GO-Term-Analyse der in acd5-2 unter Zink-Stress induzierten Gene

Um herauszufinden, was zu der Zink-Hypersensitivität in acd5-2 führt, wurde als nächstes eine GO-Term-Analyse mit den nur in acd5-2 unter Zink-Stress induzierten Genen durchgeführt. Dabei zeigte

114 sich eine vermehrte Induktion von Genen der „zellulären Antwort auf Hypoxie“ und der „Antwort auf Chitin“ (Abb. 20C). Eine Häufung von induzierten Genen der „zellulären Antwort auf Hypoxie“ lässt sich aber auch für Gene beobachten, die sowohl in Col-0 als auch in acd5-2 induziert sind (Abb. 20C).

Dabei sind in Col-0 23 und in acd5-2 44 Gene, dieses GO-Terms induziert. Da es in acd5-2 insgesamt zu einer stärkeren Antwort auf Zink-Stress kommt, das heißt, dass mehr Gene differentiell exprimiert werden, ist die Häufung der Gene in Col-0 und acd5-2 ungefähr gleich stark. Auch kann man erkennen, dass sich unter den Zink-induzierten Hypoxie-responsiven Genen viele Hypoxie-Kern-Gene (etwa 36%) (identifiziert nach Mustroph et al. 2009) finden lassen (Abb 23A). Zink-Stress scheint also in A. thaliana allgemein eine Hypoxie-Stress-Antwort auszulösen.

Nun stellt sich die Frage, wieso Zink-Stress eine Hypoxie-Antwort auslösen sollte. Eine mögliche Antwort liefert die Arbeit von Carbonare et al. 2019. Hier wurde ebenfalls gezeigt, dass Zink-Stress, dieses Mal in Populus spp., zur Induktion von Hypoxie-responsiven Genen führt. Bei einem Vergleich von Zink-toleranten und Zink-sensitiven Pappelspezies konnte bei der Betrachtung Hypoxie-responsiver Gene wie ADH, PCO oder HRA1 kein Unterschied in der Expressionsstärke unter Zink-Stress festgestellt werden. Deshalb wurde die Hypothese aufgestellt, dass die Aktivierung von Hypoxie-Genen eine generelle Antwort auf Stress darstellt und keine Adaption an erhöhte Zink-Konzentrationen ist (Carbonare et al. 2019). Das gleiche kann auch in A. thaliana bei einem Vergleich von Col-0 und acd5-2 festgestellt werden. Auch hier gibt es keinen Unterschied in der Expression dieser Gene unter Zink-Stress. Die Ergebnisse stützen also die Hypothese von Carbonare et al. 2019.

Vergleicht man die Hypoxie-responsiven Gene der Pappel, die durch Zink induziert werden, mit denen von A. thaliana, können vier Gene gefunden werden, die in beiden Pflanzen induziert sind.

ADH1, LBD41, HRA1 und PCO1 gehören dabei alle zu den Hypoxie-Kern-Genen (Abb. 23B, C). Die Tatsache, dass sowohl in der Pappel als auch in A. thaliana Hypoxie-responsive Gene unter Zink-Stress induziert werden, dabei sogar teilweise dieselben Gene, bekräftigt ebenfalls die Hypothese, dass die Aktivierung von Hypoxie-Genen eine generelle Antwort auf Zink-Stress ist.

Wie kann Zink-Stress nun eine Hypoxie-Antwort auslösen? Um eine Hypoxie-Antwort auszulösen, muss normalerweise ein Sauerstoffmangel wahrgenommen werden. Dies geschieht über den N-degron-Pfad. Dabei wird die Stabilität von Transkriptionsfaktoren der Hypoxie-Antwort durch deren N-Terminus bestimmt. Hypoxie-responsive Gene werden vor allem durch RAP2.2, RAP2.3, RAP2.12 und HRE1 sowie HRE2 induziert (Gibbs et al. 2011; Licausi et al. 2011b). Diese Transkriptionsfaktoren gehören zu der Gruppe der Group VII Ethylene Response Factors (Group VII ERFs). Diese ERFs besitzen an ihrem N-Terminus ein Methionin, gefolgt von einem Cystein. Durch Methionin-Aminopeptidasen (MAP) wird das Methionin abgeschnitten, wodurch das Cystein frei vorliegt. Durch PCOs kann dieses Cystein unter der Beteiligung von Sauerstoff oxidiert werden. Über

Arginyl-t-RNA-Diskussion

115 Transferase (ATE) wird ein Argininrest an das oxidierte Cystein gebunden. Anschließend wird das Protein über Proteolysis 6 (PRT6) ubiquitiniert und somit für den proteasomalen Abbau markiert.

