2.4 Einsatz nitratreicher Gemüseextrakte in Fleischerzeugnissen
2.4.2 Kennzeichnung und gesetzliche Grundlagen
Fleischerzeugnisse, die mit nitratreichen Gemüseextrakten hergestellt werden, werden in den USA als alternativ gepökelte (alternatively cured) oder natürlich gepökelte (naturally cured) Produkte beschrieben. Alternatives Pökeln beschreibt dabei Produkte, die Prozesse einschließen, bei denen Merkmale gepökelter Fleischerzeugnisse erlangt werden. Bei diesen Bezeichnungen handelt es sich jedoch nicht um Bezeichnungen mit gesetzlicher Grundlage.
Laut dem Food Standard and Labeling Policy Book der USDA (United States Department of Agriculture) ist der Einsatz von chemischen Zusatzstoffen und somit auch von Nitrat und Nitrit zur Herstellung von als „natürlich (natural)“
gekennzeichneten Fleischerzeugnissen nicht erlaubt (ANONYM 2016a).
LITERATURÜBERSICHT
Die Bezeichnung „uncured“ ist für ungepökelte Fleischerzeugnisse vorgesehen, die üblicherweise mit Nitritpökelsalz hergestellt werden (ANONYM 2016c).
Aufgrund dessen ist gemäß des Code of Federal Regulations für alternativ gepökelte Produkte eine genauere Kennzeichnung mit „kein Nitrat oder Nitrit enthalten, außer das natürlich in [Nitratquelle] vorkommende (No Nitrates or Nitrites Added, except those naturally occurring in…)“ eingeführt worden (ANONYM 2016b).
In Teilen der EU (z.B. in Frankreich und auch in Deutschland) setzen einige Hersteller bereits Gemüseextrakte zur Produktion von Fleischerzeugnissen ein.
Diese werden in den Produkten neben der Wirkung als Konservierungsmittel auch zur Farbstabilisierung und als Antioxidationsmittel verwendet. Mit Hinblick darauf urteilte das Bundesverwaltungsgericht Leipzig am 10.12.2015, dass nitratreiche Gemüseextrakte als zulassungspflichtige Lebensmittelzusatzstoffe einzustufen sind, für die eine Kennzeichnungspflicht besteht (Az.: BVerwG 3 C 7.14). Die nitrat- oder nitrithaltigen Gemüseextrakte wurden aufgrund ihres Einsatzes bei Fleischerzeugnissen aus technologischen Gründen von der Arbeitsgruppe Lebensmittelzusatzstoffe der EU-Kommission sowie dem ständigen Ausschuss für die Lebensmittelkette und Tiergesundheit der EU in die Gruppe der Zusatzstoffe eingestuft (ANONYM [o. Jahr]). Lebensmittelzusatzstoffe können nicht selbst als Lebensmittel verzehrt werden. Bei der Herstellung von Lebensmitteln dürfen nur zugelassene Zusatzstoffe verwendet werden. Diese Zulassung erfolgt nur, wenn der Stoff für die Herstellung technologisch erforderlich ist und in den üblicherweise verwendeten Mengen nicht gesundheitsschädlich ist (ANONYM 2008e).
Eine Zulassung entsprechend der VO (EG) Nr. 1333/2008 besteht derzeit allerdings nicht. Bezüglich der Bewertung von Fleisch- und Wurstwaren, die mit Gemüseextrakten hergestellt werden, sind sich die Lebensmittelüberwachungs-behörden der Bundesländer nicht einig. Für die Kennzeichnung von Fleischerzeugnissen, die unter Verwendung von Gemüseextrakten hergestellt wurden, bestehen bisher keine gesetzlichen Regelungen.
MATERIAL UND METHODEN
3 MATERIAL UND METHODEN 3.1 Übersicht
Brühwurste nach Art einer Mortadella der Spitzenqualität wurden mit Petersilienstängelextrakt produziert (V3-V5; Tab. 1). Zudem wurde eine konventionell erzeugte Variante mit Nitritpökelsalz (V1) sowie ein ungepökeltes Produkt unter Verwendung von Kochsalz (V2) hergestellt. Insgesamt wurden drei verschiedene Konzentrationen des Petersilienstängelextraktes getestet: V3 mit 1,07 g/kg Brät (30 ppm Nitrat), V4 mit 2,14 g/kg Brät (60 ppm Nitrat) sowie V5 mit 4,29 g/kg Brät (120 ppm Nitrat). Bei diesen Varianten wurde zusätzlich eine nitratreduzierende Starterkultur (Staphylococcus (S.) carnosus) zugegeben. Diese gewährleistet während der Herstellung der Produkte eine Umwandlung des im Petersilienstängelextrakt enthaltenen Nitrats in Nitrit.
