2.3 Visualisierung von Lipid Droplets
2.3.1 Invasive Visualisierungsmethoden für Lipid Droplets
Um die genauen Funktionen und Mechanismen von LDs aufklären zu können, bieten sich vor allem mikroskopische Methoden an, bei denen die LDs durch Anfärbung mit fluoreszierenden Farbstoffen wie BODIPY 493/503 oder nicht fluoreszierenden Farbstoffen wie Oil Red O [167] sehr einfach visualisiert werden können [168].
Fluoreszenz entsteht dadurch, dass fluoreszierende Substanzen, die auch als Fluorophore bezeichnet werden, in der Lage sind, aufgenommene Energie in Form von messbarer Stahlung abzugeben. Dies lässt sich am besten anhand des so genannten Jablonski-Diagramms erklären (siehe Abbildung 2-11).
Abbildung 2-11 Schematische Darstellung des Jablonski-Diagramms.
Durch Absorption einer von außen einwirkenden elektronischen Anregungsenergie werden die Moleküle von einem energetischen Grundzustand (S0) in einen elekronisch angeregten Zustand (S1) versetzt. Dieser Prozess findet in einer Größenordnung von etwa 10-15 s statt. Das für jedes Molekül charakteristische Absorptionsspektrum bzw.
Emissionsspektrum ergibt sich daraus, dass die beiden elektronischen Zustände aufgrund von vibronischen Zuständen energetisch weiter aufgespalten werden, wobei deren Besetzungswahrscheinlichkeiten durch die Franck-Condon-Faktoren beeinflusst werden.
Da die Fluoreszenz nahezu ausschließlich aus dem Grundzustand von S1 erfolgt, ist das Aussehen der Emissionsspektren unabhängig von der eigentlichen Anregungswellenlänge.
Außerdem besitzen Absorptions- und Emmisionspektren eine ausgeprägte Spiegelsymmetrie, da die vibronischen Zustände im S0- und S1-Zustand sehr ähnlich sind.
Wurde das Molekül durch die Absorption in einen höheren vibronischen Zustand von S1
versetzt, kommt es innerhalb einer Zeitskala von 10-12 s zu einer schnellen strahlungslosen Relaxation (Internal Conversion, IC) in den Grundzustand von S1, Von dort benötigt die Rückkehr in den Grundzustand vom S0–Zustand über Fluoreszenz ca. 10-9 s. Dieser Prozess findet im längerwelligeren Bereich als die eigentlich Absoprtion statt, weil immer ein gewisser energetischer Verlust auftritt. Diese energetische Verschiebung wird nach seinem Entdecker als Stokes-Shift bezeichnet.
Neben der Fluoreszenz kann das Molekül zur Energieabgabe auch in den Triplettzustand übergehen, was als Inter System Crossing (ISC) bezeichnet wird. Dieser Übergang dauert ca. 10-6 s, ist allerdings aufgrund der Auswahlregeln für elektronische Übergänge eigentlich spinverboten. Kommt es von diesem Zustand zu einer Emission eines Photons, spricht man von Phosporeszenz.
Zur Berechnung vieler Prozesse, welche bei der Fluoreszenz auftreten, sind in erster Linie die Fluoreszenzquantenausbeute sowie die Fluoreszenzlebenszeit entscheidend. Die Fluoreszenzquantenausbeute ist dabei das Verhältnis zwischen emittierten und absorbierten Photonen. Die Quantenausbeute gibt also an, wieviel der absorbierten Energie in Form von Fluoreszenz abgegeben wird:
𝜙𝐹 = 𝐴𝑛𝑧𝑎ℎ𝑙 𝑒𝑚𝑖𝑡𝑡𝑖𝑒𝑟𝑡𝑒𝑟 𝑃ℎ𝑜𝑡𝑜𝑛𝑒𝑛
𝐴𝑛𝑧𝑎ℎ𝑙 𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑖𝑒𝑟𝑡𝑒𝑟 𝑃ℎ𝑜𝑡𝑜𝑛𝑒𝑛 = 𝑘𝐹 𝑘𝐹+𝑘𝑛𝑟 Hierbei ist: ФF: Fluoreszenzquantenausbeute
kF: radiative Zerfallsrate knr: strahlungslose Zerfallsrate
Die Fluoreszenzlebenszeit hingegen gibt die Dauer an, die ein Molekül durchschnittlich im angeregten Zustand verbleibt und ergibt sich aus dem Kehrwert der Zerfallsraten:
𝜏𝐹= 1 𝑘𝐹+𝑘𝑛𝑟
Hierbei ist: 𝜏F: Fluoreszenzlebenszeit
Will man nun die Fluoreszenz zur Visualisierung von LDs verwenden, so bietet der Einsatz von lipophilen Fluoreszenzfarbstoffen dafür eine einfache und gleichzeitig effiziente Möglichkeit. Eine Alternative zur direkten Farbstoffzugabe besteht in der Verwendung von Fettsäuren, die mit einem Farbstoff verknüpft sind und die in dieser Form verfüttert werden können.
