Generierung einer Doppelmutante mit Defekten in den Untereinheiten der dicken und dünnen Pili

Die alleinige morphologische Betrachtung von filamentösen Strukturen auf der Zelloberfläche läßt eine eindeutige Unterscheidung und Klassifizierung in Pilustypen nicht zu. Zum einen können Filamente gleicher Morphologie ebenso zu unterschiedlichen Pilustypen gehören oder andererseits homologe Strukturproteine Filamente unterschiedlichen Durchmessers bilden.

Acinetobacter sp. BD413 besitzt zwei elektronenmikroskopisch unterscheidbare Pilusstrukturen von 2-3 nm und 6 nm im Durchmesser, die auf genetischer und

molekularer Ebene nicht untersucht sind. Diese Filamente liegen in hoher Zahl vor, sind peritrich angeordnet und zum Teil zu Bündel aggregiert (PORSTENDÖRFER et al. 1997, 2000). Ein dritter Filamenttyp, der möglicherweise nur in geringer Zahl vorliegt und einen Durchmesser von 2-6 nm aufweist, könnte auf der Zelloberfläche übersehen werden. Um beweisen zu können, daß das Bakterium tatsächlich nur zwei Pilustypen synthetisiert, mußten die beiden Pilusgene unterbrochen werden. Sind danach noch Pili sichtbar, so gibt es möglicherweise einen dritten Typ, der an der Transformation beteiligt sein könnte.

Während für die Unterbrechung der Pilusgene mit dem 1,2 kb großen nptII-Marker flankierende chromosomale DNA von ca. 450 bp bzw. 230 bp ausreichten, wurde für die Unterbrechung des dicken Pilusgen mit der 2,0 kp Streptomycin-Kassette W zum einen ein größerer Bereich flankierender DNA (510 bp bzw. 450 bp) amplifiziert und zum anderen das betreffende Strukturgen um 830 bp deletiert. Die Primer DiDel-1-EcoRI (5`-GTAGAATATTCAGAATTCTGAAAAATGATA-3`) und DiDel-2-XbaI (5`-CCAA AGCCAATCTAGAGAATATTTTCATTC-3`) bzw. DiDel-3-XbaI (5`-AAATGTAG GTAACTCTAGATTACCATTAG-3`) und DiDel-4-EcoRI (5`-CGTACAATTCCTC GGAATTCTTCCTCTATG-3`) amplifizierten an der BD413-DNA die Bereiche, die stromaufwärts bzw. stromabwärts des dicken Pilusgen lagen. Diese beiden PCR-Produkte wurden mit EcoRI/XbaI jeweils in pUC18 kloniert (resultierende Plasmide pUK12 bzw.

pUK13, Abb. 3.31). In das pUC18-Derivat pUK12, welches den stromaufwärts liegenden Bereich enthielt, wurde daraufhin die mit EcoRV und HincII geschnittene Streptomycin-Kassette aus pBS01 in die HincII-Schnittstelle (MCS) gesetzt, wonach pUK29 resultierte (Abb. 3.31). Dies führte dazu, daß das klonierte PCR-Produkt an seinem 3´-Ende von dem Streptomycin-Marker begrenzt wurde; nun mußte das zweite PCR-Produkt, welches kloniert in pUK13 vorlag, den Streptomycin-Marker zur anderen Seite begrenzen. Dies erfolgte, indem die Streptomycin-Kassette zusammen mit dem klonierten PCR-Produkt aus pUK29 durch den Restriktionsverdau mit EcoRI und PstI herausgeschnitten, mit Klenow-Fragment die überhängenden Enden aufgefüllt wurden und das DNA-Klenow-Fragment mit stumpfen DNA-Enden in die HincII-Schnittstelle (MCS) von pUK13 ligiert wurde. Daraus resultierte das Plasmid pUK30 (Abb. 3.31).