Die Produktion der Brühwürste erfolgte in drei voneinander unabhängigen Versuchsdurchgängen (n=3), es wurden jeweils ca. 16 Würste pro Variante hergestellt. Am Tag nach der Produktion wurden die Würste in Scheiben geschnitten, unter Schutzatmosphäre verpackt und für 28 Tage bei 7 °C gelagert.
Während der Lagerzeit wurden mikrobiologische Untersuchungen auf die aerobe mesophile Gesamtkeimzahl (GKZ) sowie den Gehalt an Enterobakterien, Pseudomonaden, Laktobazillen und Listeria (L.) monocytogenes durchgeführt.
Die Produkte wurden physikalisch-chemisch auf L*a*b*-Farbwerte, freies Wasser (aw-Wert), pH, Textur sowie auf den Nitrit- und Nitratgehalt untersucht. Zudem erfolgte eine Kontrolle des Gasgehaltes in den Verpackungen. Die Produkte wurden durch ein semiprofessionelles Panel (Mitarbeiter des Instituts für Lebensmittelqualität und -sicherheit) sensorisch bewertet, um Aufschluss über die Akzeptanz der produzierten Brühwurstvarianten zu erhalten. Um den Einfluss des Petersilienstängelextraktes auf das Wachstum von L. monocytogenes zu untersuchen, erfolgte ein Inokulationsexperiment. Dazu wurden bei exakt gleicher Versuchsdurchführung zusätzlich aufgeschnittene Wurstscheiben vor dem Verpacken mit L. monocytogenes beimpft. Alle Proben wurden über 28 Tage bei
MATERIAL UND METHODEN
7 °C gelagert. Die Untersuchung der Proben erfolgte an den Tagen 1, 7, 14, 21 und 28.
Tabelle 1: Zusammensetzung der produzierten Brühwurstvarianten
Brühwurst-variante NPS NaCl Petersilien-extrakt / kg Brät
1 enthalten in der verwendeten Menge Petersilienstängelextrakt; : zugesetzt x: nicht zugesetzt
3.2 Materialien
3.2.1 Rohmaterial
Das Rind- und Schweinefleisch für die Herstellung der Brühwürste wurde 24 Stunden nach der Schlachtung von der Fa. Vasterling Viehhandels GmbH, Hannover bezogen und bei -18 °C tiefgefroren. Drei Tage vor der Produktion wurde das Fleisch bis zum Tag der Verwendung bei 2 °C schonend aufgetaut.
3.2.2 Gewürze und Zutaten
Die für die Brühwurstherstellung verwendeten Gewürze (weißer Pfeffer, Ingwer, Koriander, Mazis, Muskat und Knoblauchpaste, sowie Nitritpökelsalz, Kochsalz, Phosphat, Ascorbat, Zucker und Eis wurden von der Fa. Hannoversche Gewürzmühle, Hannover bezogen. Bis zur Verwendung am Produktionstag wurden die Gewürze, das Nitritpökelsalz, das Kochsalz, das Phosphat, das Ascorbat sowie der Zucker bei Zimmertemperatur gelagert.
3.2.3 Petersilienstängelextrakt und Starterkultur
Die Herstellung des Petersilienextraktes aus Petersilienstängeln erfolgte gemäß Abbildung 2 durch ein Unternehmen, das Gemüseextrakte und Gewürze herstellt.
MATERIAL UND METHODEN
Der Nitratgehalt des bräunlichen, süßlich-aromatisch riechenden Petersilienstängelextraktpulvers betrug 2,8 %. Das Extrakt wurde vakuumverpackt bei Zimmertemperatur gelagert. Die Starterkultur (S. carnosus) wurde bis zur Verwendung bei -20 ± 2 °C im Institut für Lebensmittelqualität und -sicherheit der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover gelagert.
