Lokalisation von ComEA

Zur Lokalisation von ComEA in Acinetobacter sp. ADP239 pKD12 wurden Immunoblots mit Anti-ComEA-Antiserum und verschiedenen Zellfraktionen durchgeführt.

Es sollte die subzelluläre Lokalisation von ComEA geprüft werden, wodurch sich möglicherweise Hinweise auf eine Funktion bei der DNA-Aufnahme ergeben. Da ComEA Ähnlichkeiten zu DNA-bindenden Proteinen aufweist, könnte dieser Kompetenzfaktor an der Bindung der DNA auf der Zelloberfläche beteiligt wein. Ein weiteres in BD413 gut untersuchtes Kompetenzprotein ist das Pilin-ähnliche Protein ComP, dessen Defekt die

Bindung der DNA auf der Zelloberfläche inhibiert (PORSTENDÖRFER et al. 1997). Dies läßt vermuten, daß ComP an der Exposition von ComEA beteiligt ist. Das Fehlen von ComP könnte somit zu einer veränderten Lokalisation von ComEA führen. Aus diesem Grund wurde die Lokalisation von ComEA in der comP-Mutante T206 im Vergleich zu ADP239 pKD12 untersucht. Hierfür wurde das Plasmid pKD12 konjugativ in Acinetobacter sp.

T206 transferiert.

Die Isolierung von Proteinextrakten verschiedener Zellfraktionen erfolgte entsprechend der in „Material und Methoden“ dargestellten Weise. Die Zellen wurden über Nacht in 250 ml Succinat-Mineralmedium angezogen, geerntet und in einem Volumen von 20 ml mittels FRENCH-Pressen aufgeschlossen. Dieser Ansatz stellte das Gesamt-Zelllysat dar. Anschließend wurde die lösliche cytoplasmatische Fraktion von den Zellmembranen durch Zentrifugation getrennt. Die Zellmembranen wurden schließlich über einen Saccharosegradienten in innere und äußere Membran getrennt und in 0,5 ml Volumen resuspendiert. Die obere weißliche Bande stellte die äußere Membran dar und die in der Mitte des Saccarosegradienten gelblich erscheinende Bande die Cytoplasmamembran. Die Reinheit der äußeren Membran wurde über die Bestimmung der Aktivität der in der Cytoplasmamembran lokalisierten NADH-Dehydrogenase bestimmt. Verglichen zur inneren Membran war in der äußeren Membran eine NADH-Dehydrogenase-Aktivität von 10-15% zu messen, was für die Interpretation hinsichtlich der Lokalisation von ComEA berücksichtigt werden muß.

Das Gesamt-Zelllysat und die cytoplasmatische Fraktion, die jeweils ein Volumen von 20 ml ausmachten, wiesen Proteinkonzentrationen von 1,3 mg/ml bzw. 1,1 mg/ml auf.

Die Differenz der Proteinkonzentrationen von Gesamt-Zelllysat und Cytoplasma ergibt die Proteinkonzentration der Zellmembranen, die somit bezogen auf 20 ml Volumen 0,2 mg/ml betragen muß. Eingeengt auf 1 ml Volumen ergibt dies den theoretischen Wert von 4 mg/ml. Die jeweils in 0,5 ml resuspendierten cytoplasmatischen und äußeren Zellmembranen wiesen beide eine Proteinkonzentration von ca. 1,0 mg/ml auf (insgesamt 1 ml mit 1,0 mg/ml). Die Ausbeute der gereinigten und getrennten Zellmembranen betrug daher 25%. Da die Proteinkonzentration der Membranen in elektrophoretischer Auftrennung und Immunoblot für eine Auftragung äquivalenter Volumina von Cytoplasma und Membranfraktion zu gering war, wurden jeweils 10 mg Protein eingesetzt. Die Relation zwischen innerer und äußerer Membran blieb bestehen, da beide Fraktionen die gleiche Proteinkonzentration aufwiesen.

Die Auftrennung der Proben in einer 15%igen PAGE und nachfolgender Silberfärbung des Gels ließ erkennen, daß das Gesamt-Zelllysat und die Cytoplasmafraktion ein ähnliches Bandenmuster aufweisen (Abb. 3.16). Dies war dadurch zu begründen, daß die Zellen zu ca. 85% aus löslichen Proteinen aufgebaut sind (vgl.

