Ermittlung möglicher Gene mit Beteiligung an der Zink-Homöostase

Im Anschluss daran wurde die Mutation, welche für die gesteigerte Zink-Toleranz gegenüber ozs1 verantwortlich ist, in suo1 mittels QTL-Seq-Analyse-Methode gesucht. Auf Grund der Tatsache, dass es für diese Analyse besonders wichtig ist, die Phänotypen klar unterscheiden zu können, wurde sich hierbei auf suo1 konzentriert, da diese die einzige Suppressor-Mutante war, die unter Zink-Stress ein signifikant besseres Wurzelwachstum zeigte. Die QTL-Seq-Analyse-Methode lieferte fünf Kandidaten-Gene (Tab. A3). Alle Mutationen in diesen Kandidaten-Genen führten zu einer veränderten AS-Sequenz. Eine Mutation wurde in AT3G54590 gefunden. Dieses Gen codiert für Extensin2 (EXT2). Extensine sind Bestandteil der Zellwand und dort an deren Organisation beteiligt (Lamport 1963). Es konnte gezeigt werden, dass EXT2 vor allem bei Rehydrierung nach Dehydrierung exprimiert und unter Salz-Stress reprimiert wird (Yoshiba et al. 2001). Da laut SIFT-Analyse der vorliegende AS-Austausch jedoch tolerierbar ist, also höchstwahrscheinlich nicht zu einer Veränderung der Funktion des Proteins führt, wurde EXT2 nicht weiter untersucht. Genauso verhält es sich bei AT3G57060. Dieses Gen codiert für ein CAP-D Protein (Chromosome Associated Polypetide), welches für die Chromatin Organisation, das

128 Wachstum und die Fertilität wichtig ist (Schubert et al. 2013). Auch hier ist der AS-Austausch laut SIFT-Analyse tolerierbar.

Eine weitere Mutation wurde in AT3G49800 gefunden. Dieses Gen codiert für ein Protein mit BSD-Domäne. BSD-Domänen kommen in verschiedenen Protein-Familien vor und sind etwa 60 AS lang.

Daher stammt auch der Name BSD (BTF2-like transcription factors, synapse-associated, DOS2-like proteins) (Doerks et al. 2002). BTF2 aus Säugetieren und das homologe Gen TFB1 aus Hefe enthalten zum Beispiel eine BSD-Domäne. Diese Proteine dienen als Transkriptionsfaktoren (Fischer et al. 1992;

Gileadi et al. 1992). BSD-Domänen können auch in Synapsen assoziierten Proteinen und in DOS2-like Proteinen gefunden werden (Doerks et al. 2002). Für DOS2 konnte gezeigt werden, dass es in Hefe an der Organisation von Heterochromatin beteiligt ist (Li et al. 2005). BSD-Domänen sind nicht nur in vielen verschiedenen Protein-Familien zu finden, sondern auch in vielen Spezies von frühen Protozoen bis hin zum Menschen, was auf eine konservierte, möglicherweise essentielle Funktion hindeutet (Doerks et al. 2002). Da BSD-Domänen in Transkriptionsfaktoren gefunden wurden, wird vermutet, dass sie an Chromatin-assoziierten Prozessen beteiligt sind. In Pflanzen wiederum erscheint eine BSD-Domäne auch mit einer U-Box Domäne. U-Box-Domänen sind an der Ubiquitinierung von Proteinen beteiligt (Aravind et al. 2000). Letztendlich ist die genaue Funktion von BSD-Domänen noch nicht bekannt (Doerks et al. 2002). Die BSD-Domäne ist die einzige Domäne, die in AT3G49800 gefunden werden konnte. Laut BLAST-Analyse erstreckt sie sich über die AS 195 - 247.

Somit liegt die gefundene Mutation nicht in der BSD-Domäne, da sie die 146. AS verändert. Auch wenn ein Alignment von AT3G49800 Orthologen darauf hindeutet, dass die mutierte AS konserviert ist, spricht die Tatsache, dass sich die Mutation nicht in der BSD-Domäne befindet, dagegen, dass die Funktion des Proteins beeinflusst ist. Betrachtet man zudem den SNP-Index von KP, kann man sehen, dass dieser bei 0,38 liegt. Damit liegt die Allel-Häufigkeit des KP deutlich über dem erwarteten Wert.

Eine weitere mögliche Mutation, die laut QTL-Seq-Analyse-Methode zu der gesteigerten Zink-Toleranz führen könnte, wurde in AT3G59610 gefunden. Die Mutation führt hier zu einer Verkürzung des Proteins von 521 AS auf 455 AS. Das Gen codiert für ein Jacalin related Lectin 38 (JAL38)-Protein.

