) and an industrial scale including operational costs and cash flow analysis.

Deutsch:

Die folgende Arbeit befasst sich mit der Wirtschaftlichkeitsanalyse von Escherichia coli Downstream-Prozessen und der Definition eines cytoplasmatischen, Inclusion Body und eines periplasmatischen Prozesses. Diese definierten Prozesse sollen für den Großteil der gesamten E. coli Produktpalette als repräsentativ gelten. Die Aufgabenstellung wurde in drei Phasen unterteilt, der Prozessfindung und -evaluierung, der Implementierung in die ökonomische Evaluierungssoftware SuperPro Designer und das Vervollständigen der einzelnen Kostenparameter. Als Resultat dieser Recherche wurden als cytoplasmatische Referenz das Protein Fibroblast Growth Factor 2 (FGF-2), als Inclusion Body Referenz human Insulin Growth Factor 1 (hIGF-1) und als periplasmatische Referenz der Antikörper Ranibizumab verwendet. Die Prozesse wurden für ein Fermentationsvolumen von 30 Litern dimensioniert.

Darüber hinaus wurden beim FGF-2 Prozess drei weitere Szenarien erstellt, die den Vergleich zwischen Hybrid-Filtrationen und einer Anionentauscher-Chromatographie, sowohl im Pilotmaßstab (30 L) als auch im industriellen Maßstab (15 m²) simulieren sollen. Hierbei wurden vor allem die laufenden Kosten und die Cashflows der jeweiligen Szenarien miteinander verglichen.

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Danksagung

An dieser Stelle möchte ich mich bei all denjenigen bedanken, die mich während des gesamten Studiums unterstützt und motiviert haben. Allen voran meinen Studienkollegen für ihre gute Zusammenarbeit.

Ein besonderer Dank gilt Herrn FH-Prof. Dr. Michael Maurer, der mich als Mentor und Betreuer bei meinem Einstieg in die Bioverfahrenstechnik stets unterstützt und beraten hat.

Zudem gilt mein Dank Herrn Mag. Dipl.-Ing. Dr. Martin Pfeffer für die Unterstützung während der Ausarbeitung dieser Arbeit.

Ebenfalls möchte ich mich bei Herrn Dipl. Ing Harald Schillinger der Firma 3M bedanken, der mir zur Anfertigung dieser Arbeit durch das zur Verfügung stellen einzelner Kostenfaktoren wesentlich weitergeholfen hat.

Außerdem möchte ich mich bei meinem Arbeitskollegen Karl Metzger für die Prozessdurchführung bedanken, der mir trotz einiger Umstände die benötigten Prozessdaten überreichen konnte.

Meiner Freundin Lena Schwarzl danke ich besonders für den starken emotionalen Rückhalt während des gesamten Studiums und für die Unterstützung während des Verfassens dieser Arbeit.

Abschließend möchte ich mich bei meiner Familie bedanken, allem voran bei meiner Mutter Judith, meinen Brüdern Daniel und Emanuel, meiner Tante Renate und meiner Oma Anna Angerer, die mir mein Studium durch ihre Unterstützung ermöglicht haben und stets ein offenes Ohr für meine Sorgen hatten.

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Inhaltsverzeichnis

Erklärung: ... II Abstract ... III Danksagung ... IV

1 Einleitung ... 1

1.1 Hintergrund ... 1

1.2 Derzeitiger Stand der Technik ... 2

1.2.1 Produktpalette - Proteine ... 2

1.2.2 Downstream Processing ... 2

1.2.3 Kostenevaluierung von Bioprozessen ... 3

1.2.4 Herausforderungen bei der Zellbestandteilaufreinigung ... 6

1.3 Zielsetzung ... 7

2 Material und Methoden ... 8

2.1 Kommerziell erhältliche Evaluierungssoftwares ... 8

2.1.1 BioSolve ... 8

2.1.2 SuperPro Designer ... 9

2.2 Prozessfindung ... 10

2.2.1 Analyse von ausgewählten Pharmazeutika ... 11

2.2.2 Literaturrecherche ... 11

2.3 Ionentauscher und deren Bedeutung ... 11

2.4 Hybrid Filtration als Substitut für Anionentauscher ... 12

3 Analysen und Modellauswahl ... 14

3.1 Gegenüberstellung der Software-Pakete ... 14

3.2 Prozesssimulation – Evaluierung mit SuperPro Designer ... 14

3.2.1 Bestehende Prozesse/Datenbanken ... 14

3.2.2 Inputs ... 15

3.2.3 Outputs ... 18

3.3 Marktanalyse therapeutischer E. coli Produkte ... 19

4 Prozessanalyse – Cytoplasmatisch ... 21

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4.1.1 Fibroblast Growth Factor – 2 ... 22

4.1.2 Tasonermin ... 22

4.1.3 Interferon – α-2b ... 23

4.1.4 Anakinra ... 24

4.1.5 Asparaginase ... 24

4.1.6 Prozessdefinition ... 25

4.2 Downstream Analyse - Fibroblast Growth Factor-2 aus E. coli ... 25

4.3 Kostenanalyse - FGF-2 ... 27

4.3.1 Equipmentkosten ... 28

4.3.2 Materialien ... 31

4.3.3 Verbrauchsgüter ... 33

4.3.4 Personalkosten... 33

4.3.5 Anlagespezifische Kosten ... 35

4.3.6 Zusammenfassung – Laufende Kosten ... 36

4.4 Prozessszenario – Konventionell ... 37

4.4.1 Kostenvergleich – Filtration & AEX ... 38

4.4.2 Prozessszenario – Industrieller Maßstab ... 43

4.4.3 Kostenvergleich – Industrielle Aufreinigungsprozesse ... 44

5 Prozessanalyse – Inclusion Bodies ... 49

5.1 Analyse bestehender Prozesse ... 50

5.1.1 Mecasermin ... 50

5.1.2 Filgrastim ... 51

5.1.3 Human Growth Hormone ... 52

5.1.4 Teriparatid ... 52

5.1.5 Epidermaler Wachstumsfaktor ... 53

5.2 Downstream Analyse - Insulin Growth Factor-1 aus E. coli ... 54

5.3 Kostenanalyse hIGF-1 ... 57

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5.3.6 Zusammenfassung - Laufende Kosten ... 65

6 Prozessanalyse – Periplasmatisch ... 66

6.1 Analyse bestehender Prozesse ... 67

6.1.1 Ranibizumab ... 67

6.1.2 Certolizumab pegol ... 67

6.1.3 Einzeldomänenantikörper ... 68

6.1.4 Human Growth Hormone ... 69

6.1.5 Cystatin C ... 69

6.2 Downstream Analyse – Ranibizumab aus E. coli ... 70

6.3 Kostenanalyse - Ranibizumab ... 72

6.3.6 Zusammenfassung – Laufende Kosten ... 76

7 Zusammenfassung und Diskussion ... 78

8 Ausblick ... 81 Anhang ... VIII Tabellenverzeichnis ... XXI Abbildungsverzeichnis ... XXIV Abkürzungsverzeichnis ... XXVI Literaturverzeichnis ... XXVIII

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1 Einleitung

Der Fachbereich Bioengineering der FH Campus Wien befasst sich mit Prozessevaluierung verschiedener biopharmazeutischer Arzneimittel. Neben Lehrübungen für Studierende in den einzelnen Fachbereichen, werden Produktionsprozesse bis hin zum Pilotmaßstab durchgeführt.

Aufgrund der Ansatzgröße von bis zu 180 L pro Fermentation können die Prozessanalysen im Vergleich zu kleinen Labormaßstäben besser auf die in der Industrie verwendeten Verfahren skaliert werden. Da die Nutzung der größtmöglichen Bioreaktoren jedoch einen schlechten Kosten-Nutzen Faktor für einige benötigte Evaluierungen darstellt, werden die Kulturen in einem 50 L Bioreaktor fermentiert. Das damit erzielbare Maximalvolumen von 30 L pro Fermentation genügt, um einzelne Prozessszenarien durchzuführen und zu evaluieren. Mithilfe der zur Verfügung stehenden Apparaturen werden von der Arbeitsgruppe Analysen von Escherichia coli Aufreinigungsprozessen mit neuartigen Hybrid-Filtrationen durchgeführt.

Neben der Prozessoptimierung ist die wirtschaftliche Evaluierung dieser Prozesse ein weiterer Bestandteil der Forschungsgruppe. Für diese Evaluierung werden sämtliche Kostenparameter der Prozesse in eine Simulation integriert, um neben dem wissenschaftlichen auch den wirtschaftlichen Fortschritt der Optimierung zu ermitteln.

