Lage der Mutation als Ursache der Bildung von Läsionen in acd5-1

Auch wenn die Zink-Hypersensitivität nur teilweise von der SA-Akkumulation abhängig zu sein scheint, konnte bereits gezeigt werden, dass die Bildung von Läsionen in adulten acd5-1-Pflanzen allein darauf zurückzuführen ist (Greenberg et al. 2000). Da sich in adulten acd5-2-Mutanten keine Läsionen beobachten lassen, liegt die Vermutung nahe, dass sich acd5-1 und acd5-2 im adulten Stadium in ihrem SA-Gehalt unterscheiden. Dadurch stellt sich aber die Frage, wie durch die Mutation des gleichen Genes die Unterschiede in der SA-Akkumulation entstehen können. Eine mögliche Erklärung wäre, dass die CerK in den Mutanten unterschiedlich stark exprimiert wird. Das Transkriptlevel von ACD5 ist jedoch in acd5-1 und acd5-2 sowie in Col-0 gleich sowohl unter Kontroll-Bedingungen als auch unter Zink-Stress (Abb. 10). In adulten Pflanzen von acd5-1 konnte in Blättern mit Läsionen zudem ein erhöhtes PR1-Level nachgewiesen werden, wohingegen in Blättern vor der Bildung von Läsionen das gleiche PR1-Transkriptlevel wie im WT gefunden werden konnte (Greenberg et al. 2000). Deshalb wurde das Transkriptlevel von PR1 untersucht. Die Ergebnisse von

110 Greenberg deckten sich dabei mit den hier gemessenen Transkriptleveln. Die getesteten Keimlinge zeigten keinen Unterschied in der Transkriptmenge zwischen Col-0 und den acd5-Mutanten, weder unter Kontroll-Bedingungen noch unter Zink-Stress (Abb. 10). Da gezeigt werden konnte, dass SA zur Expression von PR1 führt (Genoud et al. 2002), ist dies ein weiterer Hinweis darauf, dass sich die SA-Konzentrationen in Keimlingen der acd5-Mutanten nicht voneinander unterscheiden. Die erhöhte PR1-Expression in adulten acd5-1-Pflanzen passt wiederum zu der Akkumulation von SA und der Bildung von Läsionen. Die Expression von WIN3 wurde ebenfalls untersucht. Dieses Gen ist an der Regulation der SA-Akkumulation beteiligt (Wang et al. 2011). Auch hier konnten keine Unterschiede zwischen Col-0 und den acd5-Mutanten gefunden werden (Abb. 10), was die vorangegangene Hypothese bekräftigt, dass es in acd5-1- und acd5-2-Keimlingen keinen Unterschied in der SA-Akkumulation gibt. Von Interesse wäre nun die Expression von ACD5 in adulten acd5-1- und acd5-2-Mutanten, um zu klären, ob es im adulten Stadium einen Unterschied gibt. Zudem könnte eine Messung des PR1-Transkriptlevels, da dieses SA abhängig zu sein scheint, erste Erkenntnisse über die SA-Konzentration in adulten acd5-2 Pflanzen liefern. Letztlich müsste die SA-Konzentration der adulten Mutanten gemessen werden, um herauszufinden, ob es einen Unterschied zwischen acd5-1 und acd5-2 gibt, der den Unterschied in der Bildung von Läsionen erklären könnte.

Sollte es einen Unterschied in der SA-Akkumulation geben, stellt sich die Frage, durch was dieser ausgelöst wird. Auch ein Unterschied in der ACD5-Proteinmenge oder die Verteilung könnte einen Einfluss darauf haben. Mittels transienter Expression in N. benthamiana konnte gezeigt werden, dass es keinen Unterschied in der Lokalisation und Menge der in Col-0 und den acd5-Mutanten gebildeten Proteine gibt (Abb. 17). Dabei konnte die von Bi et al. gezeigte Lokalisation im ER und im Golgi-Apparat bestätigt werden. Die gezeigte Lokalisation in den Mitochondrien (Bi et al. 2014) konnte jedoch nicht beobachtet werden. Die Unterschiede im Phänotyp von acd5-1 und acd5-2 können also ebenfalls nicht durch eine Veränderung in der Lokalisation oder im Proteingehalt erklärt werden.

Auch wenn die Lokalisation und die Proteinmenge zwischen den acd5-Mutanten gleich ist, kann sich dennoch die Aktivität der beiden mutierten Proteine voneinander und zum WT unterschieden. Für acd5-1 konnte bereits beobachtet werden, dass es eine 10fach verringerte Kinase-Aktivität besitzt (Bi et al. 2014). Auch in der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass acd5-1 eine zu Col-0 verringerte Aktivität besitzt. Dasselbe konnte auch für acd5-2 nachgewiesen werden (Abb.18). Aber auch wenn die Aktivität der acd5-Mutanten im Vergleich zu Col-0 verringert war, konnte erneut kein Unterschied zwischen den Mutanten beobachtet werden, der die unterschiedliche Bildung von Läsionen erklären könnte.

