Analyse der intrazellulären LD-Mobilität in dreidimensionaler Zellkultur

Die Kultivierung von Zellen und deren mikroskopische Untersuchung gehört inzwischen zu den Standardmethoden der Biologie und ist sehr etabliert. Meistens werden dabei die adhärenten Eigenschaften von Kulturflaschen bzw. Mikroskopieschälchen ausgenutzt, um die Zellen daran anheften zu lassen. Dabei kommt es zu einer Bindung zwischen der Oberfläche und den Zellen, welche so stark ist, dass die Zellen bei eventuellen Waschschritten und dem regelmäßig stattfindenden Mediumaustausch nicht weggespült werden. Andererseits ist es den Zellen aber noch möglich, auf der Oberfläche zu migrieren. Diese Kultivierungsart ist wohl die am häufigsten verwendetet Methode und kann bei nahezu allen Zellarten angewendet werden, mit Ausnahme von solchen Zellen, die nicht adhärent sind und daher in Suspension gehalten werden müssen.

Obwohl diese zweidimensionale Kultivierung eine Reihe von Vorteilen mit sich bringt, sollte man dabei doch bedenken, dass es sich hierbei um ein Modell handelt, das in dieser Art sicher nicht in vivo vorkommt. Vielmehr wachsen Zellen in einem menschlichen Körper oder einem sonstigen Organismus in einer dreidimensionalen Struktur, das heißt, die Interaktionsfläche zwischen einzelnen Zellen ist wesentlich größer und die Zellen weisen zudem eher eine sphärische Struktur auf. Im Gegensatz dazu werden die Zellen auf einer zweidimensionalen Oberfläche dazu gezwungen, sich in extremer Weise auf dem Boden auszubreiten. Neben ihrer unnatürlichen Form müssen die Zellen auf einer zweidimensionalen Oberfläche zudem auch noch mit einer extrem herabgesetzten Elastizität zu Recht kommen [205]. So ist die natürliche Zellumgebung rund 100.000fach elastischer als sie in üblichen Zellkulturbedingungen erreicht werden kann². Diese herabgesetzte Elastizität lässt sich umgehen, indem man spezielle Oberflächen verwendet, welche exakt der natürlichen Elastizität in natürlicher Zellumgebung entsprechen. Ein anderer Ansatz, welcher zudem auch den anderen genannten Nachteil, die nicht natürliche Form der Zellen, umgeht, besteht in dem Einsatz von dreidimensionalen Zellkulturen. Bei dieser Methodik kreiert man gewebeähnliche Strukturen, indem man die Zellen in einer dreidimensionalen Struktur wachsen lässt. Dies

2 Produktinfo der Firma Ibidi zu ihrem Produkt µ-Dish, ESS (Elastically Supported Surface), entnommen von www.ibidi.de im September 2012

kann dadurch erreicht werden, dass man eine künstliche Matrix erschafft, in welcher die Zellen proliferieren können. Etabliert hat sich in diesem Zusammenhang besonders der Einsatz von sogenannten Hydrogelen. Dabei wird die Zellsuspension mit dem Hydrogel vermischt und dann in einer künstlichen Gussform auspolymerisiert, so dass sich die Zellen in sämtliche Ebenen ausbreiten können. Um die Proliferation und Migration der Zellen dabei nicht einzuschränken, kann man ein solches Hydrogel dergestalt erzeugen, dass die Zellen in der Lage sind, dieses teilweise zu verdauen und sich so einen Weg durch das Gel zu bahnen.

Eine weitere, immer häufiger eingesetzte Methode ist die so genannte Hanging-Drop- Methode, welche über den Vorteil verfügt, dass sie ganz ohne invasive Zusätze auskommt. Die dreidimensionale gewebebildende Struktur wird dabei allein durch die Gravitationskraft erzeugt und zwar dadurch, dass man die Zellsuspension als hängenden Tropfen kultiviert. Dadurch sammeln sich die Zellen am Boden des Tropfens und strukturieren sich aufgrund der dort vorhandenen Krümmung selbstständig zu einer spheroidalen Struktur (siehe Abbildung 3-20).

