MPH1 zeigt genetische Interaktionen mit einer Reihe von Genen, deren Produkte evolutionär konserviert sind. Bei einem Sequenzvergleich mit Mph1 wurden in Bakterien keine sequenzidentischen Proteine gefunden, wohl jedoch in Archaea und Eukaryoten (Abbildung 32). Dies deutet an, dass der Mechanismus, in den Mph1 involviert ist, nicht nur bei Saccharomyces cerevisiae sondern generell bei Eukaryoten (und Archaea) vorhanden ist.
Abbildung 32: Sequenzvergleich der deduzierten MPH1-Aminosäuresequenzen
verschiedener Organismen mit MPH1 von Saccharomyces cerevisiae (Quelle: W. Kramer). Die Sequenzen wurden verglichen mit dem Pileup Programm vom GCG package mit der Blossum62 Matrix. Der Sequenzvergleich wurde mit dem Boxshade Programm bearbeitet (http://www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html), um Identitäten (schwarz) und Ähnlichkeiten (grau) hervorzuheben. Hs: Homo sapiens, mm; Mus musculus, sc:
Saccharomyces cerevisiae, sp: Schizosaccharomyces pombe, at: Arabidopsis thaliana, afu:
Archaeglobus fulgidus, dm: Drosophila melanogaster.
ERGEBNISSE
P h ä n o t y p i s c h e C h a r a k t e r i s i e r u n g v o n s p m p h 1–- M u t a n t e n Sind diese putativen Sequenzhomologe auch Funktionshomologe von Mph1? Um dieser Frage nachzugehen, sollte das Homologe von Schizosaccharomyces pombe charakterisiert werden. Das betreffende Gen, dessen deduzierte Aminosäuresequenz zu 38 % identisch mit der von Mph1 ist, liegt auf Chromosom I (SPAC 9.05; im folgenden spmph1+ genannt) und ist 2605 bp lang. Es trägt wahrscheinlich ein Intron.
In einem ersten Ansatz sollte untersucht werden, ob die Mutante spmph1- die gleichen phänotypischen Eigenschaften aufweist, wie die Mutante der Bäckerhefe. Zuerst wurde das Gen einschließlich Promotor- und Terminatorbereiche kloniert (pGEMZf(-) spmph1+). Ausgehend von diesem Konstrukt wurde eine Deletionskassette konstruiert (pGEMZf(-) spmph1::kanMX4) und die Mutanten hergestellt (vgl. S. 28).
Saccharomyces cerevisiae mph1 Mutanten zeigen eine erhöhte Mutationsfrequenz und sind sensitiv gegenüber verschiedenen DNA schädigenden Agenzien. Auch die putativen spmph1--Mutanten von Schizosaccharomyces pombe sollten bzgl. dieser beiden Phänotypen charakterisiert werden. Die Untersuchung der Sensitivität gegenüber MMS und 4-NQO von spmph1-- und Wildtyp-Zellen erfolgte im Vergleich mit mph1 und Wildtyp-Zellen von Saccharomyces cerevisiae im Drop dilution assay. Die Zellen wurden in YE-Medium angezogen und auf YPD-Platten mit den DNA-schädigenden Agenzien getropft. Wie in Abbildung 33 zu sehen, sind die Schizosaccharomyces pombe spmph1- -Mutanten sensitiv gegenüber MMS und 4-NQO.
Der Wildtyp verhält sich bei der gegebenen Konzentration wie auf der YPD-Wachstumskontrolle, bei der auch die Mutanten normal wachsen. Es ist kein Unterschied zwischen den beiden Paarungstypen (h+, h-) feststellbar. Die Saccharomyces cerevisiae mph1 Mutanten zeigen die bekannte Sensitivität.
Abbildung 33: Sensitivität von Saccharomyces cerevisiae (sc) und Schizosaccharomyces pombe (sp) Wildtyp- und mph1-Mutanten gegenüber MMS und 4-NQO. Die jeweiligen Stämme wurden, wie in Material und Methoden beschrieben, auf YPD mit und ohne den Chemikalien (Konzentration unter der jeweiligen Platte angegebenen) getropft.
Ein Sequenzvergleich mit der deduzierten Aminosäuresequenz des CAN1-Genes aus Saccharomyces cerevisiae zeigte, dass es auch in Schizosaccharomyces pombe sehr wahrscheinlich ein Homologes zur Argininpermease gibt (56 % Identität). Daher sollte
ERGEBNISSE
das Canavaninvorwärtsmutationssytem auch geeignet sein, um die Mutationsfrequenz der spmph1--Mutanten zu bestimmen. Abbildung 34 zeigt, dass alle untersuchten Stämme auf der EMM-Kontrollplatte wachsen, jedoch auf EMM/CAN sind bei spmph1 -im Vergleich zum Wildtyp mehr canavaninresistente Kolonien sichtbar.
