Chromatographische Methoden

An die Solubilisierung der Membran schlossen sich flüssigkeitschromatographische Schritte an, die mittels einer Gradifrac-Einheit (Pharmacia Biotech Europe GmbH, Freiburg) durchgeführt wurden und aus folgenden Komponenten bestand: Kontroller und Fraktionssammler Gradifrac; Pumpe P50; Probenauftragsventil V 7; UV-Monitor Uvicord SII mit Durchflußzelle und angeschlossenem 2-Kanal-Schreiber REC 102;

Leitfähigkeitsmeßgerät mit Durchflußzelle, Mischzelle (1,6 ml) und zwei Magnetventile PSV 50, von denen eines zum Aufbau des Salzgradienten und das andere zur Umschaltung zwischen Fraktionssammler und Abfallgefäß diente. Zum Auftragen größerer Volumina wurde des weiteren eine Pumpe Typ P1 benutzt.

Das Gradifrac-System war programmierbar, so daß die Elution und Fraktionierung unter Aufzeichnung des Protein- und Salzgehaltes automatisch ablief. Sämtliche benutzte Puffer wurden durch Filtration durch eine in einen Glasfilterhalter mit Fritte eingespannte Cellulose-Acetat-Membran (Porendurchmesser: 40 µm) von Partikeln befreit. Die Entgasung durch das Anlegen eines Vakuums oder durch das Autoklavieren der Lösungen

sollte die spätere Bildung von Luftblasen in der Säule vermeiden. Die Durchführung der Chromatographie bei 4^oC verlangsamte die proteolytischen Prozesse.

2.13.5.1 Anionenaustausch-Chromatographie an Q-Sepharose

Für die Anionenaustausch-Chromatographie wurde das Gelmaterial Q-Sepharose in Verbindung mit einer XK 50/20-Säule (beides Fa. Phamacia Biotech Europe GMBH, Freiburg) genutzt. Die Trennung beruht darauf, daß Moleküle mit negativen Ladungen - wie beispielsweise Proteine oder Cl^--Ionen – an die Matrix binden. Dabei konkurrieren verschiedene Anionen um die Bindungsstellen mit unterschiedlichen Affinitäten. So können an das Material gebundene Proteine durch einen NaCl-Gradienten in der Reihenfolge ihrer Bindungsstärke verdrängt und nacheinander eluiert werden. Da die Nettoladung der Proteine pH-abhängig ist, erfolgt die Bindung an den Anionenaustauscher erst bei pH-Werten oberhalb des isoelektrischen Punktes des jeweiligen Proteins. Die Bindung kann demnach durch eine weitere Erhöhung des pH-Wertes verstärkt werden.

Die benötigte Menge Gelmaterial wurde nacheinander mit 500 ml 0,5 M HCl und 0,5 M NaOH auf einer 1 l-Fritte gewaschen, mit 500 ml einer 3 M NaCl-Lösung abgesättigt, mit der gleichen Menge 30 mM Tris-HCl (pH 7,5) äquilibriert und resuspendiert.

Zur Eichung des Gradifrac-Systems wurde anstelle der Säule eine Schlauchverbindung zwischen Ventil und UV-Meßgerät eingesetzt. Die Kalibrierung der Induktionsmeßzelle erfolgte durch Pumpen von Hochsalz-Elutionspuffer (30 mM Tris-HCl, 1,5 M NaCl, pH 7,5; evtl. Detergenz oberhalb der Mizellenkonzentration) und Betätigung der 100%

Taste und danach durch Spülen mit dem salzfreien Äquilibrierungspuffer (30 mM Tris-HCl, pH 7,5, evtl. Detergenz) und Betätigung der 0% Taste. Es folgt die Eichung des Uvicord SII durch Einstellen eines 10%-Wertes für den Proteingehalt am Schreiber. Die Empfindlichkeit des Proteinmeßgerätes wurde schrittweise erhöht und die Änderung des Schreiberausschlags am Nullpunkt-Justierknopf jedesmal ausgeglichen. Dieses bewirkte, daß die Grundlinie in allen Empfinlichkeitsstufen identisch war und während der Elution ohne Verlust der Grundlinieneinstellung auf den Proteingehalt abgestimmt werden konnte.

Anschließend konnte der untere Adapter der Säule angeschlossen und mit dieser befestigt werden. Nach dem Einfüllen des Sepharose Q-Materials und dem Anbringen des oberen Adapters ließ sich das Material mit Äquilibrierungspuffer bei einer Durchflußrate von 2,5 ml/min packen. Bei konstanter Sedimentationshöhe und einem Salzgehalt von unter 1%

konnte der Stempel des oberen Adapters positioniert und die Säule in Betrieb genommen werden.

Nach dem Auftragen des Membransolubilisat (2.13.4) mit 1 ml/min wurde solange mit 30 mM Tris-HCl (pH 7,5) gespült, bis alle nichtgebundenen Stoffe entfernt worden waren (mindestens 4 Gelvolumina, Durchflußrate 2 ml/min). Danach erfolgte die

stufenweise Elution mit 2 ml/min mittels ansteigender NaCl-Konzentrationen, wobei die Elutionsvolumina jeder Stufe 4 Gelvolumina betrugen. Die Fraktionsvolumina betrugen ca.