Zur Transformation von Acinetobacter sp. N100, welcher bereits das durch den nptII-Marker unterbrochene Strukturgen der Untereinheit des dünnen Pilus trug, konnte die Streptomycin-Kassette mit flankierender DNA durch einen Verdau mit EcoRI und PstI von Vektor-DNA befreit werden.

lacZ pUC18

300 bp

Abb. 3.31: Plasmidkonstruktionen für die Unterbrechung des Pilusgen filA der Untereinheit des dicken Pilus mit einem Streptomycinresistenz-Marker. Die PCR-Produkte von DNA-Bereichen stromauf- (A) und stromabwärts (B) des Gens, welches für die Untereinheit des dicken Pilus codiert, wurden jeweils in die Schnittstellen EcoRI und XbaI von pUC18 kloniert, woraus pUK12 bzw. pUK13 resultierten. In die HincII-Schnittstelle von pUK12 wurde die Streptomycin-Kassette ligiert und daraufhin in das entstandene Plasmid pUK29 das Insert (B) aus pUK13 in richtiger Orientierung gesetzt. Daraus resultierte pUK30, in dem die DNA-Bereiche stromauf- und stromabwärts des Gens der Untereinheit des dicken Pilus durch das Resistenzgen unterbrochen sind. Die Pfeile markieren die Leserichtung des Pilusgens. Die in Klammern dargestellten Namen der Restriktionsschnittstellen können aufgrund der Ligationen mit glatten DNA-Enden nicht mehr geschnitten werden. Der Streptomycin-Marker ist nicht maßstabsgetreu wiedergegeben. Das lacZ-Gen von pUC18 gibt die Leserichtung des vektoreigenen Promotors an.

Xba

Nach der Transformation des Inserts aus pUK30 in die Mutante N100, die bereits eine nptII-Insertion im Gen trägt, welches für die Untereinheit des dünnen Pilus codiert, lag im Chromosom der daraus resultierenden Mutante KN100 zusätzlich eine Deletion des Strukturgens, welches für die Untereinheit des dicken Pilusgen codiert, mit dem Streptomycin-Marker W vor.

Die Überprüfung der neu eingefügten Mutation durch den Streptomycin-Marker erfolgte mittels SOUTHERN-Blot. Dafür wurde die isolierte chromosomale DNA des

Stammes KN100 zum einen mit EcoRI und zum anderen mit EcoRI und SacI verdaut, im Agarosegel aufgetrennt, geblottet und gegen eine Streptomycin-Sonde detektiert. Durch die Hybridisierung wurde ein 3,6 kb-Fragment markiert, welches der EcoRI/SacI-Restriktionsverdau lieferte (Abb. 3.32). In der chromosomalen DNA des Wildtyps ADP239 lagen diese beiden Schnittstellen 2,45 kb auseinander; unter Berücksichtigung der 0,83 kb-Deletion des dicken Pilusgen und nach der Unterbrechung mit der 2,0 kb Streptomycin-Kassette ergaben sich die detektierten 3,6 kb. Die relevanten EcoRI-Schnittstellen schlossen im Wildtyp BD413-Chromosom 4,56 kb ein. Nach der homologen Rekombination des Konstruktes, bei dem das dicke Pilusgen durch den Streptomycin-Marker ersetzt worden war, rückten die EcoRI-Schnittstellen um weitere 1,17 bp auseinander, so daß auf dem SOUTHERN Blot eine Bande von 5,7 kb detektiert wurde (Abb.

3.32, Spur 2).

10,0 8,0 6,0 5,0 4,0 3,5 3,0

5,7 kb

3,6 kb

Abb. 3.32: SOUTHERN Blot der Pilusdoppelmutante KN100. Die chromosomale DNA von Acinetobacter KN100 wurde mit EcoRI/SacI (Spur 1) und EcoRI (Spur 2) geschnitten. Nach der Auftrennung in einem 0,8%igen Agarosegel und dem Blotten erfolgte die Hybridisierung gegen einer Streptomycin-Sonde. Links ist das Ethidiumbromid-gefärbte Gel und rechts der Blot dargestellt.

1 2

1 2 St

(kb)

Die Detektion der Streptomycin-Kassette in restriktionsverdauter chromosomaler DNA nach der Auftrennung im Agarose-Gel auf derjenigen Laufhöhe, die mit der theoretisch ermittelten DNA-Fragmentlänge übereinstimmte bestätigte die richtige homologe Rekombination ins Zielgen.

3.6.5 Untersuchung der Zelloberfläche nach Unterbrechung der