MATERIAL UND METHODEN
Abbildung 2: Herstellung des Petersilienextraktes aus Petersilienstängeln
MATERIAL UND METHODEN
3.3 Brühwurstherstellung
Die Herstellung der Brühwürste nach Art einer Mortadella der Spitzenqualität erfolgte im institutseigenen Technikum. Je Variante wurden ca. 16 Brühwürste mit einem Gewicht von je 1 kg und einem Durchmesser von 60 mm hergestellt.
Die Rezeptur der Brühwurste beinhaltete 29 % mageres, sehnenarmes Schweinefleisch (S II), 17 % mageres, grob entsehntes Rindfleisch (R II), 24 % Rückenspeck (Schwein, S VIII) und 9 % Backe (Schwein, S IV). Außerdem wurden 21 % Eis, 0,3 % Phosphat, 0,1 % Ascorbat, 0,05 % Zucker, 0,3 % weißer Pfeffer, 0,04 % Ingwer, 0,03 % Koriander, 0,07 % Mazis, 0,03 % Muskat und 0,01 % Knoblauchpaste hinzugefügt. Der Variante V1 wurde 1,8 % Nitritpökelsalz (NaNO2
0,4-0,5 %) und den Varianten V2, V3, V4 und V5 jeweils 1,8 % Kochsalz (NaCl) zugesetzt.
Vor dem Kuttern wurde das Rind- und Schweinefleisch (R II und S II) mit einem Fleischwolf (Typ WD 114, Maschinenfabrik Seydelmann KG, Aalen, Germany) zerkleinert. Das gewolfte Fleisch, Teile der Schüttung (Eis), Kochsalz (V2, V3, V4, V5) bzw. Nitritpökelsalz (V1), Zucker, Phosphat und Ascorbat wurden in einem Kutter (Typ K 64 DC8 Q-VAK, Maschinenfabrik Seydelmann KG, Aalen, Germany) zerkleinert und vermischt. Nachfolgend wurden der Rückenspeck, die Backe, der Rest der Schüttung sowie die Gewürze hinzugegeben. Vor der Einmischung ins Brät wurde für die Herstellung der Varianten V3, V4 und V5 die entsprechende Menge Petersilienstängelextrakt in 200 ml destilliertem Wasser (Aqua dest.), sowie 25 g der nitratreduzierenden Starterkultur in 100 ml Aqua dest. gelöst (Abb. 2). Die Dosierung der Starterkultur erfolgte nach Herstellerangaben (25 g/100 kg Brät).
Das Petersilienstängelextrakt und die Starterkultur wurden dem Brät während des Mischungsvorganges beigefügt. Anschließend wurde das Brät bis zu einer Temperatur von etwa 14 °C gekuttert. Das Brät wurde nach dem Kuttern mit einem Vakuum-Wurstfüller (VF 608, Albert Handtmann Maschinenfabrik GmbH & Co. KG, Bieberach) in je nach Wurstvariante verschieden farblich gekennzeichnete Cellulose-Faserhüllen (®NaloTop, Ø 60 mm, Fa. Kalle GmbH, Wiesbaden) abgefüllt. In einem Kochschrank (Turbomat 1900/ FPC 100, FESSMANN GmbH und Co KG, Winnenden) wurden die Würste einer Haltezeit von 90 Minuten bei
MATERIAL UND METHODEN
40 °C zur bakteriellen Umwandlung von Nitrat in Nitrit unterzogen. Anschließend erfolgte die Erhitzung auf 72 °C Kerntemperatur. Die Kühlung der Würste erfolgte durch eine Kaltwasserdusche und die anschließende Lagerung über Nacht bei 2 °C.
Abbildung 3: Petersilienstängelextrakt (links) und Starterkultur (rechts), gelöst in Aqua dest.
