100
[%] Pr ⋅
−
= −
Min Max
obe Max
FP FP
FP satz FP
Substratum
Formel 3.8 Berechnung des Substratumsatzes [%] im FP Assay
Die Hemmung in Prozent konnte berechnet werden, indem der Quotient aus der FP einer gewöhnlichen Umsatzprobe mit DMSO und einem „Umsatz Inhibitor“ mit 100 multipliziert und das Produkt von 100 subtrahiert wurde.
[%] 100 100 [%]
[%]= − ⋅
DMSO satz
Substratum
Inhibitor satz
Substratum Hemmung
Formel 3.9 Berechung der Hemmung [%] im FP Assay
Lestaurtinib PKC412
Sunitinb Imatinib
Erlotinib Lapatinib
Vatalinib BS4
ɲ'ϭϯ ɴCG13
Für die Testung wurden die Substanzen als 10 mM Stammlösung in DMSO gelöst. Die jeweilige Stammlösung diente anschließend der Herstellung einer 1 mM Verdünnung in mQ-Wasser mit einem DMSO Gehalt von 20 %. Imatinib wurde davon abweichend als 10 mM Lösung in mQ-Wasser gelöst, da die Verbindung als Mesylat vorlag. Alle Verbindungen wurden zunächst bei einer Konzentration von 50 µM auf ihre Wirkung gegenüber der Myt1 getestet. Hätte eine Substanz bei dieser Konzentration eine Hemmung von > 50 % aufgewiesen, sollte diese später einer IC50-Bestimmung unterzogen werden.
Für die Versuche mittels CE wurden 5 µl der 1 mM Lösung auf den Probenansatz (Gesamtvolumen 100 µl) gegeben, so dass sich eine Endkonzentration von 50 µM bei einem DMSO Anteil von 1 % ergab.
Da die Enzymreaktion im FP Assay in einem Volumen von 50 µl stattfand, war hier nur die Zugabe von 2,5 µl der 1 mM Hemmstofflösung notwendig, um eine Konzentration von 50 µM mit einem DMSO Gehalt von 1 % einzustellen.
3.9.2 Testung mit Hilfe der CE Methode
Die Screeningversuche, die mittels CE Methode durchgeführt wurden, fanden alle am Gerät Prince unter Verwendung der im Abschnitt 3.6.2 aufgeführten Parameter und Methode statt. Bei dieser Testung kam bereits die optimierte CE Methode zum Einsatz. Die Ermittlung der Peakflächen erfolgte mit der gerätesteuernden Software Borwin und anschließend mit Hilfe von Microsoft Excel.
Ein Ansatz ohne Testverbindung, nur mit 1 % DMSO, diente zur Definition des Substratumsatzes. Ein Blindwert, bestehend aus TY-ABD, ATP und Puffer, also ohne Kinase, definierte den Nullwert (keine Aktivität der Kinase) und diente der Korrektur der Peakflächen. Für die Verdünnung der Peptid SL und der ATP SL wurde ausschließlich Kinasepuffer verwendet. Alle Proben wiesen eine Peptidkonzentration von 10 µM, eine ATP Konzentration von 100 µM und eine Konzentration der Testverbindung von 50 µM auf, außerdem wurde ein DMSO Gehalt von 1 % eingestellt. Die Inkubation aller Ansätze erfolgte für 90 min bei 30°C und 350 rpm im Thermoblock. Das Pipettierschema ist Tabelle 3.14 zu entnehmen.
