Konstruktion einer rel-Mutante

Größe von 182 und 172 Aminosäuren und zeigen Homologie zu eukaryotischen Proteinen.

Da sie jedoch nur eine HDc-Domäne besitzen und ihnen die zentrale RelA_SpoT Domäne fehlt, kann es sich bei diesen Proteinen nicht um (p)ppGpp-Synthetasen handeln.

Somit besitzt So ce56 mit hoher Wahrscheinlichkeit nur eine (p)ppGpp-Synthetase Namens Rel.

Das relint-Fragment wurde mittels PCR aus der chromosomalen DNA von So ce56 amplifiziert. Hierzu wurden die primer relint⁺ und relint^- verwendet. Das 850 bp große amplifizierte interne Stück des rel–Gens (Abb.4.5.) wurde anschließend in den Vektor pGemT-Vektor^® kloniert.

Der Vektor ist Bestandteil des pGem^®-T easy Vector System der Firma Promega und eignet sich für eine Klonierung von blunt end PCR-Produkten. Im nächsten Schritt wurden die potentiellen Klone per PCR mit den primern relint+ und relint- überprüft.

Die Plasmid-DNA der potentiellen Klone wurde durch zusätzliche Restriktionen und durch Sequenzierung überprüft.

4.2.2. Klonierung des Konjugationsplasmids pSupHyg

Aus dem pGem:relint Plasmid wurde mit Hilfe der Enzyme SphI und PstI das interne Stück von rel ausgeschnitten und das anschließend erhaltene Fragment wurde mit dem Klenow Enzym behandelt. Das interne Stück des rel-Gens wurde in den zuvor mit HindIII und BamHI geschnitten und Klenow behandelten pSupHyg-Vektor (Abb. 4.6.) ligiert. Der Vektor pSupHyg besitzt eine Größe von 8233 bp und enthält eine Hygromycin und eine Tetrazyklin-Kassette (Pradella et al., 2002).

pSupHyg

8233 bp

Hygromycin R

aphII-promotor

IS1 Tn9

p15a ori

Tetracyklin R oriT aus Rp4

Chloramphenicol

Abb. 4.6.: Graphische Darstellung des Vektors pSupHyg: Der Vektor enthält eine Hygromycin, eine Tetrazyklin und eine nicht vollständige Chloramphenicol-Kassette. Zusätzlich verfügt der Vektor über einen p15a ori (origin of replication) und ein IS1 Tn9 und einen aphII Promoter.

Die integrierte Kassette im pSupHyg-Vektor, enthält das Hygromycin-Resistenzgen von Streptomyces hygroscopicus. Hygromycin (Hyg) wird als Selektionsantibiotikum in So ce56 verwendet. Der oriT dient der Mobilität, der aphII als

Promotor für das hyg-Gen (Pradella et al., 2002). Dieser aphII Promotor wurde vor das hyg-Gen kloniert, da man in Vorversuchen gesehen hatte, dass So ce56 diesen Promotor erkennt. Bei dem Vektor pSupHyg handelt es sich um einen tra-negativen (Transferregion;

Operon) aber mob-positiven (Mobilisierungsgene; nic/bom-Region) Vektor Abb. 4.7. zeigt den pSupHyg-Vektor mit dem internen relint-Fragment.

pSupHyg:relint

8770 bp aphII-promotor

IS1 Tn9

p15a ori Hygromycin R

relint-Fragment oriT aus Rp4

Chloramphenicol

Abb. 4.7.: Graphische Darstellung von pSupHyg:relint; Größe: 8770 bp

Die nach der Transformation in E. coli DH5α erhaltenen Plasmide wurden mit Hilfe von PCR und Testrestriktionen überprüft und anschließend sequenziert. Es konnte ein richtiger pSupHyg:relint Klon identifiziert werden.

4.2.3. Konjugation in So ce56

Die Konjugation beschreibt den gerichteten Gentransfer von Plasmiden aus einer Spenderzelle in eine entsprechende Empfängerzelle. Besitzen die mobilen Elemente bestimmte Gene, die zum Transfer notwendig sind, werden sie als konjugativ bezeichnet.

Diese Gene sind im tra-Genkomplex lokalisiert. Weiterhin verfügen konjugative Elemente über Mobilisierungsgene (mob) und den origin-of-transfer (oriT)-Bereich, an dem die Mobilisierungsproteine binden und anschließend den für die Übertragung notwendigen Einzelstrangbruch durchführen.