3.4 Verpackung und Lagerung
Am Tag nach der Herstellung wurden die Brühwurste mit einer Aufschnittmaschine (Vertikalschneidemaschine VS 6; Bizerba GmbH & Co. KG, Balingen) in Scheiben von etwa 25 g (1 ± 0,2 cm Dicke) geschnitten. Jeweils drei Scheiben einer Wurstvariante wurden in eine geriffelte Tiefziehschale (Abb. 3; Maße:
227 mm x 178 mm x 30 mm; Volumen: 992 ml; ES-Plastic GmbH, Hutthurm) platziert und unter Schutzatmosphäre (30 % CO2, 70 % N2, ®Biogon C30, Linde AG, Pullach) mit einer Verpackungsmaschine (MULTIVAC T100; Sepp Haggenmueller GmbH & Co. KG, Wolfertschwerden) verpackt. Die Versiegelung der Tiefziehschalen erfolgte mit einer Oberfolie (Top Tray M/O a 47; Südpack, Ochsenhausen). Für jede Brühwurstvariante wurden insgesamt zehn Schalen, mit jeweils drei Scheiben (nachfolgend auch als Probe bezeichnet), hergestellt. Für jeden der Untersuchungstage (1, 7, 14, 21 und 28) wurden somit zwei Verpackungen einer Brühwurstvariante hergestellt und für die weiteren Untersuchungen bei 7 ± 0,2 °C dunkel gelagert.
MATERIAL UND METHODEN
Abbildung 4: Brühwurstscheiben in Tiefziehschalen
3.5 Untersuchungsmethoden
3.5.1 Physikalische Untersuchungen
An den Tagen 1, 7, 14, 21 und 28 erfolgte die Bestimmung des CO2 Gehaltes in den Verpackungen sowie die Bestimmung von Farbe, aw-Wert und pH-Wert der Proben. An Tag 1 erfolgte zudem die Messung der Texturparameter. Die Bestimmung des CO2 Gehaltes wurde vor dem Öffnen der MAP-Verpackung bestimmt. Farbmessung, pH-Wert und aw-Wert-Messung erfolgten nach Ablösung der Oberfolie der Verpackungen. Für die Texturanalyse wurden Würste verwendet, die am Tag zuvor produziert und über Nacht bei 2 °C gelagert wurden. Alle physikalischen Untersuchungen wurden an unbeimpften Proben durchgeführt.
CO2-Messung
Über den Lagerzeitraum wurden die MAP-Verpackungen der Brühwurstproben überprüft. Unter Verwendung eines Gasanalysators (CheckMate 9900 O2/CO2; PBI-Dansensor A/S, Ringsted, Dänemark) wurde der CO2-Gehalt der Packungen an den Tagen 1, 7, 14, 21 und 28 bestimmt. Auf die Oberfolie wurde vor dem Durchstechen mit der Messnadel ein selbstklebendes Kunststoffseptum (PBI-Dansensor A/S, Ringsted, Dänemark) aufgeklebt, um einen Gasverlust oder ein Einströmen von Luft während der Messung zu verhindern. Es erfolgte eine zweifache Bestimmung der Messwerte und Bildung des arithmetischen Mittels für jede Brühwurstvariante an allen Untersuchungstagen.
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Farbmessung
Die Farbmessungen wurden mithilfe eines Colorimeters (Chroma-Meter CR-400, KONICA MINOLTA, INC.; Osaka, Japan) nach dem CIELab Modell, eine Methode der Commission Internationale de l`Èclairage, durchgeführt (ANONYM 2012a). Jede Farbe wird in einem Farbraum mit den Koordinaten L* a* und b*
beschrieben, wobei L* die Helligkeitsachse (0 = Schwarz, 100 = Weiß), a* die Rot-Grün-Achse (positiv = Rot, negativ = Grün) und b* die Gelb-Blau-Achse (positiv = Gelb, negativ = Blau) beschreibt. An den Tagen 1, 7, 14, 21 und 28 erfolgte die Farbmessung auf der Oberfläche der Wurstscheiben. Es wurden insgesamt zwei Messwerte pro Wurstscheibe, also insgesamt sechs Messwerte je Packung erhoben. Aus diesen sechs Messwerten wurde der arithmetische Mittelwert für die jeweilige Verpackung berechnet.
aw-Wert-Messung
Der aw-Wert gibt die Menge an frei verfügbarem Wasser in Lebensmitteln an. An den Tagen 1, 7, 14, 21 und 28 der Lagerung wurde der aw-Wert aller Brühwurstvarianten mittels eines aw-Kryometers (AWK-10, Nagy Instruments GmbH, Gäuefelden), das den aw-Wert über den Gefrierpunkt einer Probe ermittelt, bestimmt. Für jede Probe erfolgte eine doppelte Bestimmung der Messwerte.
Diese Werte wurden zur Errechnung des arithmetischen Mittelwertes verwendet.