Abbildung 3-20 Prinzip der Hanging-Drop-Methode³ und selbst generierter Spheroid aus HeLa S3-Zellen (Scalebar: 200 µm).

Eine interessante Fragestellung wäre nun, ob sich das intrazelluläre Transportverhalten in einer solchen dreidimensionalen Kultur von dem im vorherigen Kapitel untersuchten Verhalten in normaler adhärenter Kultur unterscheidet. Abgesehen davon, dass sich dabei LDs natürlich deutlich mehr entlang der z-Achse bewegen sollten, wäre es auch denkbar, dass sich andere Geschwindigkeitsprofile ergeben, da die Bewegung vielleicht nicht mehr so stark durch die Zellmembran beeinflusst wird.

So stehen die meisten LDs in zweidimensionaler Zellkultur vermutlich so gut wie permanent in direktem Kontakt mit der Zellmembran, weil die Zelle sich sehr flach auf der

3 Schema entnommen von http://www.insphero.com im November 2012

Oberfläche ausbreitet. In dreidimensionaler Zellkultur befänden sich hingegen sehr viel mehr LDs in der Mitte der Zelle und somit nicht mehr in direkter Nähe zur Zellmembran.

Auch das Cytoskelett könnte in dreidimensionaler Kultur einen anderen Einfluss auf die Beweglichkeit der LDs haben als in adhärenter Kultur.

Zur Beantwortung dieser Fragen wurden mit Hilfe der Hanging-Drop-Methode große spheroidale Strukturen aus HeLa S3-Zellen erzeugt. Nach wenigen Tagen wurden diese dann geerntet und in ein Mikroskopierschälchen mit Glasboden überführt. Darin wurden die Zellen dann noch einmal für mehrere Stunden oder über Nacht inkubiert, um eine partielle Anheftung des gesamten Spheroids an die Oberfläche zu erreichen, da die unterste Zellschicht des Spheroids zu adhärieren beginnt. Dies war von Vorteil, da sich ansonsten der Spheroid während der Messung auch als Ganzes bewegen kann, was die anschließende Bewegungsanalyse der LDs erschwert. Anschließend wurden CARS-Messungen an dem Spheroiden durchgeführt. Dabei konnte beobachtet werden, dass auch in diesem Fall bereits eine ausreichend große Menge an LDs in den einzelnen Zellen vorhanden war (siehe Abbildung 3-21), so dass auch hier eine Inkubation mit Oleinsäure nicht erforderlich war.

Abbildung 3-21 Visualisierung und dreidimensionale Bewegungsanalyse von LDs in einem HeLa-Spheroid mit Hilfe der CARS-Mikroskopie. Scale bar 30 µm. Rechts unten: Vergrößerte und gedrehte Ansicht, Scale bar: 15 µm.

Aufgrund der Streuung des Laserlichts wegen der Größe des Gebildes und der Vielzahl der Zellen war es jedoch nur möglich, die untersten zwei bis drei Zellschichten abzubilden. An diesen Zellen konnten dann aber wie im vorherigen Kapitel Trajektorien der LDs aufgenommen werden, wobei hierbei die zeitliche Auflösung etwas eingeschränkt war, weil zusätzlich z–stacks aufgenommen werden mussten, um eine dreidimensionale Analyse zu ermöglichen.

Wie schon bei der Analyse der zweidimensionalen Transportvorgänge wurde auch in diesem Fall die LD-Mobilität hinsichtlich der maximalen Geschwindigkeit sowie der Verschiebungslänge analysiert. Dabei konnte jedoch kein nennenswerter Unterschied zum Bewegungsverhalten in zweidimensionaler Zellkultur festgestellt werden (siehe Abbildung 3-22).

Abbildung 3-22 Verteilung der maximalen Geschwindigkeiten von LDs in einer dreidimensionalen Zellkultur.

3.2.4 LD-Wachstum während der Differenzierung von humanen