3.2 Analysemethoden
3.2.7 Lebendzellzahlbestimmung durch Ausplattieren
Im Unterschied zur Gesamtzellzahl werden bei der Lebendzellzahl nur die vermeh-rungsfähigen Zellen erfasst. Unter günstigen Bedingungen bilden diese Keime auf einem Nährboden Kolonien, welche mit dem bloßen Auge ausgezählt werden kön-nen. Die grundlegende Annahme des Verfahrens ist, dass jede vermehrungsfähige Zelle eine makroskopisch sichtbare Kolonie bildet. Dies trifft häufig nicht zu, da viele Mikroorganismen nicht vereinzelt dispergiert in einer Suspension vorliegen, sondern als Zellverbände, aus welchen jeweils nur eine Kolonie entsteht. Somit
unterschätzt die ermittelte Lebendzellzahl die in der Realität vorliegende, was durch die Angabe von „koloniebildenden Einheiten“ (KBE) anstelle von Zellzah-len unterstrichen werden soll. Weiterhin werden in Mischpopulationen nur jene Bakterien erfasst, die bei der gewählten Kombination aus Nährboden und Bebrü-tungsbedingungen wachsen, weshalb in solchen Fällen weniger als 1 % der Keime in die Zählung eingehen. Nicht zuletzt hat auch die Dauer der Bebrütung einen großen Einfluss und ist mit 24 Stunden im Allgemeinen recht lang. Ein Vorteil dieser Bestimmungmethode ist allerdings die sehr hohe Empfindlichkeit.
In dem Plattenverfahren lässt man die Mikroorganismen in einer Suspension geeigneter Verdünnung auf einer Agarplatte über einen gewissen Zeitraum auf-wachsen. Dabei ist es wichtig, dass die Bakterien keinem wachstumshemmenden Stress ausgesetzt werden, welcher durch ein Verlangsamen des Aufwachsens oder gar ein Abtöten das Resultat verfälscht. Hierzu zählen beispielsweise Hitze– und Kältestress, Hungerstress, osmotischer Stress usw., welche durch Wahl eines ge-eigneten Dispersionsmittels vermieden werden können. Der Nährboden in der zum Bebrüten verwendeten Petrischale muss auf die zu untersuchende Gattung abge-stimmt sein, darf nicht zu dick sein und auch keine zu hohe Nährstoffkonzentrati-on beinhalten, da es sNährstoffkonzentrati-onst zu ungewollter Schleimbildung oder dem Schwärmen2 kommt [264].
Beim Spatelplattenverfahren wird mittels eines Drigalskispatels eine definier-te Menge Bakdefinier-teriensuspension (≈0,1ml) unter gleichzeitigem Drehen der Petri-schale über die gesamte Agaroberfläche gleichmäßig verteilt (vgl. Abbildung 3.26).
In den getrockneten Agar zieht die ausgespatelte Flüssigkeit schnell ein und die Mikroorganismen werden immobilisiert. Eine Verunreinigung mit eingeschleppten Zellen ist durch eine sterile Arbeitsweise (Spatel, Pipettenspitze, Clean–Bench) zu vermeiden.
Nach einer bestimmten Bebrütungsdauer sollen zwischen 30 und 300 Kolonien auf der Agarplatte vorhanden sein, um einen guten Kompromiss zwischen statis-tischer Genauigkeit und dem systematischen Fehler durch Fehlzählungen bei zu
2aktives Ausbreiten der Bakterien über die ganze Agarplatte beispielsweise durch Geißeln
Abbildung 3.26: Gleichmäßiges Verteilen der Zellsuspension auf der Agaroberfläche mit einem Drigalskispatel im Spatelplattenverfahren (aus [264]).