1.1 Hintergrund

Betrachtet man die Auflistung aller derzeit zugelassenen gentechnisch hergestellten Arzneimittel, kann festgestellt werden, dass nach derzeitigem Stand 43 aus 204 in Deutschland zugelassenen Arzneimitteln aus Escherichia coli Bakterien gewonnen werden. Nach den Produkten aus tierischen Zellen ist E. coli die am häufigsten verwendete Host-Zelle [1]. Trotz der permanent steigenden Verwendung tierischer Zellkulturen werden einige der derzeit umsatzstärksten Biopharmazeutika aus E. coli gewonnen, unter anderem für die Insulinproduktion [2]. Tierische Zellkulturen werden vor allem für die Produktion von monoklonalen Antikörpern verwendet [1]. Für diese breite Produktpalette können jedoch generalisierte Downstream Prozesse repräsentativ für mehrere Produkte angewendet werden, was die Entwicklung effizienterer Technologien erleichtert [3]. Produkte aus Prozessen, die mit E. coli hergestellt werden, können nicht generalisiert werden. Aufgrund von verschiedenen Aufenthaltsorten des Produktes in der Zelle müssen verschiedene Prozessschritte mit unterschiedlichen Parametern durchgeführt werden, um das Produkt vom restlichen Zellinhalt zu trennen. Dementsprechend kann ein Plattformprozess, wie es für die Antikörperproduktion gibt, für die Aufreinigung von E. coli Produkten nicht angewandt werden [3].

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1.2 Derzeitiger Stand der Technik 1.2.1 Produktpalette - Proteine

Als Basisreferenz der Produktpalette rekombinanter Therapeutika aus E. coli gilt die Liste aller aktuell zugelassenen Arzneimittel auf dem weltweiten Markt laut Verband forschender Arzneimittelhersteller [1]. Anhand dieser Liste ist festzustellen, wie viele Hersteller dieselben Produkte vertreiben, wie die Produktentwicklung fortschreitet und welche Arzneimittel mit welcher Host-Zelle exprimiert wurden. Ein möglicher Ansatz zur Plattformprozessfindung ist die Analyse der Marktanteile der einzelnen Produkte oder auch die Verwendung der Produkte mit den meisten Biosimilars, da ein solcher Beispielprozess für die meisten Produzenten als ökonomisch und effizient angesehen wird.

1.2.2 Downstream Processing

Nach derzeitigem Stand kann aufgrund der verschiedenen Aufenthaltsorte der Proteine die Aufreinigung von E. coli grundsätzlich generalisiert werden. Die genauen Prozessschritte und Prozessparameter hängen zudem von den Proteineigenschaften, wie isoelektrischer Punkt, Hydrophobizität und Proteingröße ab [4]. Bei der wirtschaftlichen Analyse der Prozesse besteht jedoch die Möglichkeit, dass unterschiedliche Faktoren gleichgestellt werden können, wenn sie keine wesentlichen Kostenunterschiede aufweisen. Ein Beispiel hierfür ist die Nutzung einer hydrophoben Interaktions (HIC) -Chromatographie oder einer Anionentauscher (AEX) -Chromatographie, die sich von den Kosten lediglich im Gel unterscheiden [5]. Eine Gemeinsamkeit, die bei der Aufreinigung von den meisten Proteinen aus E. coli besteht, ist der Zellaufschluss, welcher meist mittels Hochdruck-Homogenisation durchgeführt wird. Dafür wird ebenfalls in den meisten Fällen zuvor zentrifugiert, um die Zellen vom restlichen Medium, welches kein Produkt beinhaltet, zu trennen (vgl. Kapitel 4.1, 5.1, 6.1). Nach dem Aufschluss der Zelle differenzieren sich die folgenden Prozessschritte je nach Proteineigenschaften und Aggregatszustand [3, S. 166]. Je nach Protein unterscheiden sich die Verfahren aufgrund von fortschrittlichen Prozessentwicklungen, wie z.B. durch Verwendung von neuartigen Filtermaterialien anstatt herkömmlicher Chromatographieschritten [6]. Der beliebter werdende Umschwung von Edelstahl auf Einwegmaterialien bietet vor allem die Möglichkeit, die Kostenverteilung umzustrukturieren und eine höhere Flexibilität und größere Kosteneffizienz bei einzelnen Prozessschritten zu gewährleisten. In Abbildung 1 werden die jährlichen

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unterscheiden. Wird hierbei eine konventionelle Apparatur aus Edelstahl durch eine einmalig nutzbare Alternative aus Wegwerfmaterialien ersetzt, sind die Verbrauchsgüterkosten (Consumables) zwar höher, jedoch sinken aufgrund von wegfallenden Reinigungsmaßnahmen die restlichen Kostenparameter, wie Lohnkosten oder Anlagekosten. Bezogen auf den gesamten Prozess ist der Ertrag von Single-Use Materialien gegenüber der konventionellen Edelstahlvariante in diesem Fallbeispiel größer als der zusätzliche Aufwand an Verbrauchsgütern [7].

Abbildung 1: Bsp. Kostenumstrukturierung von Edelstahl auf Single-Use Virusfiltration [7]

Neben der Entscheidungsfrage ob Single-Use oder Edelstahl, besteht auch mittels neuer Technologien die Möglichkeit, bestehende Prozesse zu vereinen bzw. zu substituieren, um die Kosten pro Batch zu reduzieren und die Effizienz zu erhöhen. Ein Beispiel dafür ist die Nutzung von Hybrid-Filtern, welche beispielsweise von der Firma 3M^® vertrieben werden. Die ZetaPlus™ - und Emphaze™ - Filterelemente ermöglichen sowohl eine Trennung aufgrund unterschiedlicher Partikelgrößen als auch Ladungsunterschiede. Diese können dadurch das benötigte Säulenvolumen von folgenden AEX-Chromatographiesäulen reduzieren oder sogar komplett substituieren [8, S. 13f].

1.2.3 Kostenevaluierung von Bioprozessen

Wirtschaftlichkeitsberechnungen werden allgemein für die Analyse von Prozessen im Hinblick auf die einzelnen Kostenfaktoren verwendet. Ziel einer solchen Evaluierung ist einerseits die Identifikation von möglichen Kostenschwerpunkten. Bei diesen kann eine Optimierung den größten Einfluss auf den gesamten Prozess haben, wodurch die Gesamtkosten des Prozesses am effizientesten reduziert werden [9]. Andererseits können mehrere mögliche

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Prozessszenarien verglichen werden, um anhand der unterschiedlichen Kostenfaktoren das effizienteste Szenario auszuwählen [10]. Einzelne Kostenfaktoren wären etwa Mitarbeiterkosten, Anschaffungskosten oder die laufenden Kosten aus Verbrauchsgütern. Der Einfluss der jeweiligen Kostenparameter auf das gesamte Kostenmodell unterscheidet sich bei den verschiedenen Kostenmodellen, beispielsweise werden die Anschaffungskosten, abhängig vom Equipment, über einen bestimmten Zeitraum abgeschrieben, während die Verbrauchsgüter proportional zu jedem Batch oder über einen gewissen Zeitraum berechnet werden [11].

Da für eine präzise Kostenevaluierung sämtliche Prozessparameter, sowie Kostenfaktoren benötigt werden, kann das Fehlen oder das falsche Annehmen eines essenziellen Parameters zu Ergebnissen führen, die nicht der Kernaussage entsprechen. Dementsprechend werden die Simulationen auf die wesentlichen Kostenunterschiede reduziert und sämtliche Kostenfaktoren, die sich bei allen Szenarien nicht unterscheiden, vernachlässigt (s. Abbildung 2 als Beispiel der Konstruktions- und Planungskosten der Anlage). Beim Treffen von falschen Annahmen besteht das Risiko, dass der gesamte Prozess falsch eingestuft wird. Falls bei der reduzierten Evaluierung einige Faktoren nicht ermittelbar sind, werden mittels Online-Recherche oder telefonischer Nachfrage bei Anbietern eine Kostendimension als Referenz angegeben [12].

Abbildung 2: Beispiel – Kostenvernachlässigung

Bei verschiedenen Ansätzen von bereits veröffentlichen Prozesssimulationen werden die Prozessszenarien aufgrund ihrer jährlichen laufenden Kosten miteinander verglichen.

Neben den laufenden Kosten sind die zahlungswirksamen Aufwendungen ein wesentlicher

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Mithilfe einer Cashflow Analyse kann bei der Evaluierung von tatsächlich geplanten Prozessen ein Vergleich aus mehreren Kennzahlen erstellt werden. Dieser zeigt, ob Single-Use oder konventionelle Prozesse wirtschaftlicher sind [5].

