Die Medien für die Anzucht von Escherichia coli, Pseudomonas syringae und Agrobacterium tumefaciens enthielten entsprechende Antibiotika, um das Wachstum von Resistenz-tragenden Bakterien unter Selektionsdruck zu gewährleisten. Die Inkubation von Flüssigkulturen wurde im Schüttler bei 250 rpm durchgeführt.
4.1.1 Anzucht von Escherichia coli
Die Anzucht von E.coli erfolgte auf LB-Festmedium oder in dYT-Flüssigmedium über Nacht bei 37°C.
4.1.2 Anzucht von Pseudomonas syringae
Die Anzucht der Bakterien erfolgte in King´s B-Medium (KING et al., 1954) bei 28°C für 2 Tage.
4.1.3 Anzucht von Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens wurde auf YEB-Festmedium oder in YEB-Flüssigmedium bei 28°C über zwei bis drei Tage kultiviert.
4.1.4 Anzucht von Saccharomyces cerevisiae
Die Anzucht von S. cerevisiae erfolgte auf Vollmedium (YPAD) oder auf geeignetem Selektionsmedium (SD) über Nacht bei 30°C. Die Flüssigkultur wurde im Schüttler bei 250 rpm inkubiert.
4.1.5 Kultivierung von Tabak BY-2-Suspensionskulturen
Bright Yellow-2 (BY-2) Tabak (Nicotiana tabacum)-Suspensionskulturen wurden in einem modifizierten Murashige und Skoog-Medium mit 3 % Saccharose, 0,9 g/l Myo-Inositol, 0,9 mg/l Thiamin und 0,22 mg/l 2,4-D in 100 ml Erlenmeyerkolben kultiviert.
Die Anzucht erfolgte im Dunkeln bei 26°C auf einem Schüttler mit 120 rpm. Für die Subkultivierung wurden jede Woche 3 ml Kultur in 27 ml frisches Medium transferiert.
4.1.6 Anzucht von Arabidopsis thaliana-Pflanzen
4.1.6.1 Anzucht von Arabidopsis thaliana-Pflanzen auf Erde
Vor der Aussaat wurde die Erde einmal für 30 min bei 90°C gedämpft. Die Samen wurden 2 Tage im Dunkeln bei 4 °C stratifiziert, um eine gleichmässige Keimung zu erreichen. Die Kultivierung der Pflanzen erfolgte in einer Klimakammer entweder unter Langtags- (16 h Licht, 8 h Dunkel) oder unter Kurztags- (8 h Licht, 16 h Dunkel) Bedingungen.
4.1.6.2 Anzucht von Arabidopsis thaliana-Pflanzen in Sterilkultur
Die Samen wurden vor der Aussaat oberflächensterilisiert (Kapitel 4.1.7) und auf Petrischalen mit MS-Medium ausgelegt. Die Stratifizierung erfolgte für 2 Tage im Dunkeln bei 4°C. Anschließend wurden die Petrischalen in einer Klimakammer unter Langtagsbedingungen (16 h Licht, 8 h Dunkel) inkubiert.
Für die Paraquat-Behandlung wurde MS-Medium mit 0,15 % Saccharose und 0,5 M Paraquat verwendet.
4.1.7 Oberflächensterilisation von Samen
Die Oberflächensterilisation erfolgte in Anlehnung an CLOUGH und BENT (1998 und 2000).
Arabidopsis-Samen wurden in geeigneten Gefäßen (Kunststoff, 0,5 – 50 ml) mit geöffnetem Deckel in einem Exsikkator plaziert. Ein Becherglas mit etwa 100 ml konzentrierter Hypochloritlösung wurde dazugestellt und mit 5 ml konzentrierter Salzsäure versehen. Der Exsikkator wurde rasch geschlossen und ein geringes Vakuum angelegt, um den Exsikkator luftdicht zu verschließen, und eine Verdünnung des Chlorgases zu vermeiden. Nach 4 h war eine ausreichende Sterilisation erreicht.
4.1.8 Kreuzung von Arabidopsis thaliana
Die Blüten von Arabidopsis thaliana sind so aufgebaut, dass sie sich bereits während des Öffnens selbst bestäuben. Daher können Kreuzungen nur an unreifen Blüten im Knospenstadium vorgenommen werden, die zuvor emaskuliert wurden. Für eine Kreuzung wurden daher junge, kräftige Blütenstände ausgewählt, an denen bereits zwei bis drei Blüten geöffnet waren. Von diesen Blütenständen wurden die unteren zwei bis drei Knospen für die Kreuzung verwandt. Alle Manipulationen wurden mit Hilfe eines Binokulars beobachtet.