15-30% des Matrixvolumens.

Einen Überblick über die Proteingehalte ergab die Messung der Extinktion bei 280 nm in der Durchflußzelle des Uvicord SII, die per Schreiberaufzeichnung dokumentiert wurde;

ebenso wurden die Salzkonzentration und die Fraktionsgröße festgehalten.

Die Regeneration des Anionenaustausch-Materials erfolgte wie oben beschrieben und die Lagerung bei 4^oC in 20% (v/v) Ethanol.

2.13.5.2 Gelfiltration mit Sephadex S-300

Das Prinzip der Gelfiltration beruht auf der unterschiedlichen Verweildauer von Proteinen verschiedener Größe in einem porösen Gelmaterial. Bei dem hier verwendeten Gel befinden sich all diejenigen Proteine im Ausschlußvolumen, die größer als 1500 kDa sind. Kleinere Partikel verweilen mit abnehmender Größe zunehmend länger in den Poren und werden dementsprechend später eluiert. Der Trennbereich von Sephacryl S-300 HR (Fa. Phamacia Biotech Europe GMBH, Freiburg) erstreckte sich von 10 kDa bis 1500 kDa.

Um Aggregationen während der Elution zu vermeiden, wurde dem Gelfiltrationpuffer 2 mM Dodecylmaltosid zugegeben.

Die Gelfiltration kann bei globulären Proteinen zur Bestimmung der molekularen Masse herangezogen werden. Dazu wurde die Säule zunächst geeicht, indem eine Beziehung zwischen Retardationsvolumen und molekularer Masse hergestellt wurde. 0,5 ml folgender Eichproteine (4 mg/ml) passierten nacheinender die Säule: Ferritin (450 kDa), Katalase (240 kDa), Aldolase (158 kDa) und Albumin (45 kDa). Um Wechselwirkungen mit der Gelmatrix und Aggregationen der zu untersuchenden gelösten Membranproteinen zu verhindern, wrde dem Gelfiltrationspuffer 100 mM NaCl und 2 mM Dodecylmaltosid (Endkonzentration) zuzusetzt.

Die fertig gepackte Säule wurde luftblasenfrei an das Gradifrac-System angeschlossen und bei 0,5 ml/min mit 200 ml Gelfiltrationspuffer gewaschen. Nun konnte die Eichung des Nullwertes des UV-Meßgerätes für die Proteindetektion erfolgen (2.13.5.1). Die Flußrate wurde daraufhin auf 0,3 ml/min heruntergeregelt und mittels der Auftragspumpe die Probe aufgetragen.

Zur Reinigung des Säulenmaterials wurden in entgegengesetzter Laufrichtung jeweils 50 ml 2 M NaCl, 0,5 M NaOH, 10 mM HCl und zur Konservierung abschließend 20% (v/v) Ethanol durch die Säule gepumpt.

Gelfiltrationpuffer

Tris-HCl 30 mM

MgCl2 5 mM

NaCl 100 mM

6-Aminocapronsäure 5 mM

Dodecylmaltosid 2 mM

pH 7,5

2 . 1 4 R e i n i g u n g h u m a n e r Erythrocyten mittels Dichtegradientenzentrifugation (LeucoSep Kit)

Die Aufreinigung der humanen Erythrocyten wurde freundlicherweise von Frau Dr.

Vehmeyer (Universitätsklinikum, Göttingen; Hämotologie) vorgenommen und die gereinigten Erythrozyten zur Verfügung gestellt.

Die Vorgehensweise der Isolierung der Roten Blutkörperchen wurde nach Anleitung des LeucoSep Kits vorgenommen. Das LeucoSep Kit besteht aus einem Röhrchen mit Filterscheibe und einer Ficoll-Trennlösung. 15 ml Ficoll-Trennlösung wurden zunächst auf die Filterscheibe des Leicosep-Röhrchens gegeben und dann zentrifugiert (1 min, 400 x g, 4°C), so daß sich das Ficoll unterhalb der Filterscheibe befand. Anschließend wurden 20 ml Blut (mit Gerinungshemmer: Hanks/EDTA) auf die Filterscheibe gegeben. Durch erneute Zentrifugation (10 min, 1000 x g, 4°C) reicherten sich die Erythrocyten und die Granulozyten unterhalb der Filterscheibe an, während sich darüber ein Ring aus PBMC (Peripheral blood mononuclear cells) bildete. Für die weitere Reinigung der Erythrocyten wurde die Filterscheibe vorsichtig durchstoßen und die darunter befindliche Lösung in ein leeres 50 ml Röhrchen gegossen, mit Hanks-Lösung auf 50 ml aufgefüllt und zentrifugiert (15 min, 400 x g, 4°C), so daß die Roten Blutkörperchen sedimentierten. Der Überstand wurde verworfen.