Sind der Verkaufspreis und die jährliche Absatzmenge des simulierten Produktes bekannt, kann anhand des net present value (NPV) der Prozess auf dessen Rentabilität überprüft werden. Der NPV vergleicht dabei die Wertsteigerung des investierten Kapitals mit einer sicheren Geldanlage. Der Gewinn, der durch eine anderweitige Investition mit sicherer Rendite nicht erwirtschaftet werden kann, wird unter dem Begriff Opportunitätskosten zusammengefasst [14]. Bezieht man das Risiko einer neuen Anlage in die Berechnung ein, müssen die zu erwirtschaftenden Gewinne höher sein, als die Opportunitätskosten. Bezieht man neben dem Eigenkapital auch das Fremdkapital in den Prozess ein, welches für eine hohe Investition benötigt wird, kann man die Rentabilität des Prozesses mit dem Weighted Average Cost of Capital (WACC) vergleichen. Beim WACC wird der NPV in Kombination mit den Rückzahlungskosten des Fremdkapitals, die zu erwirtschaftende Rendite ermittelt, die mindestens erreicht werden muss, damit der Prozess rentabel ist [15], [16].

Vergleicht man zwei nahezu identische Prozesse, die sich lediglich in einem Prozessschritt unterscheiden (beispielsweise Single-Use und konventionell), liegt der wesentliche Unterschied im Zeitpunkt der jeweils fälligen Kosten. Bei einem konventionellen Prozess sind die Investitionskosten zu Beginn des Projektes höher. Beim Single-Use Prozess hingegen können die abgehenden Geldströme bis zum stückweisen Verbrauch der Güter verschoben werden, wodurch eine ausbalanciertere Kostenverteilung gewährleistet wird [17].

Je nach Projektlaufzeit und der Anzahl der Batches pro Jahr kann sich die Auswahl des wirtschaftlicheren Prozesses unterscheiden. Bei einem Projekt mit niedriger Batchanzahl pro Jahr und kurzer Laufzeit wird ein Szenario mit niedrigen Anschaffungskosten und höheren Verbrauchsgüterkosten bevorzugt, da die hohen laufenden Kosten, aufgrund der niedrigen Batchanzahl im Gesamten, niedrig gehalten werden. Ab einer bestimmten Projektdauer beziehungsweise einer bestimmten Batchanzahl ist das Single-Use Szenario gegenüber dem konventionellen Szenario teurer, da die hohen laufenden Kosten die Gesamtkosten einer flacheren (geringere variable Kosten) konventionellen Produktion übersteigen (s. Abbildung 3) [9].

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Abbildung 3: Prozesskostenvergleich Konventionell - Single Use

1.2.4 Herausforderungen bei der Zellbestandteilaufreinigung

Bei der Aufreinigung von E. coli Zellen werden durch den Zellaufschluss sämtliche Inhalte in die Suspension freigesetzt, die im Anschluss aus dem Medium entfernt werden müssen. Speziell Endotoxine und Host Cell-Proteine (HCPs), welche eine toxische Wirkung auf den Menschen haben, sollen abgetrennt werden [19], [20]. Die Herausforderung bei der HCP-Reduktion ist das Entfernen von bis zu ca. 4.300 Proteinen mit verschiedenen Eigenschaften (entspricht der Anzahl an Genen in E. coli) [21]. Die Problematik bei der Reduktion von Endotoxinen ist das geringe Molekulargewicht von 15-20 kDa. Derzeit existieren keine universalen Prozessschritte, um Endotoxine aufzureinigen, jedoch ist die Nutzung eines Anionentauschers eine der aussichtsreichsten Methoden [20].

Da eine gleichbleibende Qualität bei jedem Batch erwartet wird, kann die Mehrfachnutzung von Chromatographiesäulen ein Hindernis darstellen, da nach jedem Batch eine validierte Reinheitsüberprüfung erfolgen muss, sodass sämtliche Folgebatches durch Unreinheiten nicht beeinträchtigt werden können [22].

Verbindet man die Ziele eines reinen Produktes am Ende des Aufreinigungsprozesses mit dem Erstreben nach Kosteneffizienz, kann man feststellen, dass sich diese Ziele widersprechen, da mit steigender Anzahl an Prozessschritten die Reinheit zwar zunimmt, aber die Prozesskosten ebenfalls steigen.

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1.3 Zielsetzung

Ziel dieser Arbeit ist die Definition von drei repräsentativen Downstream-Prozessen mit E. coli und deren vollständige Implementierung in SuperPro Designer. Die Arbeit wird dazu in vier Phasen unterteilt.

In der ersten Phase werden zunächst sämtliche in Deutschland zugelassene Wirkstoffe, die aus E. coli exprimiert werden anhand ihrer Marktpräsenz analysiert und eingestuft. Hierfür sollen die jährlichen Umsätze der einzelnen Produkte als Referenzwert verwendet werden. Außerdem sollen die zur Verfügung stehenden kommerziellen Evaluierungssoftwares für eine weitreichend detaillierte Simulierung kombiniert werden.

In der zweiten Phase werden Downstream-Prozesse von Produkten aus E. coli analysiert und jeweils ein repräsentativer Prozess für cytoplasmatische, periplasmatische und als Inclusion Body vorliegende Proteine analysiert. Der Ansatz basiert auf der Prozessanalyse der zuvor analysierten Arzneimittel, sowie Prozessdaten, die im Fachbereich Bioengineering der FH Campus Wien generiert wurden.

Nach der Prozessevaluierung werden die drei ausgewählten Prozesse in der dritten Phase in SuperPro Designer implementiert und Prozessparameter definiert und normalisiert, damit die verschiedenen Prozesse auf einfache Weise miteinander verglichen werden können.

Wenn die Prozessparameter und die benötigten Materialien und Apparaturen definiert wurden, kann in der vierten Phase die Kostenermittlung der einzelnen Bestandteile erfolgen, um eine möglichst realitätsnahe Kostensimulation zu erhalten.

Nachdem die vier Phasen beendet sind, werden die Prozesse adaptiert, um Prozessoptimierungen und neue Technologien zu evaluieren.

Mit diesen definierten Prozessen sollen mögliche Prozessoptimierungen gegenüber der bestehenden verglichen und auf konkrete Probleme hingewiesen werden, welche limitierend für eine Prozessoptimierung sein können.

Darüber hinaus soll bei einem der Prozesse ein Vergleich sowohl im industriellen, als auch im 30 Liter Maßstab in Bezug auf neuartigen Technologien und konventionellen Verfahren durchgeführt werden.

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2 Material und Methoden

2.1 Kommerziell erhältliche Evaluierungssoftwares

Um bei großen Produktionsmaßstäben einen guten Überblick über die gesamte Kostensituation behalten zu können, existieren neben den üblichen Planungs- und Monitoring Softwares, wie RI-CAD der Firma Hitec-Zang [23], auch Programme, mit denen man die gesamte Produktion auf die einzelnen Kostenfaktoren aufteilen kann. Für die Pharmabranche wurden einige Software Programme eigens konzipiert, um eine möglichst an den jeweiligen Prozess angepasste Kostenevaluierung zu erstellen. Im Rahmen dieser Arbeit stehen die Programme SuperPro Designer und BioSolve der Firma Biopharm zur Verfügung, deren Vor- und Nachteile abgewogen werden [11], [24].

2.1.1 BioSolve

BioSolve ist eine Kostenevaluierungssoftware der Firma BioPharm, welche im Dezember 1998 gegründet wurde. Die Software ist auf MS Excel-Basis programmiert [24]. Mit BioSolve können sehr präzise Kostenevaluierungen durchgeführt werden, in denen sämtliche einzelne Kostenfaktoren miteinbezogen werden, wie beispielsweise Reinraumklassifizierungen, Reinstdampferzeugung oder die Möglichkeit einer detaillierten Finanzierungsanalyse. Da man mit der Software auch in hohen Maßstäben sehr präzise Kostenermittlungen durchführen kann, wird sie von vielen großen Pharmafirmen weltweit verwendet. Mit Synergieeffekten und anonymisierten Kostenfaktoren können mit der BioSolve-Datenbank einige Daten, wie z.B.

Kosten für Reinstwasser (WFI) oder für Bioreaktoren in mehreren Maßstäben verwendet werden, die regelmäßig erneuert werden. Für mikrobielle Prozesse ist ebenfalls ein Beispielprozess in der Software vorinstalliert, jedoch ist die graphische Darstellung des Prozesses nicht in Form eines Fließbildes integriert. Nachdem sämtliche Inputfaktoren in die Software implementiert wurden, können die daraus resultierenden Ergebnisse in Form von überschaubaren Diagrammen ausgegeben werden (s. Abbildung 4). Diese beziehen sich nicht nur auf die direkten Kosten, sondern auch auf die Lagerkapazität oder Standzeitoptimierung.

So können mehrere Szenarien, sowie die Auswirkungen durch die Veränderung einzelner Parameter überschaubar verglichen werden.