Mit einer 5 %igen Kochsalzlösung wurde die Messgenauigkeit des Gerätes vor der Verwendung überprüft.
pH-Wert-Messung
Nach dem Öffnen der Verpackungen wurden an den Untersuchungstagen 1, 7, 14, 21 und 28 jeweils zwei Scheiben beider Packungen einer Brühwurstvariante (zwei Proben einer Variante wurden gepoolt) entnommen und mit einer Messermühle (Grindomix GM 200, Retsch GmbH, Haan) bei 9000 U/min 3 Sekunden zerkleinert und homogenisiert. Mit einem tragbaren pH-Meter (Portamess®, Knick GmbH, Berlin), ausgestattet mit einer Einstichelektrode (Typ SE 104 N, Fa. Knick, Berlin) und einem Temperaturfühler, wurden die pH-Werte in der zerkleinerten Wurstmasse erhoben. Es erfolgte eine Zweifachmessung und Bildung der arithmetischen Mittelwerte für jede Brühwurstvariante. Das pH-Meter wurde vor der
MATERIAL UND METHODEN
Verwendung mithilfe von Pufferlösungen (pH-Werte 4 und 7) kalibriert. Zwischen den Messungen wurden der Temperaturfühler und die Glaselektrode mit Alkohol und destilliertem Wasser gereinigt.
Texturmessung
Für die Texturmessungen wurden zylindrische Teilstücke der Brühwürste mit einer Länge von 2,5 cm und einem Durchmesser von etwa 2,2 cm verwendet, die mithilfe einer Stanze gewonnen wurden. Mittels eines Texture Analyzers (TA.XT.plus, Stable Micro Systems, Surrey, England) wurden die Probenstücke mit einer Geschwindigkeit von 48 mm/min zweifach komprimiert. Der Zielparameter Verformbarkeit betrug 60 %, der Auslösewert betrug 10 g. Unter Verwendung eines Stempels mit einem Durchmesser von 50 mm und einer Kraftmessdose mit 50 N (FA. SMS, StableMicro Systems, GB) wurden Härte, Kaufähigkeit, und Elastizität bestimmt. Härte bezeichnet dabei die Kraft, die benötigt wird, um die Probe zusammenzudrücken, die Kaufähigkeit beschreibt die Zeit, die benötigt wird, um eine Probe mit einer gleichmäßigen Kraft durch Kauen bis zu einer schluckbaren Größe zu zerkleinern (SALDAÑA et al. 2015a). Die Analyse erfolgte bei Raumtemperatur (22 ± 2 °C). Aus sechs Messwerten jeder Probe wurde der arithmetische Mittelwert für jeden Analyseparameter gebildet.
3.5.2 Mikrobiologische Untersuchungen
Alle Proben wurden während der Lagerung auf die aerobe mesophile Gesamtkeimzahl (GKZ, ISO 4833-1:2013), Enterobacteriaceae (ISO 4832:2006), Laktobazillen (ISO 15214:1998), Pseudomonas spp. (ISO 13720:2010) und qualitativ auf L. monocytogenes (ISO 11290-1:2005) untersucht (ANONYM 1998, 2005b, 2006, 2010, 2013a). Die Untersuchung der beimpften Proben auf L. monocytogenes wurde in Anlehnung an die ISO 11290-2:2005 durchgeführt (ANONYM 2005c). Für die Bestimmung der GKZ, Enterobakterien, Laktobazillen und Pseudomonaden wurde aus jeder Packung 10 g Probenmaterial in einen Stomacherbeutel (SEPARATOR 400 CURVED BLENDER BAG, Fa. GRADE PRODUCTS, Leicestershire, England) eingewogen und mit Natriumchlorid-Pepton-Lösung (NaCl, 8,5 g/l: Merck KGaA, Darmstadt; Pepton aus Casein, 1 g/l: Carl
MATERIAL UND METHODEN
Roth GmbH, Karlsruhe Merck KGaA, Darmstadt) auf 100 g aufgefüllt. Im Rahmen des Inokulationsversuches mit L. monocytogenes wurde eine beimpfte Scheibe (~25 g; 1 ± 0,2 cm) einer Packung (Probe) eingewogen und auf 250 g mit ½ Fraser Bouillon (Oxoid GmbH, Wesel) aufgefüllt. Nach der Homogenisierung (2 Minuten bei 200 Umdrehungen pro Minute) mit einem Stomacher (Stomacher® 400 Circulator, Seward Ltd, Wothing, England) wurden für die quantitativen Bestimmungen, dezimale Verdünnungsreihen angefertigt. Die Probenlösungen wurden auf die jeweiligen Selektivagarböden (s.u.) im Doppelansatz aufgetragen.
