Plasmid-Isolierung

Die entsprechenden E. coli-Kulturen werden, für die Konjugation, über Nacht in LB-Medium kultiviert und am nächsten Tag mit einer OD600nm von 0,2 in 10 ml LB angeimpft und bei einer OD600nm von 0,8 geerntet. Die geernteten Zellen werden einmal in frischem LB-Medium gewaschen und anschließend auf eine Dichte von 10¹⁰ Zellen ml^-1 konzentriert.

S. cellulosum wird für 2-3 Tage in 50 ml P- und M-Medium kultiviert. Für die Konjugation wird die Kultur, bei einer Zelldichte von 5x10⁸ ml^-1-10⁹ Zellen ml^-1 geerntet. Das S.

cellulosum Pellet wird vor der Konjugation zweimal in P- bzw. M-Medium gewaschen und anschließend auf eine Zelldichte von 10¹⁰ Zellen ml^-1 konzentriert. Diese Suspension wird jeweils mit 100 µl der zur Verfügung stehenden, E. coli-Kulturen vermischt. Nach dem gründlichen Mischen der Kulturen werden diese auf eine P-Agarplatte getropft und zum Konjugieren für 40 Stunden bei 37 °C inkubiert. Anschließend werden die Zellen in 1ml P-Medium aufgenommen und resuspendiert. Jeweils 350 µl Suspension werden auf P-Platten mit Hygromycin ausgestrichen. Es bilden sich orangefarbene Kolonien nach bis zu 10 Tagen Inkubation bei 32 °C. Diese werden in 5 ml M-Medium angeimpft und durch PCR überprüft.

3.2. Standardtechniken für das Arbeiten mit Nukleinsäuren

unterscheiden kann. Abhängig vom jeweiligen origin of replication unterscheidet man zwischen high copy Plasmiden mit 300 bis 1.000 Kopien pro Zelle, low copy Plasmiden, die mit weniger als 200 Kopien pro Zelle vorliegen und very low copy Plasmiden, deren Kopienzahl weniger als 10 pro Zelle beträgt.

3.2.2.1. Plasmid-Minipräparation

Hierbei wird DNA in kleinem Maßstab isoliert. Für die Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli werden 2 x 1,5 ml einer 5 ml Übernachtkultur für 1 min bei 13.000 rpm in einer Tischzentrifuge abzentrifugiert. Die sedimentierten Zellen werden in 100 µl kalter Lösung I durch vortexen oder vorsichtiges Auf- und Abziehen mit Hilfe der Pipette resuspendiert. Danach werden 200 µl Lösung II zugegeben, die Suspension 4 bis 6 Mal invertiert und 5 min auf Eis inkubiert. In dieser Zeit erfolgt die Lyse der Bakterienzellen, was an der zähen Konsistenz zu erkennen ist. Nach Zugabe von 150 µl Lösung III wird der Ansatz erneut geschüttelt. Es bildet sich weißer Niederschlag, der durch Zentrifugation bei 13.000 rpm für 15 min sedimentiert wird. Der Überstand, der die Plasmid-DNA enthält, wird in ein neues Eppendorfgefäß überführt und noch einmal erneut für 10 min bei 13.000 rpm zentrifugiert, um allen Niederschlag zu entfernen. Zum Überstand wird anschließend mit 1/10 Volumen (40 µl) 3 M Natrium-Acetat (pH 5,2) sowie 1 ml eiskalter, 100%iger Ethanol zur Fällung zugefügt. Der Ansatz wird in flüssigem Stickstoff schockgefroren oder für mindestens 30 min bei –20 °C inkubiert. Nach einer weiteren Zentrifugation für 15 min bei 13.000 rpm wird das Präzipitat mit 100 µl 70%igem Ethanol gewaschen und erneut für 5 min bei 13.000 rpm und 4 °C zentrifugiert. Die gefällte Plasmid-DNA wird für 3-5 min bei Raumtemperatur in der speed-vac getrocknet und danach in 50 µl ddH2O, EB- oder TE-Puffer aufgenommen.

3.2.2.2. Plasmid-Minipräparation nach Qiagen

Für die Plasmid-Minipräparation nach Qiagen wird das Protokoll für die Reinigung von Plasmid-DNA der Firma Qiagen und die in diesem Kit enthaltenen Puffer und Säulen verwendet. Das QIAprep Miniprep Verfahren basiert auf der alkalischen Lyse von Bakterienzellen durch selektive Adsorption von DNA unter Hochsalzbedingungen auf eine Silica-Gel Membran. Die Elution erfolgt mit Niedrigsalzpuffer.

Durchführung

Es werden 2 x 1,5 ml einer Übernachtkultur für je 3 min bei 13.000 rpm abzentrifugiert.

