Fluoreszenzmarkierung der Peptide

Sowohl für den geplanten Fluoreszenzpolarisations (FP) Assay, als auch für die Bestimmungen der Peptide über Kapillarelektrophorese (CE) mussten die CDC2-abgewandelten Peptide fluoreszenz-markiert vorliegen. In der Applikation als kleine, fluoreszierende Moleküle verwendet, werden sie in der FP auch als Sonden bezeichnet.

Zunächst wurde die Markierung mit Fluorescein-5-maleimid (F5M) über die Thiolfunktion des C-terminalen Cysteins, so wie es die Literatur^{61; 10} vorschlug, getestet. Dazu erfolgten nach der Markierung von TY und pTpY mit F5M ein Reinigungsschritt mittels HPLC und anschließend die Untersuchung der erhaltenen Produkte mittels CE. Stabilitätsprobleme der markierten Peptide während der Elektrophorese, sowie die Bildung einer Vielzahl von Neben- und Zerfallsprodukten

während der Markierungsreaktion, aber auch nach der Reinigung, machten die Suche nach alternativen Fluoreszenzmarkern erforderlich. Da das mittels CE erhaltene Elektropherogramm der markierten Peptide keine einheitlichen Peaks aufwies, wurde Fluorescein-5-maleimid als Fluoreszenz-marker für die Peptide zunächst als ungeeignet betrachtet.

Als weitere, potentiell geeignete Fluroreszenzmarker kamen Fluorescamin und Monobrombiman in Betracht, genügten aber auch nicht allen Anforderungen. Eine Trennung von Fluorescamin-markierten Peptiden und somit Unterscheidung des Phosphorylierungsstatus war mittels CE nicht möglich, da die für die Trennung essentiellen freien Aminfunktionen mit Fluorescamin abgesättigt waren.

Monobrombiman scheiterte auf Grund schlechter Ausbeuten bei der Markierung und schlechter Reproduzierbarkeit der Signale im Elektropherogramm.

Schließlich erwies sich die Markierung mit dem Benzofurazanderivat ABD-F, ebenfalls über das am C-Terminus gelegene Cystein, als am besten geeignet für die anschließende CE Analytik.

3.5.4.1 Markierung mit Fluoreszenzmarker ABD-F

Diese Methode der Markierung gewährleistet, dass die für die Trennung über CE erforderlichen primären Aminfunktionen der Peptide (Lys² und Lys¹³, sowie die Aminfunktion am N-Terminus) unsubstituiert vorliegen.

4-Fluoro-7-sulfamoylbenzofurazan (ABD-F) ist selbst nicht fluoreszierend, bildet aber nach Reaktion mit einer Thiolfunktion eine fluoreszierende Verbindung mit einem Maximum an Fluoreszenzintensität bei pH 2⁷¹. Bei der Markierung reagiert ABD-F unter Abspaltung eines Fluoridions mit der Thiolfunktion des C-terminalen Cysteins (Abb. 3.2).

NH COOH

S H Lys R

N O N

SO₂NH₂

NH COOH

Lys

S N R

O N SO₂NH₂ F

+

Abb. 3.2 Markierungsreaktion mit ABD-F: ABD-F reagiert mit der Thiolfunktion des C-terminalen Cysteins des Peptids in Form einer nucleophilen Substitutionsreaktion unter Ausbildung einer Thioetherbrücke zum fluoreszierenden Produkt (Peptid-ABD)^{72; 71}.

Für die Markierungsreaktion wurde entweder Peptid-SL oder lyophilisiertes Peptid nach Lösen in 50 mM Tris/HCl Puffer pH 8,0 mit 2 mM EDTA mit einem fünf- bis achtfachen molaren Überschuss an ABD-F versetzt und 10 min bei 50 °C im Thermomixer bei 400 U/min inkubiert. Die aus lyophilisiertem Peptid hergestellte Lösung wurde auf eine Konzentration bis etwa 10 mM eingestellt. Pro Ansatz wurde maximal 700 nmol Peptid eingesetzt.

ABD-F wurde zunächst in ACN angelöst und anschließend mit dem dreifachen Volumen an 50 mM Tris/HCl Puffer pH 8,0 mit 2 mM EDTA (Lösungsmittelverhältnis 1:4) zu einer ca. 80 bis 100 mM Lösung verdünnt. Nach der Inkubation wurde die Reaktion durch die Lagerung auf Eis und Zugabe von 1 M HCl bis zur sauren Reaktion gestoppt.

Für eine gute Umsetzung waren folgende Schritte unbedingt zu beachten: strikte Einhaltung des pH-Wertes während der Markierungsreaktion und die Verwendung von stets frisch hergestellter ABD-F Lösung. Ein pH-Wert kleiner acht hatte eine Verschiebung der Reaktionsprodukte in Richtung des unmarkierten Peptids zur Folge. Dem Ansäuern des Markierungsansatzes nach der Reaktion kam eine zweifache Bedeutung zu: Erstens wurde die Reaktion abgestoppt, da die Reaktivität der Thiolfunktion im Sauren stark herabgesetzt ist und zweitens wurde das gebildete fluoreszierende Produkt stabilisiert, weil die Markierungsreaktion unter basischen und reduktiven Bedingungen reversibel ist^72;

71; 73. Der Zusatz von Phosphinen (z.B. TCEP) zur Reduktion eventueller Disulfide, wie in der Literatur zur Markierung von Thiolen mittels ABD-F häufig beschrieben^74–76, beeinflusste die Markierungs-reaktion nicht positiv. Woraus sich schließen lässt, dass die Peptide unter den vorliegenden Bedingungen zum größten Teil reduziert vorlagen.