Nach der Bebrütung (s.u.) wurden die Petrischalen ausgezählt. Es erfolgte die Errechnung koloniebildender Einheiten/g Probe (log10 KbE/g). Die Hälfte der Nachweisgrenze (Pseudomonaden, Laktobazillen: 1,7 log10 KbE/g;
Gesamtkeimzahl, Enterobakterien: 0,7 log10 KbE/g) wurde für die Quantifizierung jener Proben verwendet, deren Ergebnisse sich unterhalb der Nachweisgrenze befanden.
Gesamtkeimzahl (ISO 4833-1:2013)
Die Bestimmung der Gesamtkeimzahl erfolgte an den Untersuchungstagen 1, 7, 14, 21 und 28. Mithilfe des Plattengussverfahrens wurden die Keimzahlen auf Standard-I-Agar (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) bestimmt. Die Bebrütung erfolgte für 72 Stunden bei 30 °C.
Enterobakterien (ISO 4832:2006)
Die Untersuchung auf Enterobakterien wurde an den Tagen 1, 7, 14, 21 und 28 auf VRBG (Violet Red Bile Glucose, Oxoid GmbH, Wesel) Agar unter Verwendung des Plattengussverfahrens mit Overlayer durchgeführt. Die Nähragarplatten wurden für 48 Stunden bei 37° C bebrütet.
Laktobazillen (ISO 15214:1998)
Die Bestimmung der Laktobazillen mittels Oberflächenspatelverfahrens erfolgte an den Tagen 1 und 28. Die Bebrütung der verwendeten MRS Agarplatten (Lactobacillus-Agar nach de MAN, ROGOSA und SHARPE, Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland) erfolgte mithilfe von Anaerobiertöpfen (OxoidTM AnaeroJarTM 2.5 L, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA) und einem
MATERIAL UND METHODEN
Anaerobierkit (OxoidTM AnaeroGenTM 3.5 L Sachet, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA) bei 30 °C für 72 Stunden.
Pseudomonaden (ISO 13720:2010)
Für die Untersuchung auf Pseudomonaden an Tag 1 und 28 wurden Cephalothin-Sodium Fusidate-Cetrimide (CFC) Nähragarplatten (Oxoid GmbH, Wesel) verwendet. Unter Durchführung des Oberflächenspatelverfahrens wurden die Nähragarplatten bei 25 °C für 48 Stunden bebrütet.
Qualitative Untersuchung auf Listeria monocytogenes (ISO 11290-1:2005)
Die unbeimpften Proben wurden an Tag 1 und 28 der Lagerung qualitativ auf L. monocytogenes untersucht. Nach Einwaage in einen Stomacherbeutel, Auffüllen mit ½ Fraser Bouillon (Verhältnis 1:10) und Durchmischung mit dem Stomacher wurden die Proben zunächst für 24 Stunden bei 30 °C inkubiert. Nachfolgend wurde 1 ml dieser Probenlösung in Fraser Bouillon (Oxoid GmbH, Wesel, Germany) überführt und für 48 Stunden bei 37 °C bebrütet. Anschließend wurde jeweils ein Tropfen dieses Mediums auf OCLA Agar und PALCAM Agar mithilfe einer Impföse ausgestrichen. Nach der Inkubation für 24 Stunden bei 37 °C wurden die Nähragarplatten auf das Vorhandensein von Kolonien überprüft.
3.5.3 Chemische Untersuchungen
Für die chemische Analyse der Brühwürste wurde an den Untersuchungstagen 1, 7, 14, 21 und 28 für jede Wurstvariante etwa 100 g der – für die pH-Wert-Messung gepoolten und zerkleinerten – Wurstscheiben in Siegelrandbeutel verpackt. Nach dem Vakuumieren wurden diese bis zur späteren Analyse bei -18 °C gelagert. Am Tag der Untersuchung wurden die Proben vor der Analyse bei Zimmertemperatur für etwa 30 Minuten aufgetaut.