Tabelle 3.14 Pipettierschema [µl] der Screeningexperimente mittels CE Methode
Kinase-puffer
DMSO [20 %]
TY-ABD [100 µM]
ATP [1 mM]
Enzym Präparation Umsatzprobe
Myt 1 / Wee 1 65 5 10 10 10
Umsatzprobe
Inhibitor 75 5 10 10
-Blindprobe ohne
Enzym 75 5 10 10
-Es wurde von links nach rechts in Eppendorfgefäße pipettiert. Die Lagerung der Lösungen erfolgte auf Eis bis zum Starten der Reaktion mit Enzym. Nach jeder Zugabe eines Bestandteiles erfolgte das Mischen der Probe mit Hilfe eines Vortexers, gegebenenfalls wurde die Probe zusätzlich kurz zentrifugiert. Das Assayvolumen betrug 100 µl pro Ansatz. Für eine Messung an der CE wurden jeweils nur wenige Nanoliter benötigt. Dennoch war eine Mindestfüllhöhe von ca. 100 µl pro Glasvial einzuhalten, damit die Kapillare während der Injektion ausreichend tief in die Messlösung eintauchen konnte. Nach der Inkubation erfolgte das Überführen der Lösungen in ein Glasvial und die direkte Vermessung an der CE. Die Messung wurde analog Abschnitt 3.6.2.1 durchgeführt. Das Ansetzen der Proben erfolgte zeitlich gestaffelt, mindestens mit einem 25minütigen Abstand zueinander, damit gewährleistet wurde, dass alle Proben nach der gleichen Inkubationszeit vermessen werden konnten.
Es war davon auszugehen, dass mit der Injektion die Enzymreaktion gestoppt war, da zum einen der pH der Essigsäure zur Inaktivierung der Kinase beitrug und zum anderen die Komponenten voneinander bei der Elektrophorese getrennt wurden.
Nach der Versuchsdurchführung ließen sich Aussagen zu Substratumsatz und Hemmung der Verbindungen treffen. Hierzu wurden die Elektropherogramme ausgewertet. Die Quantifizierung beruhte auf der Ermittlung der Peakflächen und der Zu- bzw. Abnahme dieser durch die Kinasereaktion. Zunächst erfolgte die Zuordnung der Signale für TY-ABD und pTY-/TpY-ABD anhand der Retentionszeit und dem Vergleich mit den jeweiligen Elektropherogrammen der Referenzen. Zur Erinnerung: Eine Unterscheidung von TpY-ABD und pTY-ABD war über CE nur dann möglich, wenn die Messung mit einem niedrigen Laufdruck durchgeführt wurde. Da aber für die Feststellung einer Inhibition die Unterscheidung der monophosphorylierten Peptide nicht notwendig war, erfolgten die Messungen mit höherem Laufdruck und dadurch mit kürzeren Laufzeiten. Die Peakflächen wurden für alle Proben mit Inhibitor, den Blindwert und die Umsatzproben ermittelt. Die Berechnung von Substratumsatz und Hemmung erfolgte über die Formeln 3.3 bis 3.5.
3.9.3 Testung mit Hilfe des FP Assays
Die Durchführung der Testung erfolgte bezüglich der Assayparameter und der Herstellung und Zusammensetzung der Lösungen wie in Abschnitt 3.6.1.6 beschrieben. Sie fand damit vor der Optimierung des Assaysystems statt. Im Folgenden wird gesondert auf wichtige Punkte der Herstellung der Lösungen und der anschließenden Bestimmung eingegangen.
Die Herstellung der zu testenden Verbindungen ist Abschnitt 3.9.1 zu entnehmen. Für die Versuche wurden schwarze 96-Well half-area NBS Platten, Firma Corning mit EASYseal Klebefolien zum Verdunstungsschutz während der Inkubation verwendet. Alle Verdünnungen wurden in Eppendorfgefäßen angefertigt und für zehn Sekunden im Vortexer homogenisiert. Die Testung der Substanzen erfolgte je als Doppelbestimmung mit einer jeweiligen Konzentration von 50 µM pro Testverbindung bei einer DMSO Konzentration von 1 % einmal mit einer Myt1- und einmal mit einer Wee1 Enzympräparation. Bei allen anderen Ansätzen wurde zur Vergleichbarkeit ebenso ein DMSO Gehalt von 1 % eingestellt. Die Ansätze Umsatz Myt1 und Umsatz Wee1 enthielten keine Testverbindung und dienten zusammen mit dem Maximalsignal (NK) der grafischen Abschätzung eines Substratumsatzes. Diese Ansätze, sowie der Blindwert wurden dreifach angefertigt. Für die Einstellung des geräte- und methodenbedingten K-Faktors und zur Durchführung des GA wurde eine 150 nM Lösung der freien Fluoreszenzsonde (pTpY-F5M) verwendet. Zunächst erfolgte die Enzymreaktion während einer 90minütigen Inkubation bei 30 °C im Schüttler. Anschließend erfolgte durch Zugabe von EDTA das Abstoppen der Reaktion in dessen Folge die Sonde-AK-Lösung zugegeben wurde.
