Integrale Membranproteine in der äußeren Membran von Gram- Gram-negativen Bakterien

Bakterien unterscheiden sich im Aufbau ihrer Zellwand. Dies stellte 1884 schon Hans Christian Gram fest, der einen Farbstoff auf Bakterien gab, welcher sich nur von manchen wieder abwaschen ließ, woraus er die Unterteilung in Gram-positive und Gram-negative Bakterien ableitete.^[106] Gram-negative Bakterien besitzen eine innere und äußere Zellwand. Die innere Membran ist symmetrisch aus Phospholipiden aufgebaut, welche auf der Außenseite vom Periplasma umschlossen ist (Abb.

26). Das Periplasma besteht aus Peptidoglycanen, d.h. Polysacchariden, die durch kurze Peptide miteinander verknüpft sind.^[107] Die äußere Membran ist unsymmetrisch aufgebaut, da sie auf der Innenseite Phospholipide analog der inneren Membran trägt und auf der Außenseite Lipopolysaccharide (LPS).^[108] Diese Schicht wird in drei Teile, innerer Kern, äußerer Kern und O-Antigen-Einheit unterschieden und besteht im Wesentlichen aus Polysacchariden, die zur Unterscheidung von Bakterien dienen. Die äußere Membran besteht weiterhin zu 50% aus Poren-formenden Proteinen (Porinen), die einen Transport durch die Membran ermöglichen.

Abb. 26: Schematische Darstellung der Hülle von Gram-negativen Bakterien. Das Zytoplasma ist von einer inneren Membran, einer Phospholipid-Doppelschicht umgeben. Darum befindet sich ein Netzwerk aus verknüpften Polysacchariden, auch Periplasma. Die äußere Membran ist zur Hälfte aus Phospholipiden und nach außen mit Lipopolysacchariden versehen, die charakteristisch für verschiedene Zelltypen sind. Porine sitzen in der äußeren

Membran. Angelehnt an Varki et al.^[107]

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Porine der äußeren Membran zeichnen sich durch eine -Fassstruktur aus, die einzigartig unter membranständigen Proteinen ist.^[109] Dabei wird grundsätzlich anhand der Kristallstrukturen in verschiedenen Familien unterschieden, die alle auf dem gleichen Strukturmerkmal basieren und später im Detail besprochen werden. Durch genaue strukturelle Untersuchungen von bestehenden Kristallstrukturdaten hat Georg Schulz ein paar grundlegende Eigenschaften aller Porine festgelegt.^[109] In Abb. 27 ist auf der linken Seite die schematische Darstellung einer aufgeschnittenen Fassstruktur zu sehen. Der Abstand zwischen zwei Strängen ist in der Regel 4,4 Å (b) und der Abstand zwischen den C_α-Atomen von zwei benachbarten Aminosäuren 3,3 Å (a). Der Neigungswinkel α beschreibt die Neigung zur vertikalen Achse und liegt bevorzugt zwischen 30-60°.

N- und C-Terminus liegen bevorzugt im Periplasma vor, was durch eine gerade Anzahl an Strängen zustande kommt. Die Stränge liegen antiparallel zueinander und bilden Verbindungen zu ihren direkten Nachbarn aus. Die dünn-gestrichelten Linien repräsentieren Wasserstoffbrückenbindungen, die abwechselnd zu beiden benachbarten Strängen ausgebildet werden für maximale Stabilität. Die einzelnen Stränge sind auf der extrazellulären Seite mit langen Loops und auf der Innenseite zum Periplasma mit kurzen Turns verbunden. Die Außenseite ist mit hydrophoben Aminosäuren bedeckt, die mit den Lipiden interagieren. An den Rändern sitzen aromatische Aminosäuren auf Höhe der Lipidköpfe. Durch ihre hydrophile, oft mit Wasser gefüllte Innenseite stellen sie eine inverse Mizelle dar.^[109] Die Transmembranregion ist dabei konserviert, während die Loopregionen großer Variabilität in Sequenz und Länge unterliegen.^[108] Am Beispiel Outer Membrane Protein F (OmpF, Abb. 27, rechte Seite), welches natürlich als Trimer vorliegt, lassen sich die aufgezählten Eigenschaften wiedererkennen. Die großen Loops, vor allem L3 (Abb.