Bestimmung von Nitrit und Nitrat
Die Bestimmung von Nitrit und Nitrat erfolgte an den Tagen 1, 7, 14, 21 und 28 der Lagerung in Anlehnung an die Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 64 LFGB, L 08.00-14 bzw. DIN EN 12014-3:2005 (ANONYM 2005a, 2008b).
MATERIAL UND METHODEN
Nitrit wurde, nach der Reaktion mit einem Reaktionsgemisch aus Sulfanilamid und N-(1-Naphtyl)-ethylen-diamindihydrochlorid zu einem roten Farbstoff, bei 540 nm photometrisch (Evolution 201, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA) bestimmt. Für die Bestimmung von Nitrat wurde Nitrat enzymatisch in Nitrit umgewandelt. Dazu wurde ein Testkit (Testkit “Nitrat”) der Firma Roche Diagnostics (über R-BIOPHARM, Darmstadt) verwendet. Der Nitritgehalt der Proben wurde vor und nach der Umwandlung von Nitrat in Nitrit bestimmt.
Anschließend wurde der Nitratgehalt rechnerisch ermittelt, indem der Nitritgehalt vor der enzymatischen Reduktion von dem „Gesamtnitrat-nitritgehalt“ nach der Umwandlung in Nitrit subtrahiert wurde. Für die photometrische Messung wurden die Proben nach der Homogenisierung und pH-Wert-Anpassung einer Hitzebehandlung im Wasserbad unterzogen. Um potentielle Kochverluste oder Hitzezerstörungen von Nitrit zu verhindern (SEN et al. 1979; RINCÓN et al. 2003), wurde die Siedetemperatur auf eine Temperatur von 80 °C reduziert. Die weiteren Arbeitsschritte wurden gemäß DIN EN 12014-3:2005 bzw. § 64 LFGB, L 08.00-14 durchgeführt. Am Untersuchungstag wurden Kaliumnitrat- und Natriumnitrit-Standardlösungen für die Umwandlung der gemessenen Extinktionen der Proben hergestellt. Mithilfe dieser Standardlösungen wurden Kalibrierungsgeraden für die Extinktionen in Abhängigkeit der Nitritkonzentration erstellt. Die Bestimmung von Nitrat und Nitrit erfolgte an den Tagen 1, 7, 14, 21 und 28 der Lagerung.
3.5.4 Inokulationsversuch mit Listeria monocytogenes
Abbildung 4 zeigt die Herstellung der Brühwurstvarianten, die Inokulation, die Verpackung und die Keimzahlbestimmung von L. monocytogenes.
Inokulation der Wurstscheiben
Für die Inokulationsversuche wurde ein Feldstamm der Klinik für Geflügel der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover verwendet (L. monocytogenes, Serovar 1/2a). Für jede Versuchswiederholung wurde eine Standard-I-Platte (Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) mit dem Keim beimpft und für 24 h inkubiert. Anschließend wurde eine Bakterienkolonie entnommen und in Brain Heart Infusion Bouillon (BHI, Merck KGaA, Darmstadt) überführt. Während der
MATERIAL UND METHODEN
Bebrütung bei 37 °C für 24 Stunden stiegen die Keimzahlen in der Bouillon auf etwa 108 Keime pro ml an. Die Beimpfung der Wurstscheiben erfolgte mit einer auf einen Keimgehalt von etwa 104 Keimen/ml eingestellten Bakteriensuspension. Für jeden der Untersuchungstage (Tag 1, 7, 14, 21 und 28) wurde der Inhalt zweier Packungen einer Brühwurstvariante, je drei Wurstscheiben, mit der Bakteriensuspension beimpft. Ein Inokulum von 0,1 ml wurde mithilfe einer Luftpolsterpipette (Eppendorf AG, Hamburg) auf jede Scheibe gegeben und mit einem Kunststoffspatel gleichmäßig verteilt. Die Verpackung und Lagerung erfolgte wie für die unbeimpften Proben in Kapitel 3.4 beschrieben.
