Auswahl der Sonde

Das hier ausgewählte Substrat der Myt1 Kinase ist ein aus 14 AS bestehendes Peptid, welches einen Teilbereich des CDC2 Proteins darstellt und die spezifische Binderegion bzw. Phosphorylierungsstelle für die Kinase enthält. Für den FP Assay muss das Substrat mit einem fluoreszierenden Molekül verlinkt werden. Hierzu wurde zunächst, entgegen der Vorgehensweise bei KRISTJÁNSDÓTTIR, die Verknüpfung des Peptids mit einem Sulfamoylbenzofurazanderivat (ABD-F) am C-Terminus durchgeführt. Auf diese Weise hätte man sowohl für die CE Methode, als auch für den FP Assay dasselbe fluoreszierende Substrat verwenden können. Wie bereits einleitend unter 4.2.1 erläutert,

wurde schließlich für die FP Methode ein anderes fluoreszierendes Substrat (Sonde) hergestellt, da die Fluoreszenz der ABD-markierten Peptide nicht ausreichend war. Grundsätzlich wäre zwar der Einsatz von ABD-markierten Sonden als Substrate im mikromolaren Konzentrationsbereich möglich, doch dann wäre auch die Verwendung des AK in der gleichen Konzentration, am besten jedoch mit einem mehrfachen Überschuss, notwendig. Der Erhöhung der AK Konzentration waren jedoch sowohl natürliche, als auch finanzielle Grenzen gesetzt, da die AK Stammlösung firmenseitig nur eine Konzentration von ca. 188 nM besaß. Für eine gute AG-AK-Reaktion, denn prinzipiell ist die Bindung des phosphorylierten Peptids (TpY oder pTpY) eine solche Reaktion, ist ein bestimmtes Verhältnis zwischen beiden Reaktionspartnern zu wahren (siehe dazu auch Abschnitt 4.2.1.1). Denn nur wenn die Sonde, welche definitionsgemäß auf Grund des niedrigen Molekulargewichtes eine niedrige FP aufweist (theoretische Grundlagen siehe Abschnitt 2.6), durch den AK gebunden bzw. immobilisiert wird, wirkt sich das direkt auf die Rotationsgeschwindigkeit aus und die FP steigt.

Wie im Abschnitt über die Grundlagen der FP Messung erläutert, ist der Polarisationswert eine konzentrationsunabhängige Konstante, da dieser Wert ein Verhältnis von Fluoreszenzintensitäten darstellt. Die niedrigste Konzentration der Sonde, bei der ein gleich-bleibendes Polarisationssignal vorliegt, sollte den Arbeitsbereich für die Entwicklung eines FP basierten Assays bieten, da hier die Wahrscheinlichkeit von Messfehlern gering ist. Wesentlich geringere Sondenkonzentrationen führen auf Grund größerer Streuung der Einzelwerte zu ungenaueren Polarisationswerten. Hierfür kann bei sinkender Sondenkonzentration der größer werdende Einfluss des Streulichts auf die Fluoreszenz verantwortlich gemacht werden.

Um die Konzentration zu ermitteln, ab dem die FP konzentrationsunabhängig wird und sich bei graphischer Darstellung eine asymptotische Annäherung an einen bestimmten Wert ergibt, wurden sowohl für die ABD-markierten Peptide, als auch später für das F5M markierte pTpY Sensitivitätstests durchgeführt. Dazu wurde die jeweilige Sonde in unterschiedlichen Konzentrationen vermessen.

Beispielhaft für alle übrigen ABD-markierten Peptide zeigt Abbildung 4.13, dass die Fluoreszenz-polarisation von TY-ABD erst im mikromolaren Bereich stabil ist. Niedrigere Konzentrationen der ABD-markierten Peptide sind, auf Grund der begrenzten Empfindlichkeit des NOVOstar nicht sicher messbar. Auf eine Blindwertkorrektur der Polarisationswerte wurde hier verzichtet, da sich anderenfalls durch den natürlich hohen Bindwert teilweise negative Polarisationen errechneten.

0 10 20 30 40 50

100 150 200 250 300

Konzentration [µM]

Polarisation [mP]

Abb. 4.13 Sensitivitätstest mit TY-ABD: Dargestellt ist die Abhängigkeit des Polarisationssignals von der TY-ABD Konzentration. Ab einer Konzentration von ca. 20 µM ist die FP konzentrationsunabhängig. Polarisationswerte (ohne Hintergrundkorrektur) ergeben sich aus einer Zweifachmessung, Parallelansätze n = 2, Fehlerbalken zeigen SD.

Trotz der notwendigen hohen Sondenkonzentration und wider besseres Wissen, dass optimalerweise im Vergleich zum Peptid höhere AK Konzentrationen eingesetzt werden müssen, wurde anschließend eine fixe Konzentration von TpY-ABD (20 µM) mit steigenden Mengen an AK versetzt. Das Polarisationssignal blieb jedoch auch in Anwesenheit von AK unverändert (ohne Abbildung). Der Verzicht auf BSA im Puffer für den Antikörper oder die Reduktion der Sondenkonzentration auf 1 oder 10 µM verbesserten an diesem Ergebnis nichts.