Proteinbestimmung). Die äußeren und inneren Membranen zeigten dagegen ein

unterschiedliches Proteinmuster: Während in der Cytoplasmamembran zwei Proteine dominieren, die molekulare Massen von ca. 41 kDa und ca. 75 kDa aufweisen, zeigte die äußere Membran eine homogene Proteinverteilung unterschiedlicher molekularen Massen.

Auffällig war die gräulich erscheinende diffuse Bande, die unterhalb der Höhe des 10 kDa-Markerprotein in der äußeren Membran-Fraktion angefärbt wurde (Abb. 3.16). Da Zuckerreste in der Silberfärbung oft eine graue Färbung annehmen, könnte diese Bande die Polysaccharide darstellen, die sich auf der Oberfläche von Zellen finden.

50 40 30 20 70 (kDa)

1

St 2 3

10

4 1 2 3 4 St St 1 2 3 4

Abb. 3.16: Elektrophoretische Auftrennung der Zellkompartimente. Die Zellen wurden in Succinat-Mineralmedium angezogen, geerntet und mittels FRENCH -Pressen aufgeschlossen. Gleiche Proteinmengen (10 mg) des Gesamt-Zelllysats (Spur 1), Cytoplasmas (Spur 2) sowie der äußeren (Spur 3) und inneren (Spur 4) Membran wurden in einer 15%igen SDS-PAGE aufgetrennt und mit Silbernitrat gefärbt. Das Gel (A) stellt die comEA-Mutante T100 dar; in Gel (B) ist ADP239 pKD12 und in (C) T206 pKD12 aufgetragen.

A B C

Aufgrund des optimaleren Vergleichs der Bandenmuster wurden für den Immunoblot die gleichen Zellkompartimente der drei Stämme (T100, ADP239 pKD12, T206 pKD12) nebeneinander aufgetragen. Nach der Detektion des WESTERN Blots mit Anti-ComEA-Antiserum konnte ein Protein markiert werden, welches an der unteren Lauffront der Gelelektrophorese bei ca. 7-8 kDa aufgetrennt worden war und in der comEA-Mutante T100 fehlte (Abb. 3.17). Darüber hinaus lieferte die Markierung mit den Antikörpern weitere Singnale, die jedoch ebenso in der comEA-Mutante erschienen und somit als unspezifische Kreuzreaktionen identifizierbar waren. Das spezifische ComEA-Signal war im Gesamt-Zelllysat der Stämme ADP239 pKD12 und T206 pKD12 in vergleichbarer Intensität, in der cytoplasmatischen Fraktion dagegen nur sehr schwach zu erkennen. Diese beiden Stämme zeigten weiterhin eine ähnliche Verteilung von ComEA in den Zellmembranen (Abb. 3.17). Neben einem ComEA-Signal schwacher Intensität in der

cytoplasmatischen Membran zeigte sich eine relativ starke Intensität in der äußeren Membran. Die Doppelbanden des Blots sind auf die schlechte elektrophoretische Auftrennung zurückzuführen, da der Lipidgehalt durch die Auftragung von 10 mg Protein sehr hoch gewesen war und die Auftrennung im unteren Bereich des Gels störte. (Wurde weniger Protein aufgetragen so ließ sich ComEA nicht detektieren.)

A B C A B C A B C A B C

Abb. 3.17: Detektion von ComEA in Zellkompartimenten. Die Zellen der comEA-Mutante T100 (A), von ADP239 pKD12 (B) und T206 pKD12 (C) wurden in Succinat-Mineralmedium angezogen, geerntet und mittels FRENCH-Pressen aufgeschlossen.

Daraufhin erfolgte eine Fraktionierung der Zellen in Cytoplasma sowie äußere und innere Membran. Proben dieser Fraktionen wurden in einer 15%igen SDS-PAGE aufgetrennt und der WESTERN Blot mit Anti-ComEA-Antiserum behandelt.

Diese Untersuchungen zeigten, daß nach der Expression von comEA durch den comP-Promotor ComEA in den Zellkomparimenten detektiert werden konnte. Der höchste Gehalt diese Proteins war in der äußeren Membran zu verzeichnen gewesen, in geringerer Konzentration in der inneren Membran- und Cytoplasma-Fraktion. Der Defekt in der Synthese des Typ-IV-Pilin-ähnlichen Kompetenzproteins ComP führte zu keiner veränderten Lokalisation von ComEA.