hoher Koloniezahl einzugehen. Um sicher zu gehen, dass die Zahl der KBE im an-gestrebten Bereich ist, werden aus einer Probe verschiedene Verdünnungsstufen ausgespatelt. Hierbei kommt es vor, dass zwei aufeinanderfolgende Verdünnungs-stufen brauchbare Kolonienzahlen liefern, die aufgrund ihrer unterschiedlichen Präzision zu einem gewichteten Mittelwert m verrechnet werden [264]:
m= 10x V ·
Pcx+P cx+1
nx+ 0,1nx+1
(3.36)
mit:
V: pro Platte eingesetztes Volumen der (verdünnten) Zellsuspension [ml]
cx: KBE der niedrigsten ausgewerteten Verdünnung 10−x
cx+1: KBE der nächstöheren ausgewerteten Verdünnung10−(x+1)
Da auch bei dieser Bestimmungsmethode, wie bei der Gesamtzellenzahl, eine Poissonverteilung angenommen wird, kann das 95 %–Konfidenzinterwall gemäß Gleichung 3.35 berechnet werden. Es liegt zwischen etwa ±35 % für 30 aus-gezähle Kolonien und ±12 % bei 300. Die statistische Genauigkeit kann durch
Verwendung mehrerer Agarplatten zur Parallelbestimmung ohne Erhöhung des systematischen Fehlers verbessert werden [264].
Experimentelle Durchführung
Dieses Kapitel beschreibt die genaue Durchführung der Untersuchungen. Es wird dabei sowohl darauf eingegangen, wie die Membranmodifizierung inklusive der Rohmaterialherstellung vorgenommen wurde, als auch der genaue Testverlauf in-klusive Probenherstellung und Versuchsparameter dargestellt.
4.1 Synthese ausgerichteter Multi–walled Carbon Nanotubes
Wie in Abschnitt 3.1.4 ausgeführt, wurden die in der vorliegenden Arbeit ver-wendeten ausgerichteten MWCNT in einem CVD–Prozess an der TU Hamburg–
Harburg selbst hergestellt. Der Aufbau des hierbei benutzten Reaktors ist in Ab-bildung 4.1 schematisch dargestellt. Es wurde ein Quarzglasrohr (Länge 135 cm, Kreisquerschnittsdurchmesser 10,5 cm) in einem Zwei–Zonen–Ofen des Typs HZS 12/900 E der Firma Carbolite verwendet. Die beiden Heizzonen des Ofens wur-den auf 200 °C (vorne) und 760 °C (hinten) eingestellt, wobei durch Konvektion allerdings eine Temperatur von etwa 460 °C in der ersten Zone herrschte. Als Substrat wurden zwei Quarzglasplatten (l ·b · d = 80·100 · 3 mm3) benutzt, welche hinter einander in der hinteren Temperaturzone (Distanz vom Gaseinlass
≈70cm) platziert wurden.
Vor dem Synthesevorgang wurde das Quarzglasrohr gasdicht versiegelt und vom Trägergas aus 10 Vol.% Wasserstoff in Argon bei einer Rate von 0,22 l/min durchflossen. Die Gasdichtigkeit wurde dabei mittels des erzwungenen Durchflus-ses des TrägergaDurchflus-ses durch ein Ölbad sichergestellt. Das austretende Abgas wurde zusätzlich noch zur Reinigung durch einen Aktivkohlefilter geleitet, bevor es in die Atmosphäre entlassen wurde.
Abbildung 4.1: Schematische Darstellung des Aufbaus des zur Herstellung von ausge-richteten MWCNT verwendeten CVD–Reaktors.
Nachdem sich ein Gleichgewichtszustand eingestellt hatte, wurde eine Lösung aus 5 Gew.% Ferrocen in Toluol mittels einer Spritzenpumpe bei 5 ml/h Einspritz-rate über das auf 200 °C temperierte Injektorrohr kontinuierlich in den Prozess eingebracht. Die Synthese wurde nach 2 Stunden durch Abschalten aller Heizele-mente sowie des Einspritzens der Ferrocen–Toluol–Lösung beendet. Während des Abkühlvorgangs wurde der Reaktor weiterhin mit einem leichten Argon–Gasfluss gespült, um den Eintritt von Sauerstoff und der dadurch gegebenen Gefahr der Oxidation der hergestellten MWCNT zu verhindern.
Zur Modifikation verwendet wurde nur das auf den beiden Substratplatten gewachsene Produkt, welches vorsichtig mit einer Rasierklinge von der Oberflä-che abgelöst wurde. Die ebenfalls mit Nanotubes bewachsenen Innenwände des
Reaktorrohres wurden nach jedem Herstellungsvorgang gründlich gereinigt.