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Abbildung 4: Abbildungsmuster BioSolve [25]

In Abbildung 4 kann die genaue Kostenanalyse eines gesamten standardisierten Antikörper Prozesses eingesehen werden. Mithilfe von Torten- und Säulendiagrammen kann bei jedem Prozessschritt der jeweilige Kostenschwerpunkt ermittelt werden und Einsparpotenzial im Gesamtprozess evaluiert werden [25]

2.1.2 SuperPro Designer

SuperPro Designer ist eine Kostenevaluierungssoftware der Firma Intelligen, welche seit 1991 kommerziell erhältlich ist. Mithilfe dieser Software lassen sich übersichtliche Fließbilder erstellen, die dem Nutzer eine große Vielfalt an Berechnungsmethoden liefern und die zudem leicht verständlich dargestellt werden können (s. Abbildung 5). Die Fließbilder beinhalten sämtliche Unit operations, welche vom Nutzer angepasst und dimensioniert werden können.

Mit SuperPro Designer sind sowohl Greenfield-Analysen (Analysen von Prozessen, bei denen die dazugehörige Anlage noch nicht besteht) möglich als auch die Simulation von bestehenden Prozessen, bei denen sämtliche Kostenfaktoren bereits bekannt sind. Die simulierte Anlage bezieht sich jedoch nur auf den einzelnen Prozess und bietet die für die Industrie benötigten Zeitplanregulierungen im Betrieb mit mehreren Prozessen nicht. Zwar gibt es für die Zeitplanregulierung die Software SchedulePro der Firma Intelligen, welche allerdings im Rahmen dieser Arbeit keine Anwendung findet [26]. Dementsprechend liegt der Schwerpunkt auf der Prozessentwicklung mit SuperPro Designer.

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Abbildung 5: Beispielprozess Beta-Galactosidase [5]

Das in Abbildung 5 dargestellte Fließbild stellt beispielhaft einen E. coli Produktionsprozess von Beta-Galactosidase dar. Die unterschiedlichen Farben der Apparaturen geben hierbei die verschiedenen Produktionsabschnitte wie Fermentation, Zellaufschluss und Aufreinigung wieder.

2.2 Prozessfindung

Da bei der Aufreinigung von rekombinanten Proteinen aus E. coli wesentliche Unterschiede bedingt durch Proteineigenschaften, wie der isoelektrische Punkt, vorliegen, müssen einige bestehende Prozesse zunächst analysiert werden (s. 4.1, 5.1, 6.1). Anschließend soll ein Plattformprozess mit größtmöglicher Repräsentanz für sämtliche Proteine definiert werden.

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2.2.1 Analyse von ausgewählten Pharmazeutika

Das Austrian Center of Industrial Biotechnology (ACIB) hat im Zuge von Forschungsprojekten einige rekombinante Stämme und Zelllinien generiert. Für diese Studie wurde uns dankenswerterweise ein rekombinanter E. coli Produktionsstamm, der den Fibroblast Growth Factor-2 exprimiert (s. 4.1.1), zur Verfügung gestellt, mit diesem können industrierelevante Prozesse simuliert und die Auswirkungen einer Prozessumstrukturierung dargestellt werden.

Ein limitierender Faktor dieser Arbeit war jedoch die Verfügbarkeit anderer Produktionsstämme. Dementsprechend müssen für ausgewählte Produkte die Prozesse modifiziert werden, die mittels Literaturrecherche ermittelt werden.

2.2.2 Literaturrecherche

Die Literaturrecherche stellt den grundlegenden Schritt dar, um einen repräsentativen Prozess zu definieren. Mit ihr sollen die ersten grundlegenden Gemeinsamkeiten verschiedenster Prozessabfolgen gefunden, evaluiert und in die Software integriert werden. Darüber hinaus werden die Prozessabfolgen, im Labormaßstab nachgestellt und mögliche Verbesserungen evaluiert. Neben bestehenden Publikationen können auch Patente als Grundlage für die Evaluierung verwendet werden.

Bei diesem Ansatz werden für cytoplasmatische, periplasmatische und Inclusion Body Prozesse je fünf ausgewählte Therapeutika analysiert, wobei von jedem Wirkstoff je fünf Prozessabfolgen ermittelt werden. Nach der Ermittlung der Prozesse soll im Optimalfall einer dieser Prozesse pro Wirkstoff repräsentativ für die anderen analysierten Prozesse sein.

Dementsprechend werden insgesamt je 25 Aufreinigungsprozesse für cytoplasmatische, periplasmatische und Inclusion Body Prozesse miteinander verglichen, bevor ein finaler Plattformprozess simuliert wird.

2.3 Ionentauscher und deren Bedeutung

Da die Entfernung von Endotoxinen und HCPs bei E. coli Aufreinigungsprozessen ein wesentlicher Faktor ist und die Nutzung von Ionentauschern als eines der effektivsten Verfahren für deren Reduktion gilt, wird ein besonderer Fokus auf deren Einbezug in den Prozess gelegt [20], [21]. Für die genaue Analyse wird zudem von jedem Wirkstoff der isoelektrische Punkt berücksichtigt. In E. coli können bis zu ca. 4.300 verschiedene HCPs mit verschiedenen Eigenschaften vorhanden sein, die sich jedoch in ihrem isoelektrischen Punkt unterscheiden. Ist der isoelektrische Punkt des Wirkstoffes bekannt, kann mittels pH-Wert

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Regulierung eine gezielte HCP- und Endotoxin-Reduktion durchgeführt werden (s. Abbildung 6) [19].

Abbildung 6: Theoretische isoelektrische Punkte von 4.237 HCPs; E. coli K12-Stamm [19]

2.4 Hybrid Filtration als Substitut für Anionentauscher

Hybrid-Filter der Firma 3M^® bieten neuartige Methoden, bei denen die in 1.2.4 geschilderten Unreinheiten der Zellsuspension gereinigt werden können. Die Filtermodelle ZetaPlus™ und Emphaze™ sind negativ geladene Tiefenfilter, die in Reihe geschaltet werden können, um eine AEX Chromatographie zu ersetzen [27]. Durch den direkten Vergleich von AEX- Chromatographie und Hybrid-Filtration kann je nach Prozess und Volumen evaluiert werden, welche Methode wirtschaftlicher ist. Die Wirkungsweisen der Filtermodelle ZetaPlus™ und Emphaze™ werden hierfür zunächst erläutert.

ZetaPlus™ Filter sind Tiefenfilter, deren Matrix ein positives Zetapotential aufweisen. Sie entfernen sowohl Endotoxine, DNA als auch HCPs mit negativer Nettoladung aus der Suspension und durch Entfernung weiterer gröberer Unreinheiten wird eine Klärung erreicht.

Sie dienen als Vorstufe für die darauffolgende Emphaze™ Filtration [28].

Emphaze™ Hybridfilter bestehen aus einem stark positiv geladenem Polymer, welches ähnlich

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Unreinheiten entfernt. Der Wirkung der Emphaze™ Hybridfilter führt aufgrund des Designs zu einer verstärkten Aufreinigung [27].

Je nach Partikelgröße unterscheidet sich das jeweilige Modell der ZetaPlus™ Filter. Da aus verschiedenen Homogenisationsparametern unterschiedliche Partikelgrößen resultieren, müssen die jeweiligen Filter an die tatsächliche Größe angepasst werden (s. Abbildung 7) [29].

Abbildung 7: ZetaPlus™ Modelle und Partikelgrößen

Für die Simulationen wird angenommen, dass sämtliche Filtrationsprozesse mit konstantem Durchfluss durchgeführt werden. Die jeweiligen Durchflussraten werden in den jeweiligen Prozessanalysen definiert [30].

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3 Analysen und Modellauswahl

3.1 Gegenüberstellung der Software-Pakete

Die in 2.1 erläuterten Evaluierungssoftwares werden anhand ihrer Vor- und Nachteile verglichen, damit eine optimierte Prozessevaluierung stattfinden kann. In Tabelle 1 werden diese dargestellt.

Tabelle 1: Vor- und Nachteile der Programme

BioSolve SuperPro Designer

- Keine überschaubaren Fließbilder + Überschaubare Fließbilder + Präzise Analyse von gesamten Prozessen + Analysen werden auf die wesentlichen

Parameter ausgelegt

- Undurchsichtige Berechnungsschritte + Durchsichtige Berechnungsschritte + Weitreichende aktualisierte Datenbank - Keine aktualisierte Datenbank

+ Excel Design - altmodisches Design

Aufgrund der präzisen Evaluierung ist die Nutzung von BioSolve ohne bestehender Anlage, wie in dieser Arbeit der Fall, unvorteilhaft, da ein Großteil der benötigten Daten angenommen werden muss. Dies kann allerdings zu großen Annahmeschwankungen führen, woraus wiederum die Evaluierungsergebnisse ungenau werden. Außerdem werden die einzelnen Rechenschritte nicht so ersichtlich dargestellt wie in SuperPro Designer. Da die Verwendung von Fließbildern leichter verständlich ist, wird die Evaluierung mit SuperPro Designer durchgeführt. Falls Kostenparameter benötigt werden, die aufgrund der nicht aktualisierten Datenbank von SuperPro Designer nicht vorhanden und nicht einholbar sind, können diese aus BioSolve entnommen werden.