Durch das 26S-Proteasom werden die ERFs dann degradiert (Weits et al. 2014). Unter hypoxischen Bedingungen fehlt Sauerstoff als Substrat der PCO, damit kann dieses das Cystein der ERFs nicht mehr oxidieren. Dadurch werden die ERFs nicht länger abgebaut, sondern stabilisiert und können so eine Hypoxie-Antwort durch die Expression Hypoxie-responsiver Gene auslösen. Um arbeiten zu können, benötigt PCO zusätzlich zu Sauerstoff aber auch noch Fe²⁺. Wie unter 1.2.1 bereits erwähnt, kann ein Zink-Überschuss zu einem physiologischen Eisen-Mangel führen, indem es Fe²⁺ verdrängt. Es konnte gezeigt werden, dass Zink in der Pappel die Aktivität von PCO hemmt. Dabei könnte Zn²⁺ Fe²⁺

eventuell aus PCO verdrängen oder bei der Synthese von PCO wird Zn²⁺ auf Grund der übermäßigen Präsenz fälschlicherweise anstelle von Fe²⁺ eingebaut. Dadurch würde PCO inaktiviert und die ERFs stabilisiert werden. Die Induktion Hypoxie-responsiver Gene wäre also durch einen physiologischen Eisen-Mangel bedingt und nicht direkt durch erhöhte Zink-Konzentrationen (Carbonare et al. 2019).

Dass es unter Zink-Stress zu einer Eisen-Defizienz kommt, konnte zuvor (4.1.5) bereits gezeigt werden. Somit scheint die Induktion von Hypoxie-responsiven Genen lediglich einen Nebeneffekt darzustellen. Gestützt wird dies durch die Analyse einer rap2.2 (nur Knockdown) x rap2.3 x rap2.12 x hre1 x hre2 Quintrupelmutante. Diese zeigt auf Keimlingsniveau keine Veränderung in der Zink-Toleranz (persönliche Kommunikation Dr. Michael Weber).

Die Häufung von induzierten Genen im GO-Term „Antwort auf Chitin“ konnte nur in acd5-2 unter Zink-Stress gefunden werden (Abb. 20C). Insgesamt zehn Gene fielen in diese Kategorie. Darüber hinaus waren auch zwei dieser Gene unter den zehn am stärksten in acd5-2 unter Zink-Stress induzierten Genen zu finden. Einmal AT1G49900, welches unter den Chitin-responsiven Genen am stärksten induziert ist. Dabei handelt es sich um ein Protein der Familie der C2H2-Zink-Finger-Proteine über das noch nichts weiter bekannt ist. Das zweite Gen ist ZAT7. ZAT7 besitzt eine ERF-associated amphiphilic repressio (EAR) Domäne. Von ZAT-Proteinen mit dieser Domäne wird vermutet, dass sie eine wichtige Rolle bei der Antwort auf abiotischen Stress spielen (Kazan 2006;

Ohta et al. 2001). Zu dieser Gruppe zählt zum Beispiel auch ZAT12. Ursprünglich wurde es als Bestandteil der Licht-Stress-Antwort gefunden (Iida et al. 2000). Es ist aber auch an der Antwort auf Kälte- und Hitze-Stress sowie auf osmotischen und oxidativen Stress beteiligt (Davletova et al. 2005).

Ein weiteres Protein dieser Gruppe ist ZAT10. Es ist an der Salz-, Trocken- und Kälte-Stress-Antwort beteiligt. Dabei inhibiert es die Transkription von Reportern und Genen der Abwehr (Sakamoto et al.

2004). Auch ist bereits ein ZAT-Gen bekannt, das an der Schwermetall-Homöostase beteiligt ist.

ZAT11 inhibiert die Transkription eines vakuolären Ni²⁺-Transporters. Überexpressionslinien von ZAT11 führen somit zu einer reduzierten Ni²⁺-Toleranz (Liu et al. 2014). ZATs sind also wichtige Bestandteile der Antwort auf abiotischen Stress, darunter auch auf Schwermetall-Stress. Eine

116 veränderte Expression von ZAT-Genen in acd5-2 könnte also eine mögliche Ursache für die Zink-Hypersensitivität in acd5-2 sein.