Um eine Konjugation in So ce56 vorzunehmen, wurde das konstruierte pSupHyg:relint Plasmid in den E. coli Stamm ET12567pUB307 (tra-positiv, mob-positiv) (Pradella, 2002) transformiert. Mit Hilfe von ET12567pUB307 kann die Konjugation mit der Empfängerzelle durchgeführt werden.

Es wurde eine biparentale Konjugation vorgenommen. Nach 10 Tagen Inkubation konnten die ersten potentiellen Mutanten von der Konjugationsplatte gepickt werden. Zur weiteren Analyse wurden zwei Klone in nährstoffreichem Medium angeimpft, die chromosomale DNA isoliert und anschließend durch PCR überprüft. Hierzu wurden die internen primer relint+ und relint-, sowie die upstream liegenden primer rel4 und reldown und die downstream liegenden rel2 und relup verwendet.

Abb. 4.8.: Schema der rel-Region mit primer-Positionen

Tabelle 4.2.: primer-Kombinationen mit den erwarteten PCR-Produktgrößen Erwartung

Primer So ce56 Soce:relint

relint + Kontrolle: keine Bande Kontrolle: keine Bande relint- Kontrolle: keine Bande Kontrolle: keine Bande rel2 Kontrolle: keine Bande Kontrolle: keine Bande rel4 Kontrolle: keine Bande Kontrolle: keine Bande

rel2 und rel4 1000 bp -

rel2 und relint- 987 bp 987 bp

relint- und relint+ 827 bp 827 bp

rel4 und relint+ 987 bp 987 bp

Das Ergebnis der PCR-Analyse wurde über eine elektrophoretische Auftrennung auf einem 1% Agarosegel analysiert (Abb.4.9.)

1 433 2000 2175 3000

rel2 relint+

relint- rel4

1260 1500

-972

relup reldown

rel-Gen

1. So ce56: relint+ 7. So ce56: rel2 13. So ce56 : rel2 + rel4 19. So ce56 : relint- + relint+

2. Soce:relint 1: relint+ 8. Soce:relint 1: rel2 14. Soce:relint 1: rel2 + rel4 20. Soce:relint 1: relint- + relint+

3. Soce:relint 2: relint+ 9. Soce:relint 2: rel2 15. Soce:relint 2: rel2 + rel4 21. Soce :relint 2: relint- + relint+

4. So ce56: relint- 10. So ce56: rel4 16. So ce56: relint- + rel2 22. So ce56: relint+ + rel4 5. Soce:relint 1: relint- 11. Soce:relint 1: rel4 17. Soce:relint 1: relint- + rel2 23. Soce:relint 1: relint+ + rel4 6. Soce:relint 2: relint- 12. Soce:relint 2: rel4 18. Soce:relint 2 : relint- + rel2 24. Soce:relint 2 : relint+ + rel4

Abb. 4.9.: 1%iges Agarosegel der PCR-Analyse auf chromosomaler DNA potentieller rel-Mutanten in So ce56. Als Marker wurde der 1 kb DNA ladder von Fermentas verwendet.

Um die unspezifischen Banden von der amplifizierten Bande zu unterscheiden, wurden als Kontrolle die Primer einzeln eingesetzt. Tatsächlich amplifizierten die primer relint+, rel2 und rel4 mit chromosomaler DNA unspezifische Fragmente. Ignoriert man die unspezifischen Banden lässt sich erkennen, dass beide Mutanten richtig sind. Die primer-Paarung rel2 und rel4 zeigt im Wildtyp das erwartete Fragment von 1000 bp (Spur 13).

Dieses Fragment konnte in den Mutanten nicht amplifiziert werden (Spuren 14 und 15).

Des Weiteren wurden Kontrollen unternommen, die auch mit chromosomaler DNA der Mutanten eine Amplifikation erlauben sollten. Die Kombination rel2 und relint- sollte sowohl im Wildtyp und auch in der Mutante ein 987 bp großes Fragment erzeugen (Spuren 16-18). Das erwartete Fragment konnte in allen Proben amplifiziert werden. Die Kombination relint+ und relint- zeigte wie erwartet sowohl im Wildtyp, wie auch in den beiden Mutanten die erwartete Bande von 827 bp (Spuren 19-21). Die letzte Kontrollreaktion bildete die primer-Kombination relint+ und rel4, auch in diesem Fall konnten die erwarteten Fragmente von 987 bp sowohl im Wildtyp, wie auch in der Mutante amplifiziert werden (Spuren 22-24). Für alle weiteren Versuche wurde die erste Mutante verwendet. Die Mutante wird im Weiteren als Soce:relint bezeichnet.