3.2 Prozesssimulation – Evaluierung mit SuperPro Designer

Mithilfe von SuperPro Designer sollen die zu simulierenden Prozesse dargestellt und evaluiert werden. Im Folgenden werden die einzelnen Parameter und Berechnungen der Software erläutert.

3.2.1 Bestehende Prozesse/Datenbanken

Die Datenbank von SuperPro Designer beinhaltet mehrere Beispielprozesse, wie z.B.

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Aufreinigung von Insulin, da es eines der absatzstärksten gentechnisch hergestellten Wirkstoffe weltweit ist und somit repräsentativ zur Plattformprozessfindung verwendet wird [31]. Die Datenbank von SuperPro Designer umfasst außerdem eine dynamische Analyse der Apparaturkosten bei abweichenden Volumina, jedoch befinden sich in der genutzten

„academical research“ Version nur wenige Daten bzgl. Rohmaterialien oder Verbrauchsstoffen (vgl. 3.1).

3.2.2 Inputs

Üblicherweise wird die ökonomische Evaluierung nach der Versuchsdurchführung ausgeführt, da beispielsweise Massebilanzen, Ausbeuten und Prozessschritte vorher definiert werden. Die Eingabe der Medienkosten muss im Rahmen dieser Arbeit nicht im Detail erfolgen, da ausschließlich DSP-Prozesse analysiert werden. Dementsprechend kann man von der Zusammensetzung des Mediums vereinfacht von Wasser, Biomasse und Produkt ausgehen. Die Prozesskosten lassen sich in folgende Bereiche einteilen [11]:

Tabelle 2: Auflistung der einzelnen Kostentypen

Kostentyp Beispiele

Materialien Medium, Pufferlösung, Produktionsstamm Lohnkosten ArbeiterIn in Produktion, SchichtleiterIn Apparaturkosten Abschreibungen, Start up Phase

Verbrauchsgüter Tiefenfilter, Chromatographiesäule, Single Use Bags Qualitätskontrolle ELISA, Western Blot, SDS-PAGE,

Entsorgung Giftstoffneutralisation, Entsorgung von Single Use Bags Betriebsmittel Reinstwasser (WFI), Strom

Transport Speditionskosten

Sonstiges Anteilige Nutzung von Apparaturen anderer Prozesse

Laut SuperPro Designer sind Materialien meist flüssige Bestandteile, welche direkt in den Prozess integriert sind und im Materialfluss dargestellt werden. Verbrauchsgüter sind an Apparaturen geknüpft. Ihre Verbrauchsrate hängt von der Nutzung des jeweiligen Equipments ab [11].

Neben den Kosten können auch andere Parameter in den Prozess implementiert werden. Jede Apparatur verfügt über eine Auswahl an einzelnen Prozessschritten wie z.B. Cleaning in Place (CIP) bei einer Zentrifuge, Zentrifugieren, Sterilisation in Place (SIP), oder Standzeiten, bei

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denen nur Personalkosten entstehen. Die einzelnen Prozessparameter, die für die Kostenevaluierung benötigt werden, können in den auswählbaren Prozessschritten modifiziert werden (s. Abbildung 8).

Abbildung 8: Prozessparameter Zentrifugation [5]

Je nach Durchsatzvolumen und eingesetztem Durchfluss können Dimensionierung und Kosten der Zentrifuge von der Software berechnet werden, sofern diese Daten nicht verfügbar sind.

Außerdem kann die Anzahl der Mitarbeiter bestimmt werden, die für einen Prozessschritt benötigt werden. Die Kosten eines Mitarbeiters können entweder zuvor definiert werden oder man verwendet die von der Software vorgeschlagenen Muster. Beispielsweise kostet eine ausführende Arbeitskraft laut Software 43,50 Euro pro Stunde, was bei einer Zentrifugationsdauer von drei Stunden und beim Einsatz von zwei Arbeitskräften, auf Lohnkosten von 261 Euro aufsummiert wird. Falls mehrere Zentrifugationsschritte benötigt werden sollten, kann dieselbe Zentrifuge mehrmals verwendet werden, sollte sie zeitlich verfügbar sein. Durch die Erstellung eines Gantt-Charts kann zudem eine optimierte Gerätenutzung generiert werden, um die Engpässe zu reduzieren oder zu detektieren. Dadurch können die Engpässe mithilfe von Mehrfachanschaffungen gestaffelt werden. Durch eine gestaffelte Nutzung von zwei Chromatographiesäulen mit demselben Volumen, kann die Prozesszeit pro Batch reduziert werden (s. Abbildung 9, Abbildung 10) [5].

(24)

Abbildung 9: Gantt-Chart ohne Staffelung [5]

Abbildung 10: Gantt-Chart mit Staffelung [5]

In Abbildung 9 und Abbildung 10 sind zwei identische, selbst erstellte Prozesse einer humanen Serum Albumin (HSA) Produktion im 180 Liter Maßstab des FH Campus Wien dargestellt, die sich lediglich in der Staffelung der jeweiligen Engpässe unterscheiden. Hierbei kann man feststellen, dass durch die Staffelung der Engpassgeräte eine deutlich höhere Effizienz bei der Absatzmenge erzielt wird. Die Mehrkosten, die durch die Staffelung entstehen (durch höhere Anschaffungskosten, Lohnkosten und Lagerkapazitäten) werden gegenübergestellt und - insofern sie realisierbar sind - evaluiert. Bietet die Staffelung eine Gewinnsteigerung, so kann man ebenfalls feststellen, dass der dritte farbig markierte Batch (magenta Banden) aufgrund der Staffelung von Bioreaktoren, Lagertanks und Chromatographiesäulen, bereits acht Wochen nach dem ersten Batch-Start (türkise Banden) beendet ist. Ohne Staffelung wäre selbiger Batch erst elf Wochen nach dem ersten Batch-Start beendet. Die gestaffelten Geräte sind jeweils in Abbildung 10 links mit „STG00X“ gekennzeichnet [5].

Neben den zeitlichen Parametern kann man auch gerätebezogene Kostenfaktoren modifizieren.

Bei der Dimensionierung der Geräte hat man die Auswahl zwischen dem „rated mode“ und

(25)

dem „calculated mode“. Der „rated mode“ bietet die Möglichkeit eigene Daten einzusetzen und selber zu dimensionieren. Beim „calculated mode“ hingegen kann man beispielsweise das maximale Füllvolumen angeben und falls dieses im Prozess überschritten werden sollte, wird automatisch eine zweite Apparatur mit angepasstem Füllvolumen verwendet. Die Kostenskalierung der Geräte wird in diesem Fall von der Software übernommen [5].

3.2.3 Outputs

Nachdem die erforderlichen Parameter in die Software implementiert wurden, können die Prozesse ausgewertet und verglichen werden. Je nach Bedarf können mehrere Prozessberichte, wie ökonomische Evaluierung, Cashflow Analyse, Kosten pro Apparatur, Entsorgungskosten, Reinigungskosten erstellt werden. Der sogenannte Economic Evaluations Report (EER) hat hierbei die größte Bedeutung, da unter anderem Analysen zu auftretenden Kostenunterschieden durchgeführt, Verkaufspreise des Zielproduktes definiert oder Kostenschwerpunkte analysiert werden können (s. Abbildung 11, Abbildung 12). Die im Rahmen dieser Arbeit entwickelten Verfahrensfließbilder sind ebenfalls ein Bestandteil der gewünschten Outputs [11].

Abbildung 11: Ausschnitt Economic Evaluation Report

(26)

Abbildung 12: Analysebeispiel laufender Prozesskosten [5]

3.3 Marktanalyse therapeutischer E. coli Produkte

Laut dem Verband forschender Arzneimittelhersteller (Stand Oktober 2016) werden 43 therapeutische Biopharmazeutika in E.coli exprimiert. Die jeweiligen Wirkstoffe, Hersteller und Arzneimittel können aus der verfügbaren Liste ausgelesen werden [1]. Die Marktpräsenz der einzelnen Arzneimittel kann verglichen werden, indem die jeweiligen Weltjahresumsätze der Jahre 2014 und 2015 miteinander verglichen werden. Nach der Analyse können die einzelnen Produkte aufgrund ihrer Marktpräsenz eingestuft werden. In Tabelle 3 sind die jeweiligen Produkte farblich gekennzeichnet, wobei die gelb markierten Produkte einen konstanten Weltjahresumsatz von über 1 Milliarde US-Dollar, die blau markierten Produkte einen konstanten Umsatz zwischen 500 Millionen und 1 Milliarden US-Dollar, die grün markierten Produkte einen konstanten Umsatz zwischen 100 Millionen und 500 Millionen US-Dollar und die orange markierten Produkte einen konstanten Umsatz bis 100 Millionen US-Dollar erwirtschaften. Die Produkte ohne ermittelten Umsatz sind entweder Biosimilars, die in derselben Farbe markiert wurden, wie die jeweiligen Ursprungsprodukte oder Arzneimittel, deren Weltjahresumsätze nicht ermittelt werden konnten (rote Markierung).