Die zu kreuzende Blüte wurde mit einer feinen, weichen Federstahlpinzette so dicht wie möglich unterhalb der Kelchblätter ergriffen und festgehalten. Mit einer scharfen, spitzen Präparationspinzette wurden die vier Kelchblätter nach schräg unten abgezogen.
Auf die gleiche Weise wurde mit den vier Blütenblättern und den zwei langen und vier kurzen Antheren verfahren, wobei die Fruchtanlage nicht beschädigt werden durfte. Der Donorpflanze wurde dann ein frisches Staubblatt entnommen und der Pollen auf dem Pistill der emaskulierten Blüte abgestreift. Anschließend wurde mit dem Binokular überprüft, ob Pollen auf dem Pistill hängengeblieben war und wenn nötig die Bestäubung mit einem neuen Staubblatt wiederholt. Die gekreuzten Blüten wurden durch Entfernen der unterhalb liegenden Blüten und der oberhalb befindlichen ein bis zwei Knospen isoliert und der gekreuzte Blütenstand mit einem kleinen Umhängeschild markiert.
4.1.9 Infektion von Arabidopsis-Pflanzen mit Pseudomonaden
Zur Bestimmung der Verbreitung von Pathogenen innerhalb einer Pflanze werden die Mikroorganismen isoliert und ihre Kolonienzahl durch Titern ermittelt, indem die Bakterien auf einem semi-selektiven Medium ausgezählt werden (modifiziert nach KNOCHE et al., 1987). Zur Quantifizierung des Bakterienwachstums wurden von den Pseudomonaden ü.N. Vorkulturen angezogen und abzentrifugiert (5000 rpm, 5 min,
RT). Die Pseudomonaden wurden auf eine Dichte von 5 x 105 cfu / ml mit 10 mM MgCl2 verdünnt. Eine Blatthälfte wurde mit einer 1 ml-Spritze ohne Nadel von der Blattunterseite inokuliert. Das Volumen einer Inokulation betrug ca. 10 µl.
4.1.9.1 Bestimmung des Pseudomonadenwachstums in der Pflanze
Von 9 infizierten Pflanzen wurden die Infektionsflächen (∅ 0,5 cm) inokulierter Blatthälften ausgestochen, zusammengefasst und in 240 µl 10 mM MgCl2
homogenisiert. Das Bakterienwachstum wurde zu den Zeitpunkten 0h und 3 Tage nach Infektion aufgenommen. Die homogenisierten Proben wurden jeweils kurz gemischt und in einer Verdünnungsreihe (Tag 0: 1:10, 1:50, 1:250, 1:500; Tag 3: 1:100, 1:500, 1:5000, 1:50000) auf King´s B-Medium mit entsprechenden Antibiotika ausplattiert.
Die Platten wurden 2 Tage bei 28 °C inkubiert und die Anzahl der Kolonien ausgezählt.
Es wurden die Bakterienzahlen der gleichen Linien gemittelt und die Standardabweichung ermittelt.
4.1.9.2 Infektion von Arabidopsis thaliana mit Pseudomonaden für eine RNA-Isolation
Die Infektion von A. thaliana mit Pseudomonaden erfolgte durch Dippen der Blätter in eine Suspension mit Pseudomonaden von einer OD600 = 0,2 in 10 mM MgCl2 mit etwas Silwet. Die Pflanzen wurden anschließend bei hoher Luftfeuchtigkeit unter einer Haube kultiviert.
4.1.10 Induktion der Genexpression in Arabidopsis-Pflanzen
Arabidopsis thaliana in Erdkultur wurden durch Besprühen mit wässrigen Lösungen mittels handelsüblicher Sprühflaschen, die in der Lage waren, einen feinen Sprühnebel zu erzeugen, besprüht, bis die Pflanzen gut benetzt waren. Die Induktionslösungen wurden für jede Sprühbehandlung frisch hergestellt.
Folgende Hormon-Konzentrationen wurden verwendet:
1 mM Salizylsäure; 100 µM 2,4-D; 20 µM JA