Zusammengefasst kann gesagt werden, dass die wahrscheinlichste Erklärung für den Unterschied in der Bildung von Läsionen in einer unterschiedlich starken Akkumulation von SA in adulten acd5-1 und

Diskussion

111 acd5-2 liegt. Was diesen Unterschied auslöst, kann zum jetzigen Zeitpunkt noch nicht gesagt werden.

Die Ergebnisse der Transkriptanalyse von PR1 und WIN3 legen nahe, dass es in Keimlingen noch zu keinem Unterschied in der Akkumulation kommt. Zusätzlich wird vermutet, dass die SA-Konzentration zwar an der Zink-Hypersensitivität der acd5-Mutanten beteiligt ist, auf Grund des Wurzelwachstums der Doppelmutanten mit nahG jedoch nicht gänzlich dafür verantwortlich ist.

Es bleibt also die Frage, wie es in adulten Pflanzen zu einem Unterschied in der Akkumulation von SA kommen kann. Wie zuvor erwähnt, könnte die Expression von ACD5 in adulten Pflanzen verändert sein. Dies könnte mittels quantitativer realtime-PCR ermittelt werden. Sollte sich dabei zeigen, dass ACD5 in acd5-2 stärker exprimiert ist als in acd5-1, könnte in acd5-2 bei gleicher enzymatischer Umsatzrate im Vergleich zu acd5-1 dennoch mehr Cer phosphoryliert werden. Dadurch käme es in acd5-2 zu einer geringeren Akkumulation von Ceramiden. Da vermutet wird, dass eine Akkumulation von Ceramiden zur Erhöhung der SA-Konzentration führt (Sánchez-Rangel et al. 2015), würde also ebenfalls die Akkumulation verringert. Um dies zu überprüfen, müsste zusätzlich zur SA-Konzentration und dem ACD5-Transkriptlevel noch die Ceramid-SA-Konzentration gemessen werden.

Eine weitere mögliche Erklärung könnte die Lage der Mutationen von acd5-1 und acd5-2 liefern. Die Mutation von acd5-2 befindet sich in der DAGKc- (Diacylglycerol kinase catalytic) -Domäne (PROSITE-ProRule). Es ist also direkt die Kinase-Domäne betroffen. Dadurch wird höchstwahrscheinlich die Kinase-Funktion ausgeschaltet. Dass eine Mutation in dieser Domäne die Kinase-Aktivität stark verringern bis ausschalten kann, konnte bereits gezeigt werden (Abe et al. 2003). In acd5-1 liegt die Mutation nun außerhalb dieser Domäne, dennoch zeigen beide Mutanten den gleichen Aktivitätsverlust. Was man bisher weiß, ist, dass die Ceramid-Kinase-Aktivität Calcium-abhängig ist (Liang et al. 2003). Die Aktivierung durch Calcium könnte nun durch das direkte Binden von Ca²⁺ an die CerK zustande kommen. Damit würde Ca²⁺ als Co-Faktor dienen. Ca²⁺ könnte aber auch an Calmodulin binden und dieses könnte dann die Ceramid-Kinase aktivieren. Bei der humanen Ceramid-Kinase (CERK) konnte bereits ein Calcium/Calmodulin-binde-Motiv gefunden werden (Sugiura et al. 2002). Auch die Interaktion der CERK mit Calmodulin und die daraus resultierende Wirkung als Calcium-Sensor für die CERK konnte gezeigt werden (Mitsutake et al. 2005). Dies legt die Vermutung nahe, dass auch die pflanzliche CerK durch Calcium-abhängiges Calmodulin aktiviert werden könnte. Die Mutation von acd5-1 könnte sich also in der Calmodulin-Bindestelle befinden.

Die Bindestelle der humanen CERK ist zwar bekannt, da die CERK-Proteinsequenz aber nur zu 31%

mit der pflanzlichen CerK übereinstimmt (Liang et al. 2003), konnte ein direkter Vergleich der beiden das Vorkommen oder die Lage einer solchen Bindestelle in der pflanzlichen CerK nicht zeigen. Eine andere Möglichkeit wäre eine Veränderung der Proteinstruktur durch die Mutation (G412R).

Dadurch würde eine eventuelle Bindestelle entweder für Calcium oder Calcium-aktiviertes

112 Calmodulin blockiert werden. Somit würde die Aktivierung der CerK verhindert werden. Da es sich bei Glycin um die kleinste und bei Arginin um die größte Aminosäure handelt, führt ein solcher Austausch mit großer Wahrscheinlichkeit zu einer Veränderung der Proteinstruktur. Somit würden beide Mutationen zu einer verringerten CerK-Aktivität führen. Der Unterschied besteht nun darin, dass bei acd5-1 die Bindestelle für Ca²⁺ entweder direkt oder über Calmodulin an die CerK mutiert ist, wodurch die Aktivität vermindert wird und bei acd5-2 die Kinase-Domäne direkt betroffen ist.