Tabelle 3: Liste aller E. coli Therapeutika

Wirkstoff Firma Arzneimittel Umsatz '14 Umsatz '15 Quelle Insulin glargin Sanofi-Aventis Lantus® USD

6.978.000.000,00

USD

7.029.000.000,00 [32]

Pegfilgrastim Amgen Neulasta® USD

4.596.000.000,00

USD

4.715.000.000,00 [32]

Insulin lispro Lilly Humalog® USD

2.785.200.000,00

USD

2.842.000.000,00 [32]

Ranibizumab Novartis Lucentis® USD 2.441.000.000,00

USD

2.060.000.000,00 [32]

(27)

Teriparatid Lilly Forteo® USD 1.322.000.000,00

USD

1.348.300.000,00 [32]

Certolizumab

pegol UCB Cimzia® € 797.000.000,00 €

1.083.000.000,00 [33]

Interferon beta-

1b Bayer Betaferon® € 823.000.000,00 € 824.000.000,00 [32]

Peginterferon

alfa-2a Roche PEGASYS® USD

1.025.000.000,00

USD

543.000.000,00 [32]

Romiplostim Amgen Nplate® USD

469.000.000,00

USD

525.000.000,00 [32]

Impfstoff (Konjugat) gegen

Pneumokokken

GlaxoSmith

Kline Synflorix® GBP

398.000.000,00

GBP

381.000.000,00 [32]

Insulin glulisin Sanofi-Aventis Apidra® € 336.000.000,00 € 376.000.000,00 [32]

Pegvisomant Pfizer Somavert® USD

229.000.000,00

USD

218.000.000,00 [32]

Peginterferon

alfa-2b MSD Peg-Intron® USD

381.000.000,00

USD

182.000.000,00 [32]

Interferon beta-

1b Novartis Extavia®* USD

177.000.000,00

USD

179.000.000,00 [34]

Insulin human Sanofi-Aventis Insuman® € 137.000.000,00 € 141.000.000,00 [32]

Interferon alfa-

2b MSD Intron A® USD

150.000.000,00

USD

133.000.000,00 [35]

Impfstoff gegen Meningokokken

Gruppe B

GlaxoSmith

Kline Bexsero® GBP 0,00 GBP

115.000.000,00 [32]

Insulin human Sanofi-Aventis

Insulin Human Winthrop®

Peginterferon

alfa-2b MSD ViraferonPeg

® Palifermin Swedish

Orphan Kepivance® USD

12.400.000,00

USD

112.000.000,00 [36]

Anakinra Biovitrum Kineret® USD

82.000.000,00

USD

96.000.000,00 [37]

Somatropin Ipsen Pharma Nutropin AQ®

USD 65.000.000,00

USD

66.000.000,00 [32]

Mecasermin Ipsen Pharma Increlex® USD 14.000.000,00

USD

22.000.000,00 [32]

Lipegfilgrastim Teva Lonquex® USD

27.000.000,00

USD

15.000.000,00 [38]

Somatropin

(Biosimilar) Sandoz GmbH Omnitrope®

Filgrastim

(Biosimilar) Sandoz Zarzio®

Filgrastim

(Biosimilar) Accord Accofil®

(28)

Filgrastim

(Biosimilar) Apotex Grastofil®

Filgrastim

(Biosimilar) Hexal Filgrastim Hexal®

Filgrastim

(Biosimilar) Hospira UK Nivestim®

Filgrastim

(Biosimilar) Ratiopharm Ratiograstim

® Filgrastim

(Biosimilar) Teva Generics Tevagrastim®

Insulin glargin Lilly Abasaglar®

Insulin glargin Sanofi-Aventis Optisulin®

Insulin lispro Lilly Liprolog®

Pegfilgrastim Amgen Ristempa®

Tasonermin Boehringer

Ingelheim Beromun®

Asparaginase Medac Spectrila®

Nebenschilddrüs

en-Hormon Nycomed Preotact®

Pegloticase Savient Pharma Krystexxa®

Reteplase Actavis Rapilysin®

Teduglutid NPS Pharma

Holdings Ltd. Revestive®

4 Prozessanalyse – Cytoplasmatisch

Bei der Aufreinigung von cytoplasmatischen Proteinen, also Proteinen, die innerhalb der Zelle gelöst sind, gibt es eine definierte Abfolge von Zielen, die für eine möglichst hohe Reinheit eingehalten werden müssen [19]. Die Abfolge besteht zunächst aus der Trennung der Zellen vom Kultivierungsmedium, dem Zellaufschluss und der anschließenden Aufreinigung des Proteins durch unterschiedliche Proteineigenschaften, wie Ladung, Gewicht, Partikelgröße, Dichte etc. Da im Rahmen dieser Arbeit keine extrazellulären Prozesse analysiert und von einem einheitlichen Medienvolumen von 30 Litern nach der Fermentation ausgegangen wird, kann der erste Schritt in der Prozessdefinition als Zentrifugation definiert werden. Der jeweils markierte Prozess in den folgenden Kapiteln soll hierbei als repräsentativ für die Aufreinigung des dazugehörigen Proteins gelten. Die Parameter für diese Zentrifugation, sowie die folgenden Parameter können aus dem in 4.2. dargestellten Prozess entnommen werden. Hierbei werden vom Fachbereich Bioengineering der FH Campus Wien die Prozesse durchgeführt und deren Ausbeuten ermittelt.

(29)

4.1 Analyse bestehender Prozesse 4.1.1 Fibroblast Growth Factor – 2

Fibroblast Growth Factor (FGF-2) – 2, oder auch Basic Fibroblast Growth Factor ist ein Wachstumsfaktor, welcher an Heparin bindet, in Deutschland jedoch nicht zugelassen ist. Er besitzt einen isoelektrischen Punkt von 9,6 und stimuliert die Verbreitung einer Vielzahl von Zellen im Körper [1], [39], [40]. Die Analyse aus Patenten und veröffentlichten Versuchen ergeben folgende Aufreinigungsprozess-Szenarien:

Tabelle 4: Aufreinigungsprozesse FGF-2

Veröffentlichung Prozess

Paper 1 [41] Zentrifugation > Homogenisation > Zentrifugation > CEX >

Affinitätschromatographie

Paper 2 [42] Zentrifugation > Homogenisation > Zentrifugation >

Nickel-Affinitätschromatographie > Affinitätschromatographie Paper 3 [43] Zentrifugation > Homogenisation > Zentrifugation >

Nickel-Affinitätschromatographie

Patent 1 [44] Zentrifugation > Homogenisation > Zentrifugation > CEX >

Affinitätschromatographie > SEC

Patent 2 [45] Zentrifugation > Homogenisation > Zentrifugation > CEX > HIC >

schwache AEX Repräsentativer

Produktionsprozess

Zentrifugation > Homogenisation > Zentrifugation > CEX >

Affinitätschromatographie

4.1.2 Tasonermin

Das Protein Tasonermin mit einem isoelektrischen Punkt von 6,4, welches auch als Tumor- Nekrose-Faktor-alpha-1a (TNFα-1a) bezeichnet wird, ist ein Wirkstoff, der zur Behandlung von Tumoren präventiv oder palliativ angewendet werden kann [46], [47]. Ein Arzneimittel, welches den Wirkstoff beinhaltet ist Beromun®, das von der Firma Boehringer Ingelheim vertrieben wird [1]. Die Analyse aus Patenten und veröffentlichten Versuchen ergeben folgende Aufreinigungsprozess-Szenarien:

(30)

Tabelle 5: Aufreinigungsprozesse Tasonermin

Infosheet [46] Zentrifugation > Homogenisation > Zentrifugation > Präzipitat >

fünf Chromatographieschritte

Paper [48] Zentrifugation > Homogenisation > Zentrifugation >

Affinitätschromatographie Patent 1 [49]

Zentrifugation > Homogenisation > Zentrifugation >

Präzipitation > AEX > HIC > Affinitätschromatographie >

SEC

Buch [50, S. 15] Bestätigung der anderen Prozesse

Patent 2 [51] Zentrifugation > Homogenisation > Zentrifugation >

Affinitätschromatographie > Glasbead-Chromatographie Repräsentativer

Produktionsprozess

Zentrifugation > Homogenisation > Zentrifugation > Präzipitation

> AEX > HIC > Affinitätschromatographie > SEC

4.1.3 Interferon – α-2b

Interferon – α-2b ist ein rekombinantes Protein, das in der Krebstherapie und gegen Hepatitis B und C eingesetzt werden kann. Der isoelektrische Punkt liegt bei 6,0 [52], [53]. Es ist seit März 2000 in Deutschland unter dem Arzneimittel IntronA® der Firma Merck zugelassen [1].