Neben dem Austausch des Gerätes gegen ein empfindlicheres, um Messungen im nanomolaren Bereich durchführen zu können, gab es infolge der obigen Ergebnisse daher nur die Möglichkeit eine andere, leistungsfähigere Fluoreszenzsonde zu testen. Da ein neueres, leitstungsfähigeres Gerät für die Messung der FP nicht zur Verfügung stand, wurde die Markierung von pTpY mit F5M durchgeführt.

Diese Sonde wurde einem Sensitivitätstest unterzogen und durch anschließendes Zutitrieren von AK auf ihr Polarisationsverhalten getestet.

100 200 300 400 500 -50

-25 0 25 50 75 100

Konzentration [nM]

Polarisation [mP]

Abb. 4.14 Sensitivitätstest mit F5M: Dargestellt ist die Abhängigkeit des Polarisationssignals von der pTpY-F5M Konzentration. Ab einer Konzentration von ca. 20 nM ist die FP konzentrationsunabhängig. Konzentrationen von 10 nM und niedriger führen zu negativen Polarisationswerten (Datenpunkte für 1 und 5 nM nicht mehr dargestellt). Polarisationswerte (hintergrundkorrigiert) ergeben sich aus Dreifachmessungen, Parallelansätze n = 2, Fehlerbalken zeigen SD.

In dem folgenden Experiment wurde in Form einer Direkttitration mit AK die Eignung von pTpY-F5M als potentielle Sonde für den FP Assay überprüft. Dabei wurde eine konstante pTpY-F5M Konzentration mit sieben verschiedenen AK Konzentrationen (0,03 µg/ml bis 025 µg/ml) titriert.

Gemäß der Ergebnisse des Sensitivitätstests läge die optimale Sondenkonzentration für diese Bestimmung zwischen 20 und 50 nM pTpY-F5M. Dessen ungeachtet wurde eine Sondenkonzentration von 5 nM pTpY-F5M ausgewählt, um von Anfang an ein relativ günstiges Sonden(AG)-AK-Verhältnis sicherzustellen und den Einsatz an AK so hoch wie nötig, jedoch so gering wie möglich zu halten. Denn ein einfaches Rechenbeispiel zeigt: Bei einer Sondenkonzentration von 35 nM müsste bereits zum Erreichen eines 1:1 Verhältnisses von Sonde und AK eine AK Konzentration von 1,19 µg/ml eingestellt werden. Dies bedeutete bei nur einem mit 100 µl gefüllten Well ca. 19 µl der AK SL (c = 6,4 µg/ml) und somit einen Preis pro Well von rund 53 Euro (einzig auf den AK bezogen). Die hier eingesetzte 5 nM Lösung der Sonde entspricht, gegenüber der bei KRISTJÁNSDÓTTIR im Assay verwendeten Lösung, der fünffach höheren Sondenkonzentration. Diese Konzentration war mindestens notwendig, da die Fluoreszenzintensitäten einer ein nanomolaren Lösung auf dem Niveau des Blindwertes lagen und mit Hilfe des NOVOstar auf Grund seiner vergleichsweise geringen Sensitivität beide Ansätze nicht mehr unterschieden werden konnten. Die gewählten 5 nM pTpY-F5M stellten somit zu diesem Zeitpunkt die minimal messbare Konzentration dar.

0,00 0,03 0,05 0,07 0,10 0,15 0,20 0,25 0

50 100 150 200

Konzentration AK [µg/ml]

Polarisation [mP]

Abb. 4.15 Direkttitration von AK an pTpY-F5M: Eine Konzentration von 5 nM pTpY-F5M wurde mit sieben verschiedenen Konzentrationen des Phospho-CDC2 Tyr¹⁵ AK titriert. Polarisationswerte (hintergrundkorrigiert) ergeben sich aus Dreifachmessungen der freien Sonde (kein AK) in n = 7 Parallelansätzen und den Einzelansätzen für die unterschiedlichen AK Konzentrationen.

Abb. 4.15 zeigt konzentrationsabhängig die Zunahme des Polarisationssignals bei steigender AK Konzentration. Die Messung der Fluoreszenzpolarisation erfolgte 30 Minuten nach Zugabe des AK und zur Bewertung der Stabilität noch einmal nach 16 Stunden. Der Unterschied der Polarisationswerte ging nicht über die normale Streuung hinaus. Von der Stabilität der Gleichgewichtseinstellung war somit auch über einen längeren Zeitraum auszugehen. Die relativ große Standardabweichung der freien Sonde (0 µg/ml AK) ist, wie oben bereits erläutert, auf den großen Einfluss des Streulichtes zurückzuführen. Sie hebt sich in dieser Konzentration vom Hintergrund kaum ab.

Wie in den Grundlagen zur FP bereits erläutert, kommt es beim Signalanstieg zu einer zunehmenden Immobilisation der Sonde durch Bindung dieser in Form von AG-AK-Komplexen. Dabei wird aus dem realtiv kleinen beweglichen Molekül pTpY-F5M (2,13 kDa) ein großer, träger Komplex aus pTpY-F5M und AK (ca. 36 kDa), der einen höheren Fluoreszenzpolarisationswert aufweist. Diese Ergebnisse waren die Grundlage für die Entwicklung eines FP Assays auf Basis einer F5M-markierten Sonde.