SCL27
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6.2 Einfluss von SCL14 auf as-1-vermittelte Expression
Der Einfluss von SCL14 auf die as-1-Element vermittelte Expression wurde zunächst in transient transfizierten Tabak BY-2-Protoplasten untersucht. In diesem System führte die Expression von SCL14 zu einer 3-4-fachen Steigerung der as-1-abhängigen Reportergenaktivität gegenüber der Basalaktivität (Abbildung 5.8). Es ist wahrscheinlich, dass diese gesteigerte Aktivität durch Interaktion von SCL14 mit endogenen TGA-Faktoren verursacht wurde. Eine direkte DNA-Bindung ist eher unwahrscheinlich, da Untersuchungen in Hefe gezeigt haben, dass SCL14 alleine nicht an das as-1-Element binden kann (Kapitel 5.1).
Die Co-Transfektion eines Fusionsgens aus der GAL4-Bindedomäne (BD) und SCL14 mit einem GUS-Reportergen unter Kontrolle des GAL4-Promotors führte hingegen nur zu einer 1,8-fachen Steigerung der Reportergenaktivität gegenüber der negativen Kontrolle (Abbildung 5.9). Dies deutet darauf hin, dass das Aktivierungspotential von SCL14 durch Interaktion mit weiteren Proteinen, u.a. mit TGA-Faktoren, die an die DNA binden, begünstigt wird, oder dass die BD-Fusion störend wirkt. Denkbar wäre auch, dass die positive Wirkung von SCL14 darauf beruht, dass SCL14 negativ-wirkende Faktoren vom as-1-Element weg rekrutiert und somit eine Aktivierung des as-1-Elements durch positiv-wirkende Faktoren ermöglicht. Aber eine direkte Aktivierung scheint wahrscheinlich, da sie auch in Hefe zu beobachten ist.
Die gemeinsame Expression von SCL14 und dem TGA2-orthologen Faktor TGA2.2 aus Tabak führte unter Verwendung des as-1::GUS-Reporters nicht zu einer Steigerung der Reportergenaktivität, sondern blieb auf dem Niveau der Hintergrundaktivität (Abbildung 5.8). Bei Erhöhung der TGA2.2-Menge könnte SCL14 von der DNA weg rekrutiert werden. Dies hätte eine geringe Aktivität des Reportergenkonstrukts as-1::GUS zur Folge. Gestützt wird diese Annahme durch Beobachtungen in Hefe. In einem mofizierten Einhybridsystem führte eine geringe Menge an TGA2 in Kombination mit SCL14 zu einem verstärkten Wachstum auf Selektivmedium, während eine Steigerung der TGA2-Menge zu geringerem Wachstum führte (SIEMSEN, 2002).
Die gemeinsame Expression von SCL14 und TGA1a aus Tabak führte zu einer ähnlichen Aktivitätssteigerung gegenüber der Hintergrundaktivität, wie sie in Zellen, die nur mit SCL14 transformiert worden waren, gemessen werden konnte (Abbildung 5.8). Im Gegensatz zur gemeinsamen Expression von TGA2 und SCL14, wurde SCL14 hier nicht von der DNA weg rekrutiert. Die Steigerung der Aktivität beruht wahrscheinlich auf einem additiven Effekt.
Der positive Einfluss von SCL14 auf das as-1-Element konnte in planta sowohl auf RNA-Ebene als auch auf Proteinebene mit stabil transformierten Pflanzen nachgewiesen werden (Abbildung 5.12 und 5.13). Die Überexpression von SCL14 bewirkte eine deutliche Steigerung der as-1::GUS-Expression, während Pflanzen, in denen SCL14 nicht exprimiert wurde, eine verringerte as-1::GUS-Expression zeigten (Abbildung 5.16). Dies deutet auf eine essentielle Beteiligung von SCL14 an der Aktivierung der as-1-vermittelten Expression hin.
Das verwendete Reportergenkonstrukt as-1::GUS reagierte in der SCL14-Überexpressionslinie (OE) relativ zum uninduzierten Zustand genauso stark auf eine Salizylsäure (SA)- bzw. 2,4-D-Induktion wie die Ausgangslinie as-1::GUS (Abbildung 5.13). In der ko-Linie ließ sich as-1::GUS hingegen nicht stimulieren (Abbildung 5.16).
Die Beobachtungen deuten darauf hin, dass SCL14 ein allgemeines Co-Aktivator-Protein ist, das die Expression mit und ohne SA bzw. 2,4-D erhöht.
Für die Untersuchung der ko-Linie war es entscheidend, dass die beiden nächstverwandten Proteine von SCL14, SCL26 und SCL27, nicht mit TGA2 interagieren können. Wäre dies doch der Fall, hätte eine mögliche Redundanz die Verwendung eines SCL14/SCL26/SCL27 „triple knock out“ erforderlich machen können.
Neuere Untersuchungen von Benjamin Fode unterstützen das Vorhandensein eines TGA-SCL14-Komplexes am as-1-Element. Er konnte in Chromatin-Immunpräzipitations-Analysen (ChIP) zeigen, dass SCL14 direkt oder indirekt an das as-1-Element bindet. Eine direkte Bindung ist jedoch unwahrscheinlich, da Untersuchungen in Hefe gezeigt haben, dass SCL14 nicht an das as-1-Element binden
kann. Die bisherigen Daten legen nahe, dass SCL14 über Interaktion mit TGA2 in den Promotorkontext rekrutiert wird. Allerdings zeigen die ChIP-Daten von Benjamin Fode, dass die Überexpression von SCL14 nicht gleichzeitig zu einer erhöhten SCL14-Menge am as-1-Element führt. Daher scheint die Beteiligung eines Inhibitors an der Regulation der as-1-Aktivität wahrscheinlich.
Für die Aktivierung der as-1-vermittelten Expression wäre daher folgendes denkbar:
Zusätzlich zu TGA2 und SCL14, die sich im Zellkern befinden, könnte ein weiteres Protein, möglicherweise ein Inhibitor, die as-1::GUS-Aktivität beeinflussen. Dieser Inhibitor könnte durch SCL14 von dem an der DNA befindlichen TGA2-SCL14-Komplex aus dem Promotorkontext gezogen werden und eine Aktivierung der as-1-vermittelten Expression ermöglichen (Abbildung 6.3). Im Wildtyp bindet TGA2 konstitutiv an das as-1-Element. SCL14 führt zum einen durch Interaktion mit TGA2 zu einer Aktivierung, zum anderen zieht es einen putativen Inhibitor aus dem Promotorkontext. In der ko-Linie bleibt die Aktivierung der as-1-vermittelten Expression aus, da SCL14 fehlt. Bei Überexpression von SCL14 wird die Genexpression gegenüber dem Wildtyp noch verstärkt, da die größere Menge an SCL14 den putativen Inhibitor effektiver entfernen kann.
Abbildung 6.3: Hypothetisches Modell zur Aktivierung des as-1-Elements im Wildtyp sowie in der SCL14-ko- bzw. OE-Linie. Im Wildtyp bindet TGA2 konstitutiv an das as-1-Element. SCL14 aktiviert die Genexpression zum einen durch Interaktion mit TGA2, zum anderen zieht es einen putativen Inhibitor aus dem Promotorkontext und ermöglicht so die as-1-vermittelte Expression. In der ko-Linie kann die Genexpression nicht aktiviert werden, da SCL14 fehlt. Bei Überexpression von SCL14 wird die Genexpression gegenüber dem Wildtyp noch verstärkt, da die größere Menge an SCL14 den putativen Inhibitor effektiver entfernen kann.
SCL14-OE
as-1 TGA
SCL14