27 rechts; auf der Innenseite in Gelb dargestellt), sind in der Lage die Pore zu verschließen bzw.

eine Selektion gegenüber kleinen Molekülen oder Ionen einzuführen.^[110]

Abb. 27: Genereller Aufbau von  -Fassstrukturen. Linke Seite – struktureller Aufbau mit wichtigen Kennziffern zur Beschreibung einer -Fassstruktur dargestellt. Rechte Seite – Beispiel einer -Fassstruktur am Beispiel einer Einheit des

Trimers OmpF (PDB:2OMF).

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Trotz gleicher Architektur haben die verschiedenen Porine unterschiedliche Funktionen. Im Folgenden werden Beispiele aus den verschiedenen Familien der Porine vorgestellt (vgl. Abb. 28).

Das Outer Membrane Protein A (OmpA) wird mit hoher Expressionsrate zu 100.000 pro Zelle hergestellt. Die Transmembrandomäne besteht aus 170 Aminosäuren in nur 8 Strängen und ist außergewöhnlich thermostabil aufgrund von Salzbrücken zwischen polaren Aminosäuren.^[111] Der C-Terminus, bestehend aus 155 Aminosäuren, ragt in das Periplasma und interagiert dort mit der Peptidoglykanschicht.^[112] OmpX ist ähnlich klein wie OmpA mit dem Unterschied, dass es nur in Stresssituationen in großen Mengen exprimiert wird. Es besitzt ein externes -Faltblatt, das an fremde Proteine binden kann und damit zum Abwehrmechanismus der Zelle gehört.^[113] Die Gruppe der generellen Porine beschreibt Poren, die aus 16 Strängen bestehen und über Diffusion hydrophile Moleküle einer Masse bis 600 Da den Kanal passieren lassen, im allgemeinen aber eine geringe Selektivität besitzen. Ein Vertreter ist das zuvor erwähnte OmpF. Die erste Kristallstruktur des Trimers wurde 1980 von Garavito et al. publiziert.^[114] Das Protein liegt als Homotrimer vor mit einem großen Loop L3, der in die Pore zeigt und dadurch Substratspezifität einführt. Saure Seitenketten im Loop und basische Seitenketten in der Membranwand stabilisieren die Konformation.^[115] Generell sitzen häufig gegensätzlich geladene Aminosäuren gegenüber, die ein elektrisches Potential aufbauen und damit hydrophobe Moleküle abhalten die Pore zu durchdringen.^[116] Sehr große Poren mit 40 Å Durchmesser werden von den Transportern FhuA und FepA gebildet. Sie haben die gleiche Topologie und unterliegen demselben Mechanismus. Die N-terminale Domäne bildet eine Art Stöpsel, der über Salzbrücken stabilisiert ist. Durch eine eisenabhängige, allosterische Bindestelle, kann eine Konformationsänderung herbeigeführt werden, wodurch sich der Kanal öffnet und Fe³⁺-Ionen entlang eines Gradienten eindringen können.^[117,118] Ein weiteres interessantes Beispiel ist das Toxin α-Hemolysin, welches einen Komplex bestehend aus 7 wasserlöslichen Oligomeren bildet. Die Assemblierung findet auf der Membranoberfläche statt.^[119] Jedes Monomer liefert eine -Faltblatt-Schleife, aus denen die Transmembrandomäne, ein 14-strängiges Fass mit einer Höhe von 50 Å, entsteht. Dieselbe Höhe hat auch die intrazelluläre Domäne, deren Durchmesser 100 Å ist.^[120]

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Abb. 28: Übersicht über die vorgestellten Porine der äußeren Membran von Gram-negativen Bakterien. Kleine Porine OmpA und OmpX bestehend aus 8 Strängen. Das allgemeine Porin OmpF, hier zu Übersicht als Monomer dargestellt.

Eisenabhängiges, großes Porin FhuA und Toxin α-Hemolysin mit großer intrazellulärer Domäne.