3 Protein-Engineering von OmpG
3.2.2 Herstellung von OmpG-DEACM Hybriden
Für die postsynthetische Markierung der hergstellten OmpG-Varianten mit einer photolabilen Schutzgruppe wurde zunächst das Cumarin 7-Diethylaminocumarin (DEACM, 25) ausgewählt.
DEACM hat den Vorteil, dass es ein hohes Absorptionsmaximum bei 390 nm besitzt, welches nicht mit der Proteinbande bei 280 nm überlappt. Viele andere, gängige Schutzgruppen sind im Vergleich zu DEACM blauverschoben. Ein weiterer Vorteil ist die blaue Fluoreszenz des Chromophors, die parallel zur Entschützung bei Belichtung der Bande bei 390 nm entsteht und die vor allem für die Analytik von Nutzen ist. In Kapitel 1.3.4 wurde bereits über die Probleme des Cagings von Thiol-Funktionen und Ansätzen zur Lösung des Problems diskutiert. Dabei ist das direkte Caging als Thioether keine bevorzugte Wahl, da die Sulfhydrylgruppe des Kontaktionenpaar-Intermediats zum Angriff an die benachbarte C2-Position neigt und dort irreversibel bindet. Eine gute Lösung stellt die Überbrückung mit Carbamaten dar, was in diesem Fall jedoch nicht realisierbar war. Da die photolabilen Schutzgruppen postsynthetisch an das Protein angebracht werden, muss ein Reaktionspaar eingesetzt werden, das hochselektiv miteinander reagiert. Dies steht in Konkurrenz zu dem Wunsch eines rückstandslosen Abspaltens der photolabilen Schutzgruppe. Da beide Punkte gemeinsam nicht realisiert werden konnten, wurde für die Markierungsstrategie ein Kompromiss eingegangen. Am Cumarinalkohol 25 wurde ein Bromacetat-Linker (95) angebracht, der selektiv mit der Thiolfunktion reagiert (siehe Abb. 98).
Dabei findet ein nukleophiler Angriff des Thiols an den primären Kohlenstoff unter Abspaltung des
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Bromids statt (96). Durch Bestrahlung in das Absorptionsmaximum von DEACM spaltet die photolabile Schutzgruppe ab. Der Abspaltmechanismus von Cumarinen läuft über einen Bindungsbruch zwischen C3´ und dem Alkoholsauerstoff. DEACM spaltet als Alkohol 25 ab und lässt einen Carbonsäurerest am Thiol zurück. Verbindung 95 wurde von Dr. Thomas Halbritter synthetisiert. Es wurde als erstes versucht die reaktivere Iodacetat-Spezies einzusetzen, jedoch war diese nur für wenige Stunden stabil, sodass auf die robustere Bromacetat-Variante zurückgegriffen wurde, die über Stunden in wässrigem Medium eingesetzt werden kann.
Abb. 98: Schematische Darstellung der Bindung von DEACM 95 an die Thiolseitenkette von Cystein. Durch Substitution bindet das Thiol die Schutzgruppe unter Erhalt von 96. Durch Belichtung in das Absoprtionsmaximum von DEACM wird
die Abspaltung ausgelöst. Der abgespaltene Alkohol 25 lässt eine Carbonsäure am Thiol zurück.
(1) Durchführung
Die eigentliche Markierungsreaktion kann auf zwei Wegen durchgeführt werden. Entweder wird am denaturierten Protein die photolabile Schutzgruppe angebracht und nach Abtrennung des Überschusses das Protein in seine natürliche Form rückgefaltet (Abb. 99 - A) oder umgekehrt erst rückgefaltet und im zweiten Schritt die Markierung in der Pore angebracht (B). Für diesen Reaktionsschritt wurde festgestellt, dass für jede Mutante eine individuelle Strategie erfolgreich zum Ziel führt. OmpG-1 konnte ohne Probleme über beide Reaktionswege in guten Ausbeuten hergestellt werden. OmpG-2 konnte dagegen nur über Weg B erhalten werden. Während die Markierung mit hoher Umsetzung funktionierte, konnte im zweiten Schritt kein rückgefaltetes Protein in mehreren Versuchen erhalten werden. Dies korreliert mit der verminderten Stabilität von OmpG-2. Im Fall von OmpG-3, welches nur eine der zwei Punktmutationen von OmpG-2 besitzt, konnte Weg A mit verminderter Ausbeute von ca 25% erhalten werden. Dies bestätigt die Vermutung von Grosse, dass R92 essentiell für die Stabilität ist und ein Austausch negative Auswirkungen auf die strukturelle Integrität hat.[220] Allgemein wurde außerdem festgestellt, dass die Menge an organischem Lösungsmittel, in dem die photolabile Schutzgruppe gelöst wird für die Markierungsreaktion, im nativen Zustand des Proteins so gering wie möglich (max. 1:5 – organisches Lösungsmittel:Puffer) gehalten werden sollte. Dadurch fallen zwar Teile des Cumarins aus, sodass eine stets gesättige Lösung vorhanden ist, aber das Protein bleibt jedoch stabil.
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Abb. 99: Schematische Darstellung der möglichen Schritte, um vom denaturierten Protein das Hybrid zu erhalten. A – die Markierung wird am denaturierten Protein durchgeführt und das Protein anschließend in seine native Form gebracht. B –
OmpG wird erst rückgefaltet und die Markierung im Anschluss auf der Innenseite angebracht.
