Für Proteine, die an der Prozessierung arretierter Replikationsgabeln beteiligt sind, konnte gezeigt werden, dass sie nicht nur kernlokalisiert sind, sondern auch in diskre-ten Foci, die mit DNA-Schädigung einhergehen, zu finden sind (z. B. Lisby et al. 2003).
Lokalisiert Mph1 auch in diskreten Foci, die der Replikationsgabel entsprechen?
Eine Kernlokalisation von Mph1-GFP konnte bereits gezeigt werden (Scheller et al.
2000 und Abbildung 30, rechts), wobei das MPH1-GFP-Konstrukt unter der Kontrolle
ERGEBNISSE
eines Galaktose-induzierbaren Promotors stand und die Experimente unter induzierten Bedingungen durchgeführt wurden. Eine mögliche subnukleäre Lokali-sation könnte unter diesen Bedingungen (Überproduktion des Gens) überdeckt worden sein.
Die Lokalisation von Mph1-GFP wurde hier erneut unter der Kontrolle des MPH1-Promotors untersucht. Dazu wurden mph1-Zellen mit pRS313-Mph1-GFP ( vgl. S. 26) transformiert, in Selektivmedium angezogen und ohne Fixierung der Zellen mikro-skopisch untersucht. Die GFP-Fluoreszenz von Mph1-GFP konnte auch unter diesen Bedingungen, wenn auch deutlich schwächer und nicht in allen Zellen, detektiert werden (Abbildung 30, links). In Abbildung 30 rechts ist die Lokalisation von Mph1-GFP unter der Kontrolle des Galaktose-induzierbaren Promotors (bei induzierten Bedingungen), wie in Scheller et al. 2000 gezeigt, reproduziert. Die GFP-Fluoreszens ist deutlich auf einen abgegrenzten Bereich in der Zelle eingeschränkt und sollte mit dem Kern korrespondieren (vgl. Scheller et al. 2000). Eine Färbung des Kernes mit DAPI erfolgte nicht, da bei der Fixierung der Zellen entstehende Artefakte vermieden werden sollten.
Abbildung 30: Lokalisation von Mph1. mph1-Zellen wurden mit pRS313 Mph1-GFP (links, vgl. S. 26) oder pYES2 Mph1-sen-GFP-his6 (rechts, vgl. S. 26) transformiert und auf die Lokalisation des Mph1-GFP-Konstuktes fluoreszenzmikroskopisch untersucht.
Für Rad52 wurde gezeigt, dass in unbehandelten Zellen vereinzelt Foci beobacht-bar sind, die nach IR-Behandlung in deutlich größerer Zahl in der S-Phase auftraten (Lisby et al. 2001, Lisby et al. 2003). Um eine mögliche Lokalisation von Mph1 in Foci zu untersuchen, wurden mph1-Zellen mit dem pRS313 MPH1-GFP-Konstrukt, und zum Vergleich, Zellen mit einem chromosomalen Rad52-YFP-Konstrukt (W3749-14C; Lisby et al. 2003) mit α-Faktor (in SC Medium angezogen) in G1 arretiert und auf die GFP- bzw. YFP-Fluoreszenz hin untersucht. In Abbildung 31 links sind die Zellen mit dem RAD52-YFP-Konstrukt gezeigt. In vielen Zellen ist eine stärkere Fluoreszenz, die dem Kern entsprechen sollte, erkennbar. In vereinzelten Zellen ist innerhalb dieses Bereiches ein stärker leuchtender Punkt erkennbar, der einem Rad52-Fokus an einem spontan aufgetretenen DNA-Schaden (Doppelstrangbruch) entsprechen sollte (Lisby et al. 2003). Bei den unter den gleichen Bedingungen (α-Faktor-Arrest, in SC-his Medium angezogen) untersuchten mph1-Zellen konnte in ca. 60 % der Zellen die Kernlokali-sation detektiert werden. Wie bei Rad52 war in einzelnen Zellen eine stärkere, punk-tierte GFP-Fluoreszenz detektierbar (Abbildung 31, Mitte). Vergrößerungen solcher Zellen (Abbildung 31, rechts) sollen dies nochmals verdeutlichen. Anscheinend
loka-ERGEBNISSE
lisiert Mph1-GFP nicht nur diffus im Kern, sondern ist partiell auch in Foci detektierbar.