Abbildung 34: Mutationsfrequenz von Schizosaccharomyces pombe Wildtyp- und mph1-Zellen unter Verwendung des Canavaninvorwärtsmutationssystems. Die Stämme wurden in YE über Nacht angezogen, drei 1:10 Verdünnungen hergestellt und je 10 µl auf EMM und EMM/CAN (40mg/l) getröpfelt und bis zum Sichtbarwerden von Kolonien bei 30 °C inkubiert.
Diese ersten Daten der phänotypischen Charakterisierung der Mutanten des putativen MPH1-Homolgen aus der Spalthefe zeigen, dass spmph1--Mutanten einen ähnlichen Phänotyp wie Saccharomyces cerevisiae mph1-Mutanten besitzen. Das Sequenzhomologe von MPH1 scheint daher auch ein Funktionshomologes zu sein.
K o m p l e m e n t a t i o n
Die Hypothese, dass spmph1+ ein Funktionshomologes von scMPH1 ist, kann durch eine Interspezies Komplementation gestützt werden. Hierfür wurde das spmph1+-Gen in den Saccharomyces cerevisiae spezifischen Vektor pRS316 kloniert (pRS316 spmph1+, vgl. S. 28). Für die Untersuchung der Komplementation wurden Saccharomyces cerevisiae mph1-Zellen mit pRS316, pRS316 MPH1 (S. 26) und pRS316 spmph1+ transformiert. URA+-Transformanten wurden auf die Sensitivität gegenüber MMS und 4-NQO und den Mutatorphänotyp untersucht.
In Abbildung 35 ist die Komplementation der Sensitivität gezeigt. Die Zellen wurden in Selektivmedium (SC-ura) angezogen und sowohl auf YPD-Platten als auch auf Platten getropft. Da kein Unterschied zwischen den YPD- und SC-ura-Platten festgestellt werden konnte, ist es ausreichend, wenn die Zellen zum Plasmiderhalt in Selektivmedium angezogen werden. Die Sensitivität von mph1 (Abbildung 35, zweite Reihe) lässt sich erwartungsgemäß durch das Saccharomyces cerevisiae MPH1-Gen komplementieren (Abbildung 35, dritte Reihe). Durch das spmph1+ Gen lässt sich die mph1-Sensitivität jedoch nicht wieder aufheben (Abbildung 35, vierte Reihe).
ERGEBNISSE
Abbildung 35: Komplementation der Sensitivität von Saccharomyces cerevisiae Wildtyp und mph1-Mutanten gegenüber MMS und 4-NQO. Die jeweiligen Stämme wurden in SC-ura angezogen, auf 1 × 107 Zellen/ml eingestellt und je 10 µl von 1:10 Verdünnungen auf die YPD- und SC-ura-Platten ohne und mit den DNA schädigenden Agenzien in den angegebenen Konzentrationen getropft.
Die Komplementation des mph1-Mutatorphänotyps ist in Abbildung 36 gezeigt.
Wildtypzellen bilden nur vereinzelt canavaninresistente Kolonien (Abbildung 36, wt pRS316). Die Deletion von MPH1 ruft dagegen eine erhöhte Zahl von canavanin-resistenten Kolonien hervor (Abbildung 36, mph1 pRS316), die sich durch ein plasmidständiges MPH1-Gen (Abbildung 36, mph1 pRS316 MPH1) wieder aufheben lässt. Das Einbringen von spmph1+ in mph1-Mutanten hebt den Mutatorphänotyp partiell auf (Abbildung 36, mph1 pRS316 spmph1+).
Abbildung 36: Komplementation der Mutationsfrequenz von Saccharomyces cerevisiae Wildtyp- und mph1 –Zellen unter Verwendung des Canavaninvorwärtsmutationssystems.
Jeweils drei verschiedene Transformanten wurden in SC-ura angezogen, je 50 µl auf SC-ura-arg als Wachturmskontrolle und auf und SC-ura-arg/CAN-Platten getropft und bis zum Sichtbarwerden von Kolonien bei 30 °C inkubiert.
Obwohl bei der Komplementation mit dem spmph1+-Gen mehr canavaninresistente Kolonien auftreten, als bei der Komplementation mit dem MPH1-Gen aus Saccharomyces cerevisiae, ist die Kolonienzahl doch deutlich geringer als bei mit dem
ERGEBNISSE
Leervektor transformierten mph1-Mutanten. Dies weist darauf hin, dass das spmph1+ -Gen zumindest partiell den mph1-Phänotyp komplementieren kann, was die Vermutung eines Funktionshomologen Gens stark unterstützt. Dass die Komplementation nur partiell erfolgt, könnte daran liegen, dass das spmph1+-Gen ein Intron enthält, welches nur unzureichend gespleißt wird, da die Spleißsequenz nicht mit der für Saccharomyces cerevisiae bestimmten Spleißkonsensus-Sequenz (5’-splice site: GUAUGU, branchpoint: UACUAAC, 3’ splice site: YAG; Jones et al. 1992) übereinstimmt.
DISKUSSION