Abbildung 2-12 Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen von mesenchymalen Stammzellen, die sich in der adipogenen Differenzierung befinden. Grün: LD-Färbung mit BODIPY 493/503; Rot: Färbung der Zellmembran mit Cell mask Deep Red; Blau: Färbung des Zellkerns mit Syto 82. Scale bar: Oben: 30 µm, unten: 10 µm.
Ein erheblicher Vorteil der Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen zur LD-Untersuchung besteht darin, dass es in der klassischen Fluoreszenzmikroskopie sehr einfach ist, gleich mehrere verschiedene intrazelluläre Kompartimente anzufärben, um diese simultan zu visualisieren und dadurch Zusammenhänge zwischen diesen einzelnen Kompartimenten aufzuklären. So ist in Abbildung 2-12 z.B. neben den LDs auch noch der Zellkern sowie die Zellmembran der beobachteten Zellen angefärbt, was einen schnellen Überblick über die gesamte Zellstruktur ermöglicht.
Neben der direkten LD-Färbung durch Zugabe von fluoreszierenden Substanzen können auch LD-assoziierte-Proteine mit dem Grün fluoreszierenden Protein (GFP) oder dessen Derivaten markiert werden, wobei deren Expression einen Einfluss auf das natürliche Verhalten der LDs ausüben kann.
Neben den eminenten Vorteilen von Fluoreszenzfarbstoffen, die vor allem in ihrer einfachen Handhabung und ihrer Spezifität bestehen, ist der Einsatz solcher Farbstoffe aber auch mit einigen Nachteilen verbunden. So kommt es durch die Einfärbung unweigerlich zu einem Eingriff in die natürliche biologische Struktur, bei welchem sich schwer abschätzen lässt, inwiefern dieser Eingriff natürliche Vorgänge verfälscht. In einem späteren Kapitel dieser Arbeit (siehe Kapitel 3.1) wird eine solche Verfälschung genauer beschrieben, bei welcher es durch den Farbstoff und die parallele Laserbestrahlung zu induzierten Artefakten kommen kann. Außerdem wird der Einsatz von Fluoreszenzfarbstoffen dadurch limitiert, dass es mit der Zeit zu einem unvermeidlichen Ausbleichen der Farbstoffe kommt.
Will man einen bestimmten Zeitpunkt eines Vorganges, an dem LDs beteiligt sind, genauer analysieren, kann man die Zellen vor der Mikroskopie fixieren. Dies wiederum führt zu der Problematik, dass die im Kern der LDs gespeicherten Lipide durch die Aldehydbehandlung nicht fixiert werden, so dass es nicht einfach ist, die natürliche Form der LDs zu konservieren [11]. Aus diesem Grund erscheinen LDs bei histologischen Schnitten und anschließender HE-Färbung als quasi nicht vorhandene Struktur, da die Lipidester durch organische Lösungsmittel während der Dehydrierung entfernt werden [31], wohingegen das umgebende proteinreiche Cytoplasma fixiert wird. Dadurch wird die Struktur der LDs wie ein Negativabdruck zurück gelassen [11].
Neben der Anfärbung mit Farbstoffen hat sich auch die Elektronenmikroskopie als hilfreiche Methode zur Untersuchung von LDs etabliert, wobei sich die Probenpräparation als relativ problematisch erweist und die gleichen Fixierungsartefakte auftauchen, die zuvor schon beschrieben wurden. Der große Vorteil der Elektronenmikroskopie ist allerdings, dass sich dabei auch sehr kleine Strukturen und damit auch sehr kleine LDs (<100 nm) darstellen lassen, während bei der klassischen Mikroskopie aufgrund des
Auflösungsvermögens die LDs größer als ca. 200-300 nm sein müssen, um sie voneinander abgrenzen zu können.