Ob es sich hierbei auch um eine Kolokalisation mit DNA handelt, kann derzeit nicht sichergestellt werden. Es schlossen sich weitere Untersuchungen mit log-Phase-, G1-Phase- und S-G1-Phase-Zellen, die ohne und mit DNA-schädigenden Agenzien inkubiert wurden, an (15 minütige Inkubation mit den DNA-schädigenden Agenzien entweder direkt im α-Faktor-Arrest für G1 oder 45 min nach dem Release für die S-Phase; 4-NQO:
1 µg/ml, Stammlösung: 2.5 mg/ml in Ethanol; HU: 200 mM, Stammlösung 2 M in Wasser). Auch hier war neben der diffusen Kernfärbung in einigen Zellen eine als Fokus deutbare verstärkte GFP-Fluoreszenz sichtbar (nicht gezeigt), wobei zum jetzigen Zeitpunkt qualitativ keine Aussage gemacht werden kann, ob sich die Häufig-keit oder auch die Intensität der Foci unter den verschiedenen Bedingungen ändert.
Abbildung 31: Lokalisation von Rad52 und Mph1. Links: W3749-14C (MATa, ADE2, bar1::LEU2, trp1-1, LYS2, RAD52-YFP, RAD5; Lisby et al. 2003) wurde mit α-Faktor in G1 arretiert, um die Rad52-Lokalisation zu untersuchen. Da das GFP und das
YFP-Emissionspektrum überlappt, wurde die YFP-Fluoreszenz mit dem gleichen Filter wie für GFP (S. 34) untersucht. Mitte: α-Faktor arretierte mph1-Zellen wurden mit pRS313 Mph1-GFP transformiert und auf die Lokalisation des Mph1-GFP-Konstuktes fluoreszenzmikroskopisch untersucht. Rechts: Ausgewählte α-Faktor arretierte mph1-Zellen mit dem pRS313 Mph1-GFP-Konstrukt. Innerhalb eines stärker fluoreszierenden Bereiches in der Zelle (Kern) ist ein kleiner Bereich mit einer stärkeren GFP-Fluoreszenz (Fokus) erkennbar.
Die bisher erhaltenen Daten lassen die Frage aufkommen, ob Mph1 mit Rad52 kolokalisiert? Die Zellen mit dem chromosomalen Rad52-YFP-Konstrukt (W3749-14C) wurden mit pRS313 MPH1-GFP transformiert und wie oben beschrieben in G1 arretiert. Wegen technischer Schwierigkeiten mit dem vorhandenen Equipment konnte die Kolokalisation von Rad52 und Mph1 jedoch nicht untersucht werden. Da diese Experimente im Labor von Per Sunnerhagen, Universität Göteborg, Schweden durchgeführt wurden, konnten die Untersuchungen nicht fortgeführt werden.
Diese ersten Untersuchungen zur subnukleären Lokalisation von Mph1 deuten jedoch an, dass Mph1-GFP nicht nur diffus im Kern zu finden ist. In einzelnen Zellen sind diskrete Foci mit einer stärkeren GFP-Fluoreszenz, die mit Mph1 korrespondieren sollten, erkennbar. Für eine Vielzahl von Proteinen, die bei Replikation, Rekombination und im DNA damage checkpoint eine Rolle spielen, wurde diese Art von Lokalisation gezeigt. Oftmals konnten unterschiedliche Proteine in den gleichen Foci gefunden werden oder die Lokalisation des einen Proteins bedingte die Lokalisation des anderen. Für Mph1 bleibt die Frage offen, ob es sich bei den gezeigten Foci tatsächlich um Replikationsgabeln handelt (z. B. durch Kolokalisation
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mit PCNA) und/oder ob Mph1 mit Proteinen, für die eine Rolle bei der Wiederaufnahme von arretierten Replikationsgabel postuliert wurde und mit denen in dieser Arbeit eine genetische Interaktion gezeigt werden konnte, kolokalisiert. Erste Hinweise, auf eine Lokalisation von Mph1 in einem Komplex mit Proteinen, für die sowohl eine Rolle bei der Replikationsreinitiation diskutiert wird und auch eine genetische Interaktion mit mph1 hier gezeigt werden konnte, liegen vor (Gavin et al.
2002). Die Autoren haben Proteinkomplexe von Saccharomyces cerevisiae aufgereinigt und massenspektrometrisch die einzelnen Proteine identifiziert. Dabei konnte Mph1 zweimal, ausgehend von unterschiedlichen Ausgangsproteinen, mit zum Teil den gleichen Proteinen, detektiert werden. Zu diesen Proteinen zählen u. a. Msh2, Ddc2, Mec1, Rad52 und auch Sgs1 (Gavin et al. 2002).