Im Anschluss an die Markierung war eine Aufreinigung mittels HPLC zur Gewinnung der reinen ABD-markierten Peptide notwendig. Dabei konnten der Überschuss an Markierungsreagenz, unmarkiertem Peptid und gegebenenfalls markierten Peptidverunreinigungen von dem eigentlichen Produkt abgetrennt werden.

3.5.4.2 Markierung mit Fluoreszenzmarker Fluorescein-5-maleimid

Obwohl sich ABD-markierte Peptide für die Messungen mittels CE als geeignet erwiesen, konnte mit diesen über Fluoreszenzpolarisation keine ausreichende Sensitivität erreicht werden (siehe dazu auch Abschnitte 3.6.1 und 4.2.1 - Entwicklung eines FP Assays). Bei der Entwicklung eines FP Assays auf Grundlage der Veröffentlichungen von KRISTJÁNSDOTTÍR und ZHOU et al.^{61; 10} wurde zunächst angestrebt, ein Testsystem zu entwickeln, welches ABD-markiertes, anstatt Fluorescein-markiertes Peptid als fluoreszierende Sonde nutzt. Auf diese Weise hätte man sowohl für die CE als auch für die FP das gleiche fluoreszierende Peptid verwenden können. Dieser Ansatz hätte eine Neuerung dargestellt, da bisher in der Literatur FP Messungen hauptsächlich mit Fluorescein-markierten Substanzen, jedoch nicht mit ABD-markierten beschrieben wurden^{61; 10}. Grundsätzlich sollten jedoch Polarisationsmessungen auch mit anderen fluoreszierenden Substanzen möglich sein - so auch beispielsweise markierte Peptide. Auf Grund der erwähnten geringen Sensitivität der ABD-markierten Peptide erfolgte daher noch einmal, zum Zweck der Entwicklung eines FP Assays, die Markierung mit einem Fluoresceinderivat.

Für den FP Assay wurde auf Grund seines Aufbaus als kompetitiver Assay nur fluoreszenzmarkiertes pTpY benötigt. Die Markierung erfolgte mit Fluorescein-5-maleimid (F5M). Zerfallsprodukte des F5M-markierten Peptids störten im Unterschied zur CE Analytik bei dieser Methode nicht, da hier durch die Verwendung eines monoklonalen Antikörpers eine ausreichende Spezifität erzielt werden konnte.

O

N O

O O O

H

COOH

+

R Lys

NH

COOH

S H

O

N O

O O O

H

COOH

S

HOOC NH

Lys R

Abb. 3.3 Markierungsreaktion mit F5M: F5M reagiert mit der Thiolfunktion des C-terminalen Cysteins des Peptids in Form einer Additionsreaktion unter Ausbildung einer Thioetherbrücke zum fluoreszierenden Produkt (pTpY-F5M).

F5M ist ein Derivat des Fluoresceins, welches ebenfalls durch Reaktion mit der Thiolfunktion des endständigen Cysteins eine Bindung mit dem Peptid eingeht. Die Bindungsknüpfung erfolgt über eine Additionsreaktion an die Doppelbindung des Maleimids (Abb. 3.3).

Für die Markierung wurde pTpY SL oder lyophilisiertes pTpY so in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß mit 1x PBS-Puffer pH 7,1 verdünnt bzw. gelöst, dass bei der Reaktion nach Zugabe eines 15- bis 20fachen molaren Überschusses des F5M die pTpY Konzentration ca. 100 µM betrug⁷⁶. Die Herstellung der F5M-Lösung erfolgte erst unmittelbar vor Gebrauch durch Lösen der Substanz in DMSO zu einer 15 – 20 mM Lösung. Diese Lösung sowie der Markierungsansatz während einer zweistündigen Inkubation bei RT wurden vor Licht geschützt. Ein Abstoppen der Reaktion erfolgte nicht, so dass der Ansatz entweder unmittelbar der Reinigung unterzogen oder bis zur weiteren Aufarbeitung bei -20 °C gelagert wurde.

Eine bessere Umsetzung konnte durch Verwendung von Phosphatpuffer anstatt Tris-Puffer erreicht werden. Für die selektive Markierung von Thiolfunktionen war auch hier die Einhaltung eines pH-Bereiches von pH 6,5 bis 7,5 wichtig. Bei einem pH-Wert von 7,0 ist die Maleimidgruppe gegenüber freien Thiolfunktionen ca. 1000fach reaktiver als gegenüber Aminen⁷⁷. Bei pH-Werten > 7,5 steigen sowohl die Reaktivität gegenüber primären Aminen als auch die Hydrolyseneigung des Maleimids⁷⁸. Die Verwendung von reduktiv wirkenden Reagenzien, wie z.B. Dithiothreitol (DTT) oder Tris-(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP), zur Bildung von freien Thiolfunktionen, führte hier zu keiner verbesserten Umsetzung. Der Verzicht hatte den Vorteil, dass kein zusätzlicher Reinigungsschritt zur Entfernung des überschüssigen DTTs benötigt wurde.

Im Anschluss an die Markierung war auch hier eine Aufreinigung mittels HPLC zur Gewinnung des reinen F5M-markierten pTpY notwendig. Störende Verbindungen konnten dabei analog 3.5.4.1 entfernt werden.

3.5.5 Aufreinigung der fluoreszenzmarkierten Peptide über HPLC