Nach der Markierungsreaktion folgte die Aufreinigung des Hybrids – sowohl für gefaltetes als auch für ungefaltetes Protein. Um die großen Mengen an überschüssigem Markierungsreagenz zu entfernen wurde nach Protokoll[220] eine Größenausschlusschromatographie mit IEC-Puffer durchgeführt. In späteren Versuchen wurde dies durch Waschen des Reaktionsansatzes in einem Zentrifugenfilter ersetzt. Dabei konnte in einem Schritt der Überschuss entfernt, das Volumen reduziert und auf IEC Puffer gewechselt werden. Nach erfolgreicher Herstellung des Hybrids im gefalteten Zustand folgte eine Ionenaustausch-chromatographie (siehe Abb. 100). Im Anschluss wurde das Protein über einen Zentrifugenfilter aufkonzentriert (5 mg/ml) und eine Dialyse auf einen 10%-Glycerinhaltigen Lagerungspuffer mit Detergenz durchgeführt zur stabilen Lagerung.
Abb. 100: Ionenaustauschchromatogramm. Die Elution von OmpG erfolgt über einen Salzgradienten B (1M NaCl) von 25 mM auf 500 mM NaCl. Das Protein eluiert bei einer Leitfähigkeit von 21,8 mS. Durch gleichzeitige Detektion von 280
und 390 nm ist zu erkennen, ob die Proteinfraktion Cumarin enthält.
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99 (2) Analytik des Hybrids
Um zu Bewerten mit welcher Ausbeute die Markierung an des Protein angebracht werden konnte, wurde eine Quantifizierung über Absorption durchgeführt, sowie eine massenspektrometrische Analyse des Massenservice der Universität Marburg. Für die Quantifizierung wurden die Extinktionskoeffizenten von DEACM 95 über eine Konzentrationsreihe in H2O/MeCN bestimmt.
Dabei ist vor allem der Extinktionskoeffizient von DEACM 95 bei 280 nm wichtig, um keine Fehlinterpretation der Proteinmenge zu erhalten. Der Extinktionskoeffizient von OmpG-1 bei 280 nm wurde über das Online Programm ExPASy Prot Param von Swiss Institute of Bioinformatics berechnet anhand der Sequenz (siehe 5.3.3). Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 zu sehen. Für ein Hybrid aus OmpG-1 mit DEACM (OmpG-5, OmpG/ΔL6-C13-C154/2xDEACM) ergibt sich ein Extinktionskoeffizient ε280 nm = 78260 L/mol·cm. Zur Bestimmung der Markierungseffizienz wurde ein Absorptionsspektrum von OmpG-5 gemessen (siehe Abb. 101). Mit den bekannten ε bei 280 und 390 nm konnte jeweils die Konzentration bestimmt werden. Die Konzentration von DEACM ist mit 24,9 µM ca. doppelt so hoch wie die Proteinkonzentration von 12,3 µM und bestätigt damit eine vollständige Markierung (vgl Abb. 101 rechts).
Tabelle 11: ε der Komponenten und des Hybrids.
ε 280 nm ε 390 nm
Abb. 101: Bestimmung der Markierungseffizienz von OmpG-5 anhand der Extinktionskoeffizienten. Absorptionsspektrum des Hybrids OmpG-5 links mit Berechnung der Konzentrationen von Protein (280 nm) und Markierung (390 nm) in der
Tabelle rechts.
Zur Überprüfung ob DEACM durch Bestrahlung von OmpG-5 wieder abgespalten werden kann, wurde das Hybrid belichtet und via SDS PAGE analysiert (Abb. 102). Zum Vergleich wurden unmodifiziertes OmpG-1 sowie DEACM-markiertes OmpG-5 auf das Gel aufgetragen (jeweils 40 µL, 12,5 µM, 500 pmol in Lagerungspuffer, siehe 5.3.4). OmpG-5 wurde zweimal aufgetragen, einmal vor und einmal nach Belichtung für 5 Minuten bei 385 nm (700 mA, 95 mW – vgl. Stabilitätstest
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Abb. 97) ohne weitere Aufreinigung aufgetragen. Durch Anregung des Gels mit 365 nm sind nur Cumarin-haltige Banden zu sehen, im Weißlicht nur Proteinbanden. Bei 365 nm ist zu erkennen, dass die unbelichtete Probe OmpG-5 stark und die belichtete, Abspaltprodukt OmpG-6 mit Carboxylatresten, nur noch schwach fluoresziert – d.h. im Fall der belichteten Probe ist noch Restfluoreszenz zu erkennen. Es wird vermutet, dass der abgespaltene Cumarinalkohol 25 aufgrund seiner hydrophoben Natur noch im Inneren der Pore sitzen könnte. Es ist außerdem zu sehen, dass ein Großteil des abgespaltenen DEACM-Alkohols 25 aus der Proteinbande herausdiffundiert ist.
Durch Coomassie-Färbung der Proteinbanden wurde überprüft, dass keine Denaturierung aufgrund der Belichtung stattgefunden hat.
Abb. 102: 10% SDS PAGE von belichtetem (A) (385 nm, 700 mA, 95 mW, 5 Minuten) und unbelichtetem (B) OmpG-5. Zum Vergleich wurde unmodifiziertes OmpG-1 (C) aufgetragen. Linke Seite – Anregung der Fluoreszenz von DEACM durch
365 nm, 5 mW Licht. Rechte Seite – Coomassie®-Färbung des Proteins im Weißlicht.