MATERIAL UND METHODEN
V1: traditionell gepökelt; V2: ungepökelt; V3: 1,07 g Petersilienstängelextrakt/kg Brät (PE/kg Brät);
V4: 2,14 g PE/kg Brät; V5: 4,29 g PE/kg Brät; NPS = Nitritpökelsalz, KS = Kochsalz
Abbildung 5: Herstellung der Brühwürste, Inokulation und Verpackung der Wurstscheiben und Keimzahlbestimmung von Listeria monocytogenes
MATERIAL UND METHODEN
Mikrobiologische Untersuchung der beimpften Proben
Die mit L. monocytogenes beimpften Proben wurden an den Tagen 1, 7, 14, 21 und 28 quantitativ gemäß ISO 11290-2:2005 auf OCLA sowie PALCAM Agar (beide Oxoid GmbH, Wesel, Germany) auf L. monocytogenes untersucht. Eine beimpfte Wurstscheibe (~25 g) jeder Packung wurde in einen Stomacherbeutel gegeben und mit ½ Fraser Bouillon im Verhältnis 1:10 aufgefüllt. Nach der Durchmischung (2 Minuten bei 200 Umdrehungen pro Minute) mit einem Stomacher (Seward, Thetford, England) wurde eine Verdünnungsreihe angefertigt.
Die Agarplatten wurden 48 Stunden bei 37 °C bebrütet. L. monocytogenes wurde auf OCLA Agar als blau-grüne Kolonien mit trübem Präzipitathof, auf PALCAM Selektivnähragar als schwarz-graue Kolonien identifiziert (Abb. 5).
Abbildung 6: Listeria monocytogenes auf OCLA Agar (A) und PALCAM Agar (B)
3.5.5 Sensorische Untersuchungen
Die sensorische Bewertung der Brühwurstvarianten erfolgte durch ein mit sensorischen Untersuchungen von Fleischerzeugnissen vertrautes, semiprofessionelles Panel (Mitarbeiter des Instituts für Lebensmittelqualität und -sicherheit, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover; Alter 18-48 Jahre) jeweils an Tag 4 nach der Produktion. Bis zum Untersuchungstag wurden die Würste bei 2 °C gelagert. Die Würste wurden in 1 ± 0,2 cm dicke Scheiben geschnitten (Abb. 6). Jeder Brühwurstvariante wurde eine zufällig ausgewählte dreistellige Nummer zugeordnet. Je eine Scheibe der fünf Brühwurstvarianten wurden den
A B
MATERIAL UND METHODEN
Prüfern in einem den Vorgaben der ISO 8589:2007 entsprechenden Prüfraum zur Bewertung zur Verfügung gestellt. Beurteilt wurden die rote und graue Farbe, die Festigkeit, die Salzigkeit, der Geschmack und das Aroma der verschiedenen Brühwürste. In Anlehnung an die ISO 4121:2003, bewerteten die Prüfer die Brühwurstvarianten mit einer Markierung auf einer 15 cm langen Skala. Eine Markierung bei 0 cm entsprach dabei einer Bewertung mit „keine Intensität“ und eine Markierung bei 15 cm entsprach „hohe Intensität“. Die Prüfer bewerteten zudem den Gesamteindruck (Akzeptanz) aller Brühwurstvarianten durch Bildung einer Rangordnung nach ISO 8587:2006.
Abbildung 7: Sensorische Beurteilung der Brühwurstvarianten
3.6 Statistische Analyse
Die statistische Auswertung der Untersuchungsergebnisse erfolgte mithilfe des SAS Enterprise Guide 5.1. (Statistic Analyzing Systems, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). Nach Durchführung einer mehrfaktoriellen Varianzanalyse (PROC GLM) wurden die gebildeten Residuen auf Normalverteilung getestet (PROC UNIVARIATE). Die Brühwurstvarianten wurden mittels einer one-way ANOVA (einfache Varianzanalyse) und eines REGWQ Tests analysiert. Die in dieser Arbeit berücksichtigten Faktoren waren die fünf verschiedenen Varianten (V1-V5) und die Untersuchungstage (1, 7, 14, 21 und 28 nach Produktion). Es wurde ein vergleichsbezogenes Signifikanzniveau gewählt, dabei wurden Differenzen mit P < 0,05 als signifikant angesehen. Gemäß ISO 8587:2006 wurde die durch die Prüfer gebildete Rangordnung des Gesamteindruckes mittels eines
Friedman-MATERIAL UND METHODEN
Tests ausgewertet. Signifikante Unterschiede wurden mittels eines Fishers Least Significant-Difference-Tests (LSD-Test) bestimmt.
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