Das Protein besitzt am N-Terminus eine Domäne (PROSITE-ProRule). Proteine mit einer F-Box-Domäne kommen zum Beispiel in Skp1-Cullin-F-Box (SCF)-Komplexen vor. SCF sind Ubiqitin-E3-Ligase-Komplexe (Risseeuw et al. 2003). Zu diesen zählen auch die unter 4.2 behandelten CUL4-E3-Ligase-Komplexe. Da sich die F-Box-Domäne jedoch am N-Terminus des Proteins befindet und nur wenige AS am Terminus fehlen, sollte die Funktion dieser Domäne nicht beeinflusst sein. Am C-terminalen Ende befindet sich jedoch eine weitere Domäne. Hier ist eine Jacalin-related Lectin (JRK) - Domäne zu finden, die sich über die AS 377-519 erstreckt (PROSITE-ProRule). JRL-Domänen sind an der Resistenz gegenüber biotischem und der Toleranz gegenüber abiotischem Stress beteiligt (Esch et

Diskussion

129 al. 2017). Für OsJRL aus Reis konnte gezeigt werden, dass es als Antwort auf Salz-, Trocken-, Kälte- und Hitzestress hoch reguliert wird (He et al. 2017). JRL-Domänen binden reversibel Kohlenhydrate.

Proteine mit einer Domäne sind an der Pathogenabwehr beteiligt. So wurde gezeigt, dass ein JRL-Protein nach dem Binden von Oligosacchariden, was einen Signalstoff nach Pathogenbefall darstellt, an die Stelle der Infektion relokalisiert wurde (Weidenbach et al. 2016). Durch die Mutation entsteht in JAL38 ein Stop-Codon wodurch es zur Bildung eines verkürzten Proteins kommt. Dadurch wird die JRL-Domäne nicht mehr ganz gebildet. Es werden nur noch 78 der 142 AS translatiert. Ein Teil der Domäne ist also noch vorhanden, ob dieser ausreichend ist, um die Funktion des Proteins aufrecht zu erhalten, kann nicht gesagt werden. Betrachtet man jedoch zusätzlich bei der QTL-Seq-Analyse-Methode den SNP-Index von KP, liegt dieser bei 0,46. Auch hier ist die Allel-Häufigkeit des KP deutlich höher als erwartet. Somit ist es unwahrscheinlich, dass diese Mutation den beobachteten Phänotyp verursacht.

Die letzte Mutation, die mittels QTL-Seq-Analyse-Methode als mögliche Ursache für die erhöhte Zink-Toleranz gefunden wurde, befindet sich in AT3G57330. Die Mutation führt, wie die Mutation in AT3G59610, zu einem verfrühten Stop-Codon, wodurch nur noch ein verkürztes Protein entsteht.

Dabei werden lediglich 105 der insgesamt 1025 AS gebildet. AT3G57330 codiert für eine Autoinhibitorische Ca²⁺-ATPase11 (ACA11). In Arabidopsis gibt es 14 Ca²⁺-ATPasen, die in zwei Familien eingeteilt werden. Es gibt die Autoinhibitorischen Ca²⁺-ATPasen (ACAs) und vier ER-Typ Ca²⁺ -ATPasen (ECAs) (Baxter et al. 2003). ACAs wiederum können in vier Unterfamilien eingeteilt werden.

ACA4 und ACA11 bilden dabei eine Unterfamilie (Baxter et al. 2003). ACA4 ist in prävakuolären Kompartimenten lokalisiert (Bolte et al. 2004), während ACA11 in der vakuolären Membran lokalisiert ist (Lee et al. 2007). ACA11 besitzt am N-Terminus eine calmodulinregulierte autoinhibitorische Domäne. Diese befindet sich innerhalb der ersten 37 AS (Lee et al. 2007). Darin unterscheidet sich ACA11 von den Plasmamembran Ca²⁺-ATPasen (PMCAs) von Tieren, welche diese Domäne am C-terminalen Ende aufweisen (Carafoli 1997). Kommt es zu einem Anstieg der Calcium-Konzentration im Cytosol aktiviert dieses CaM. CaM wiederum bindet an der calmodulinregulierten autoinhibitorischen Domäne von ACA11 und aktiviert dort den Transport von Calcium aus dem Cytosol in die Vakuole (Baekgaard et al. 2005). Die mittels QTL-Seq-Analyse-Methode gefundene Mutation führt nun zur Verkürzung des Proteins auf 105 AS. Damit ist zwar noch die calmodulinregulierte autoinhibitorische Domäne vorhanden, jedoch fehlen die anschließenden 920 AS. Dadurch kann die Ca²⁺-Transportaktivität höchstwahrscheinlich nicht ausgeführt werden. Dieser Aspekt spricht dafür, dass es sich hier um die gesuchte Mutation handelt, da die anderen Mutationen entweder tolerierbar sind oder eine zu hohe Allel-Häufigkeit des KP aufweisen. Betrachtet man den SNP-Index der Mutation in ACA11 ist dieser bei kurzen Wurzeln mit 0,2 sehr niedrig. Es ist der niedrigste Wert, der berechnet wurde. Somit ist es am wahrscheinlichsten, dass die Mutation in

130 ACA11 für die gesteigerte Zink-Toleranz, welche in suo1 gegenüber ozs1 beobachtet wurde, verantwortlich ist.