Neben Interferon - α-2b werden auch weitere Interferon – α Proteine cytoplasmatisch aus E.

coli aufgereinigt. Die allgemeinen Aufreinigungsprozesse von Interferon – α sind in folgender Tabelle dargestellt:

Tabelle 6: Aufreinigungsprozesse Interferon - α-2b

Tandem-Chromatographie > Präzipitation > CEX Paper 1 [55] Zentrifugation > Homogenisation > Zentrifugation >

Bead-Filtration > Bead-Chromatographie > AEX > SEC Paper 2 [56] Zentrifugation > Homogenisation > Zentrifugation > AEX >

CEX > HIC > UF > SEC

Affinitätschromatographie > Thrombin cleavage > SEC Patent 3 [58] Zentrifugation > Homogenisation > Zentrifugation > SEC >

HIC > CEX > AEX Repräsentativer

Produktionsprozess

Zentrifugation > Homogenisation > Zentrifugation > SEC > HIC >

CEX > AEX

(31)

4.1.4 Anakinra

Anakinra ist ein Wirkstoff, der zur Behandlung gegen Reumatoide Athritis eingesetzt wird, um Entzündungen zu hemmen [59]. Seit März 2002 ist von der Firma Swedish Orphan Biovitrum das Arzneimittel Kineret® in Deutschland zugelassen, welches Anakinra als Wirkstoff beinhaltet [1]. Der isoelektrische Punkt von Anakinra liegt bei 5,5 [60]. Die Analyse aus Patenten und veröffentlichten Versuchen ergeben folgende Aufreinigungsprozess-Szenarien:

Tabelle 7: Aufreinigungsprozesse Anakinra

Buch [61, S. 21] Zentrifugation > Homogenisation > Zentrifugation > IEX >

Chromatographien

Paper 1 [62] Zentrifugation > Homogenisation > Zentrifugation > Expanded bed Chromatographie > AEX > Endotoxin-Chromatographie Paper 3 [63] Zentrifugation > Homogenisation > Zentrifugation >

Bead-Inkubation > Flow through Chromatographie Patent 1 [64] Zentrifugation > Homogenisation > Zentrifugation > CEX >

AEX > UF/DF

Infosheet [65] Stellt den Prozess grundsätzlich als Abfolge von Chromatographie und Filtrationsschritten dar

Repräsentativer Produktionsprozess

Zentrifugation > Homogenisation > Zentrifugation > CEX > AEX

> UF/DF

4.1.5 Asparaginase

Asparaginase ist ein Zytostatikum, das zur Therapie von Leukämie eingesetzt wird. Es baut die nicht essentielle Aminosäure Asparagin ab, wodurch Leukämiezellen angegriffen werden können [66]. Der isoelektrische Punkt liegt bei 4,7 [67]. Seit Januar 2016 ist in Deutschland das Arzneimittel Spectrila® der Firma Medac zugelassen, welches Asparaginase als Wirkstoff enthält [1]. Die Analyse aus Patenten und veröffentlichten Versuchen ergeben folgende Aufreinigungsprozess-Szenarien:

(32)

Tabelle 8: Aufreinigungsprozesse Asparaginase

Paper 1 [68] Zentrifugation > Homogenisation > Präzipitation >

Zentrifugation > AEX > CEX > Mixen Paper 2 [69] Zentrifugation > Homogenisation > Zentrifugation >

Nickel-Affinitätschromatographie > Affinitätschromatographie Paper 3 [70] Zentrifugation > Homogenisation > Zentrifugation >

Nickel-Affinitätschromatographie Patent 1 [71]

Zentrifugation > Homogenisation > Präzipitat > Zentrifugation

> AEX > Präzipitation > Zentrifugation > CEX > Mixen mit Ethanol

Patent 2 [72] Zentrifugation > Homogenisation > Präzipitation >

Gel-Behandlung > Mixen Repräsentativer

Produktionsprozess

Zentrifugation > Homogenisation > Präzipitat > Zentrifugation >

AEX > Präzipitation > Zentrifugation > CEX > Mixen mit Ethanol

4.1.6 Prozessdefinition

Der repräsentative Prozess wurde anhand der in 4.1 analysierten Prozesse und der erforderlichen Aufreinigungsanforderungen von E. coli definiert und im Labor des Fachbereichs Bioengineering der FH Campus Wien durchgeführt. Dieser Prozess wird im folgenden Kapitel genauer beschrieben.

4.2 Downstream Analyse - Fibroblast Growth Factor-2 aus E. coli

Wie bereits in 2.2.1 erläutert, steht eine Zelllinie zur Verfügung, mit der das rekombinante Protein FGF-2 exprimiert werden kann. Anhand der vorhandenen Prozess-Szenarien und benötigten Aufreinigungsmaßnahmen, ist der folgende Prozess durchgeführt worden:

 Zentrifugation mit Tellerseparator

 Homogenisation mit Hochdruckhomogenisator

 Zentrifugation mit Tellerseparator

 Filtration mit ZetaPlus90ZB08A™ (2300cm² Filterfläche)

 Filtration mit ZetaPlus120ZB08A™ (2300cm² Filterfläche)

 Filtration mit Emphaze EMP710AEX020A™ (2300cm² Filterfläche)

 Kationentauscher (CEX)-Chromatographie (Poros HS50 Gel) mit 2,5 Liter Säulenvolumen

(33)

Prozessbeschreibung:

Der Prozess startet mit einem fertigen Erntevolumen von 30 Litern eines Fed Batches und einem Biomasseanteil von 32,5 g/L, der mittels Tellerseparator mit 17.600 g separiert wird. Die Temperatur während des gesamten Aufreinigungsprozesses beträgt 4 °C. Der Überstand wird verworfen und 3,25 kg feuchte Biomasse bleiben in der Feststofffraktion erhalten.

Anschließend wird die Feststofffraktion auf 30 Liter mit Aufschlusspuffer verdünnt (50 mM Tris-HCl und 100 mM NaCl). Die Homogenisation im Hochdruckhomogenisator wird mit 70/700 bar in zwei Passagen durchgeführt. Die Proteinkonzentration nach der Homogenisation beträgt 0,56 g/L auf 30 L Homogenisat. In einem weiteren Zentrifugationsschritt im Tellerseparator bei 17.600 g werden sämtliche ungelöste Zellbestandteile separiert und der Kulturüberstand mit einem Restvolumen von 23,54 L bleibt erhalten. Die Produktkonzentration nach diesem Schritt beträgt 0,56 g/L, woraus eine Produktausbeute von ca. 78,5 % resultiert [73].

Vor den Filtrationsschritten werden die Filter mit 54 L/m² Aufschlusspuffer vorgespült. Die oben genannten Filtermodelle werden anschließend in Reihe geschaltet und filtrieren den Supernatant mit je 100 L/m² Durchflussrate. Die Produktausbeute der gesamten Filtration beträgt 85 % bei gleichbleibendem Volumen. Die Produktkonzentration nach der Filtration beträgt 48 g/L [73].

In der abschließenden CEX-Chromatographie werden folgende Prozessschritte durchgeführt [73]:

 Equilibrieren: 6 Säulenvolumen Chrom. Puffer-A

 Laden

 Waschen: 3 Säulenvolumen Chrom. Puffer-A

 Eluieren: 10 Säulenvolumen Chrom. Puffer-A + 10 Säulenvolumen Chrom. Puffer B

 Regenerieren: 3 Säulenvolumen Chrom. Puffer-A

Chrom. Puffer-A ist von der Zusammensetzung her identisch mit dem Aufschlusspuffer.

Chrom. Puffer-B besteht aus RO-Wasser mit 50 mM Tris-HCl und 1 M NaCl. Nach der CEX- Chromatographie besteht eine Proteinfraktion mit ca. 40 g/L Protein und einem Gesamtvolumen von 0,17 L. Die Produktausbeute der CEX-Chromatographie liegt bei 60 %

(34)

Je nach Darreichungsform unterscheidet sich die Formulierung des Therapeutikums. Da nach der letzten Chromatographie keine weiteren Proteinaufreinigungsschritte durchgeführt werden, ist dies der letzte Schritt in der Evaluierung. Die gesamte Prozessabfolge ist in Abbildung 13 dargestellt [73]

Abbildung 13: SuperPro Prozess FGF-2 [5]

4.3 Kostenanalyse - FGF-2

Die Kosten der zur Produktion verwendeten Geräte sind nur teilweise in den Prozess integrierbar, da die Anschaffungskosten aufgrund der fehlenden Aktualität nicht repräsentativ sind. Deshalb sind die von der Software simulierten Kostenmodelle wenig aussagekräftig.