Die pelletierten Bakterienzellen werden dann in 250 µl Puffer P1 resuspendiert.

Anschließend erfolgt die Zugabe von 250 µl Puffer P2 und N3 wie in der Anleitung beschrieben. Die Suspension trübt sich und es bildet sich weißer Niederschlag. Der Ansatz wird dann 10 min bei 13.000 rpm zentrifugiert. Es formt sich ein kompaktes weißes Pellet.

Der Überstand, der die Plasmid-DNA enthält, wird auf eine spin column pipettiert, die sich in einem 2 ml Auffang-Gefäß befindet. Nach 30–60 sec Zentrifugation bei 13.000 rpm wird der Durchfluss verworfen, die Säule mit 500 µl PB Puffer beladen und erneut zentrifugiert. Auch dieser Durchfluss wird verworfen und es folgt ein weiterer Waschschritt mit 750 µl PE Puffer. Um verbliebene Puffer- und Ethanolreste zu entfernen, die ansonsten enzymatische Reaktionen (z.B, Restriktionen) inhibieren können, wird für weitere 60 sec zentrifugiert. Die Säule wird in ein sauberes 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt. Zur Elution werden 50 µl ddH2O, EB Puffer (10 mM Tris HCl; pH 8,5) oder TE-Puffer (10 mM Tris HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) genau in die Mitte der Membran platziert und nach einminütiger Inkubation wird für weitere 60 sec zentrifugiert. Um eventuell verbliebene Ethanolreste zu entfernen, wird die Probe anschließend für 2 min in der speed vac behandelt.

3.2.2.3. Plasmid-Minipräparation nach PeqLab

Für die Plasmidpräparation nach PeqLab wird das Protokoll für die Reinigung von Plasmid-DNA der Firma PeqLab und die in diesem Kit enthaltenen Puffer und Säulen verwendet.

Mit diesem Kit kann man aus 15 ml einer LB-Übernachtkultur bis zu 75 µg hochreiner Plasmid-DNA isolieren. Der E.Z.N.A.^® Plasmid Miniprep Kit 2 kombiniert eine modifizierte alkalische Lyse mit den selektiven und reversiblen DNA-Bindungseigenschaften von HiBind^®- Silikamembranen und der Schnelligkeit und leichten Durchführbarkeit von Zentrifugationssäulenmethoden.

Durchführung:

A) High Copy-Number Plasmide

Es werden 10-15 ml LB-Medium in einen 50 ml Kolben gefüllt und mit geeignetem Antibiotikum versetzt. Dieses komplettierte Medium wird mit den Bakterien angeimpft, die das gewünschte Plasmid enthalten und über Nacht bei 37 ^oC inkubiert.

Die Übernachtkultur wird am nächsten Tag durch Zentrifugation für 10 min bei 5.000 rpm in einem 15 ml Zentrifugenröhrchen pelletiert. Das Pellet wird durch sorgfältiges vortexen in 500-1000 µl Lösung I (enthält RNase A) resuspendiert. Die nun vorhandene Suspension wird in ein 2 ml Zentrifugenröhrchen überführt und mit 500-1000 µl Lösung II vermischt, bis ein klares Lysat entsteht. Im Notfall sollte 5 min bei RT inkubiert werden.

Das klare Lysat wird mit 700-1400 µl Lösung III versetzt und durch mehrmaliges Invertieren gemischt, bis sich ein weißes, flockiges Präzipitat bildet. Das Reaktionsgefäß wird anschließend für 10 min bei 10.000 rpm zentrifugiert.

Eine HiBind^®- Miniprep-Zentrifugensäule wird in ein 2 ml Auffanggefäß gesteckt und es werden vorsichtig 800 µl des klaren Überstandes in die Säule gefüllt, ohne dabei Teile des Pellets aus dem 2 ml Auffanggefäß zu übertragen. Es wird für 1 min bei 10.000 rpm zentrifugiert, bis das Lysat vollständig die Silikanmembran passiert hat. Der Säulendurchfluss wird verworfen. Mit dem restlichen Lysat wird genauso verfahren.

Anschließend wird die Zentrifugensäule in dass bereits verwendete 2 ml Sammel-Gefäß gesteckt und 500 µl HB-Puffer auf die Säule pipettiert. Es folgt eine einminütige Zentrifugation bei 10.000 rpm. Das zweite Waschen erfolgt mit 750 µl DNA-Waschpuffers. Diesen Schritt wiederholt man ein zweites Mal. Anschließend wird das Zentrifugensäulchen in das leere 2 ml Auffanggefäß gesteckt und durch einminütiges Zentrifugieren bei 13.000 rpm vollständig getrocknet.

Die DNA wird in 50-100 µl Wasser oder EB-Puffer (10 mM Tris HCl; pH 8,5) eluiert.