Während einer erneuten Inkubation bei 30 °C auf dem Schüttler erfolgte die AK Bindung und somit die Vorbereitung der Detektion. In der Messlösung ergab sich für den AK eine Konzentration von 0,1 µg/ml. Zur besseren Übersicht zeigt Tabelle 3.15 das Pipettierschema mit den dazugehörigen Konzentrationen.
Tabelle 3.15 Pipettierschema [µl] der Screeningexperimente mittels FP Assay
Zur Herstellung von Verdünnungen und zur Anfertigung der Ansätze wurde Kinasepuffer verwendet.
Für eine höhere Richtigkeit und Präzision des Pipettiervorgangs wurden die Pipettiervolumina gleicher Ansätze mit der jeweils benötigten Anzahl an Messpunkten zuzüglich eines kleinen Überschusses multipliziert und in Eppendorfgefäßen zusammenpipettiert. Die Lagerung der Lösungen erfolgte bis zur Vorlage in die Mikrotiterplatte auf Eis. Da für die Kontrolllösungen (Blindwert, Minimalsignal, Maximalsignal, Umsatz DMSO) die Bestimmung in Triplikaten vorgesehen war, wurden alle in Tabelle 3.15 angegebenen Volumina mit dem Faktor 3,5 multipliziert. Die Ansätze für die verschiedenen Inhibitoren wurden mit dem Faktor 2,2 multipliziert, da sie jeweils nur doppelt bestimmt wurden.
Blindwert (x 3,5): 323,8 µl Kinasepuffer 8,8 µl DMSO (20 %) 17,5 µl ATP (1 mM) їũĞ100 µl pro Well (3 x) Maximalsignal (x 3,5): 131,3 µl Kinasepuffer
17,5 µl TY (100 µM) 8,8 µl DMSO (20 %) 17,5 µl ATP (1 mM) їũĞ50 µl pro Well (3 x) Positivkontrolle (x 3,5): 110,3 µl Kinasepuffer
17,5 µl TY (100 µM) 8,8 µl DMSO (20 %) 17,5 µl ATP (1 mM) їũĞϰϰђůƉƌŽtĞůů;ϯ x) Umsatz Myt1 / Wee 1 (x 7): 227,6 µl Kinasepuffer
35 µl TY (100 µM) 17,5 µl DMSO (20 %) 35 µl ATP (1 mM) їũĞ45 µl pro Well (3 x) Umsatz Inhibitor (22 x 2,2): 1573 µl Kinasepuffer
242 µl TY (100 µM)
їũĞ88 µl pro Eppendorfgefäß
Zugabe von je 5,5 µl Inhibitor (1 mM) und 11 µl ATP (1 mM)
їũĞϰϱђůƉƌŽtĞůů;Ϯ x)
Die jeweils angegebenen Volumina wurden in der Mikrotiterplatte vorgelegt. Die Enzymreaktion wurde durch die Zugabe von je 5 µl Enzympräparation der Myt1 oder Wee 1 gestartet. Nachdem beide Inkubationsschritte abgeschlossen waren, wurden die Proben im Plattenreader vermessen. Die Auswertung erfolgte graphisch mit Hilfe der Software GraphPad Prism.