Allerdings werden diese bei anderen Prozessevaluierungen ebenfalls eingesetzt und können dadurch miteinander verglichen werden. Falls die konkreten Kosten für bestehende Apparaturen eingeholt werden können, werden diese in den Prozessen verwendet.

Es besteht zudem auch die Möglichkeit einer Mehrfachverwendung einzelner Apparaturen, wie z.B. der Zentrifuge. Während des gesamten Prozesses soll derselbe Tellerseparator mehrfach verwendet werden. Da allerdings die Überschaubarkeit beim Fließbild dadurch verloren geht, kann während des Erstellens dieselbe Apparatur in mehreren Unit operations dargestellt werden (s. Abbildung 14).

(35)

Abbildung 14: Symbol bei mehrfacher Verwendung derselben Apparatur [5]

Unter der Berücksichtigung von betriebsfreier Zeit, kann ein Batch pro Woche durchgeführt werden. Wird der Batch auf eine Arbeitswoche zu je fünf Tagen ausgelegt, ergibt sich die oben genannte jährliche Batch-Anzahl bei 47 Arbeitswochen pro Jahr. Diese Anzahl an Arbeitswochen im Jahr wird von SuperPro Designer als Richtwert angenommen und wird für sämtliche Evaluierungen verwendet [5].

4.3.1 Equipmentkosten

Folgende Apparaturen kommen mit dem Produkt bei der Aufreinigung in Berührung: [73]

 1 x Tellerseparator (Durchsatz 30 L/h)

 1 x Homogenisator (Durchsatz 15 L/min)

 1 x Filterhalter für bis zu drei Filter

 1 x FPLC (1 x Säule mit 12 cm Durchmesser)

 3 x Lagertank

Zur Medienbereitung werden außerdem zwei weitere Puffertanks benötigt. Die Medien werden anschließend mit einem Autoklaven sterilisiert. Da dieser jedoch auch für andere Prozesse verwendet werden soll, werden basierend auf eigener Annahme die Beschaffungskosten nur zu 25 % berechnet [73].

Dimensionierung der Apparaturen:

Die Zentrifugationen verlaufen mit einer Durchflussrate von 22,5 L pro Stunde, die zweistufige Homogenisation hat einen Durchsatz von ca. 10 L pro Stunde. Da die Filter bei der Filtration in Reihe geschaltet werden und ein Durchgang ca. eine Stunde dauert, beläuft sich die gesamte Filtration auf eine Stunde. Für die Filtration wird nur ein Gehäuse benötigt und die Filter werden

(36)

liegt der Kostenfokus bei den Filtern auf den laufenden Kosten. Laut Informationen des Anbieters betragen die Anschaffungskosten für das Filterhalter 14.318 €. Bei Modellen mit geringerer Filterfläche wird für die Verwendung der Hybridfilter kein Gehäuse benötigt (s. Abbildung 15) [30].

Abbildung 15: Skalierung der 3M^® Hybridfilter [6]

Die FPLC beinhaltet neben den Anschaffungskosten auch laufende Kosten aufgrund des Säulenmaterials, das bei beiden Chromatographiedurchgängen verwendet wird. Die Chromatographie soll im Verlauf eines Arbeitstages von maximal zwei Arbeitskräften durchführbar werden. Das Säulenvolumen beträgt hierbei 2,5 L [5].

Bei Eingabe der oben genannten benötigten Apparaturparameter ergeben sich durch BioSolve- Recherche und durch eigene Daten folgende Apparaturkosten:

(37)

Tabelle 9: Apparaturkosten - FGF-2

Apparatur Kapazität Anschaffungskosten

Zentrifuge 30 L/h 80.000 € [74]

Homogenisator 10 L/h 18.500 € [74]

Filterhalter 3 Filter 14.318 € [30]

FPLC + Säule 2,5 L 158.000 € + 17.000 [74]

Lagertank 1 50 L 1.000 € [73]

Lagertank 2 50 L 1.000 € [73]

Puffertank 1 30 L 500 € [73]

Puffertank 2 70 L 1.400 € [73]

Puffertank 3 70 L 1.400 € [73]

Autoklav 130 L 3.375 € [73] (25 % von 13.500 €)

Die gesamten Equipmentkosten betragen 296.493 €, die über einen Zeitraum von 10 Jahren linear abgeschrieben werden. Ebenfalls miteinbezogen in die Berechnung werden Planungs- und Konstruktionskosten, sowie Startup-Kosten. Diese basieren auf den Apparaturkosten oder werden anhand von totalen Arbeitstagen berechnet. Da davon auszugehen ist, dass vor der Produktion eine Vorbereitungsphase benötigt wird, werden die standardmäßigen Kostenfaktoren der Software verwendet, da hierfür keine eigenen Daten verfügbar sind (s. Abbildung 16).

Abbildung 16: Zusatzkosten Zusammenstellung [5]

(38)

Es besteht die Möglichkeit die dazugehörigen Anlagekosten als Multiplikationsfaktoren der Gerätekosten in die Gesamtkosten miteinfließen zu lassen, diese sind jedoch von der Software angenommen und werden aufgrund der Überschaubarkeit vernachlässigt.

4.3.2 Materialien

Basierend auf den Prozessparametern wurden im SuperPro Designer-Prozess folgende Puffer skaliert:

 Aufschlusspuffer 64,01 L

 Chrom-Puffer-A 54,86L

 Chrom-Puffer-B 24,93 L

 20 % Ethanol 7,48 L

Die Medienkosten, die während des Upstream-Processings entstehen, werden für die Evaluierung vernachlässigt da bei dieser Evaluierung lediglich die Kosten des Downstream- Processings berücksichtigt werden. Die Preise der einzelnen Medienbestandteile sind zwar zugänglich, jedoch sind die Preise der Anbieter im Labormaßstab nicht direkt proportional zu Preisen im größeren Maßstab. Aus diesem Grund werden die einzelnen Medien- oder Apparaturpreise aus der BioSolve-Datenbank entnommen und verwendet. Es ist anzumerken, dass sich die pH-Werte des Aufschlusspuffers und des Chrom.-Puffers A unterscheiden, da ansonsten beide Puffer im selben Tank zur Verfügung gestellt werden könnten. Die unterschiedlichen pH-Wert Regulierungen werden aufgrund schwankender Mischverhältnisse vernachlässigt und insofern berücksichtigt, dass ausschließlich das teurere Mischmedium Tris- HCl (163 €/kg) anstelle von Tris-Base (130 €/kg) verwendet wurde [74].

Aufschlusspuffer

RO-Wasser mit 50 mM Tris-HCl und 100 mM NaCl Kosten der einzelnen Bestandteile:

Tabelle 10: Kosten Aufschlusspuffer - FGF-2 Bestandteil Kosten pro kg

bzw. L Konzentration Kosten/L Puffer

Tris-HCl 163 €/kg [74] 50 mM 1,28 €

NaCl 6,12 €/kg [74] 100 mM 0,04 €

RO-Wasser 1,11 €/L [74] - 1,11 €

(39)

Bezogen auf einen Liter Puffer betragen die Medienkosten 2,43 €/L.

Bezogen auf 64,01 L betragen die gesamten Pufferkosten 155,54 €/Batch.

Chrom-Puffer-A

RO-Wasser mit 50 mM Tris-HCl und 100 mM NaCl

Die Kosten der einzelnen Bestandteile sind identisch mit jenen aus Tabelle 10.

Chrom-Puffer-B

RO-Wasser mit 50 mM Tris-HCl und 1 M NaCl Kosten der einzelnen Bestandteile:

Tabelle 11: Kosten Chrom.-Puffer-B - FGF-2 Bestandteil Kosten pro kg

bzw. L Konzentration Kosten/L Puffer

Tris-HCl 163 €/kg [74] 50 mM 1,28 €

NaCl 6,12 €/kg [74] 1 M 0,35 €

RO-Wasser 1,11 €/L [74] - 1,11 €

Die Kosten für ein Liter 20 % Ethanol betragen 4,27 €/L [74].

Bezogen auf 7,48 L betragen die Batchkosten für 20 % Ethanol 31,94 €.

Zum Reinigen werden ca. 100 L RO-Wasser verwendet, welche bei einem Preis von 1,11 €/L insgesamt ca. 111 € pro Batch kosten.

Addiert man die einzelnen Materialkosten zusammen, ergibt dies laufende Materialkosten in Höhe von 500 € pro Batch.