Immunohistochemische Lokalisation von AmSUT1 in Gewebeschnitten

Verschiedene Gewebe von Alonsoa meridionalis wurden in Methacrylat eingebettet und entweder quer oder längs in 2 µm dünne Schnitte mit einem Ultramikrotom geschnitten (2.15). Diese Schnitte wurden mit dem anti-AmSUT1-N3-Antikörper oder ohne diesen (Negativkontrolle) inkubiert. Danach folgte der Nachweis des Primär-Antikörpers mit FITC-markiertem Sekundär-Antikörper (2.15.3.3).

Die Lokalisation der grünlich fluoreszierenden FITC-Konjugate erfolgte unter dem Fluoreszenz-Mikroskop bei einem Anregungslicht von 450-490 nm.

Abb. 28: Immunocytochemische Lokalisation von AmSUT1 im Phloem der Blatt-Mittelrippe von Alonsoa meridionalis. A: Querschnitt durch die Mittelrippe. Die abaxial gelegenen Zellen des Phloems sind markiert. B: Gleicher Schnitt wie in A, aber ohne Behandlung mit anti-AmSUT1-N3-Antikörper (Negativkontrolle). Es ist nur die gelblich-grüne Autofluoreszenz des Xylems zu erkennen. C:

Querschnitt durch die Mittelrippe bei stärkerer Vergrößerung und simultaner Fluoreszenz- und Durchlicht-Beleuchtung. Bei den durch FITC grünlich markierten Zellen handelt es sich vermutlich um Geleitzellen, da sie ein dichtes Cytoplasma besitzen (D, lichtmikroskopisches Bild von C). P = Phloem; X = Xylem; Balken: A, B = 100 µm; C, D = 25 µm.

In Abbildung 28 ist die immunocytochemische Lokalisation von AmSUT1 im Phloem der Mittelrippe von ausgewachsenen Alonsoa-Blättern dargestellt. Im Querschnitt durch die Mittelrippe ist der Kranz aus Phloemzellen unterhalb der grünlich-gelb autofluoreszierenden Xylemstränge deutlich markiert (A). In der Negativkontrolle (B) fehlt diese Markierung. Abb. 28 C zeigt den gleichen Schnitt bei stärkerer Vergrößerung und in kombiniertem Fluoreszenz- und Durchlicht. Bei den stark grünlich leuchtenden Zellen handelt es sich vermutlich um Geleitzellen, da diese ein dichtes Cytoplasma besitzen (D). Ob dies Intermediärzellen oder gewöhnliche Geleitzellen sind, läßt sich lichtmikroskopisch nicht genauer klären.

Auch in den kleineren Blattadern ist AmSUT1 im Phloem lokalisiert. Abbildung 29 zeigt die immunocytochemische Lokalisation von AmSUT1 in einer Blattader 3. Ordnung (A, B) und in einer

„minor vein“ (C, D). Die abaxial, unterhalb des Xylems liegenden Zellen des Phloems zeigen die typische FITC-Fluoreszenz (A, C). In der Negativkontrolle (B) ist nur die gelbliche Autofluoreszenz des Xylems zu erkennen.

Abb. 29: Immunocytochemische Lokalisation von AmSUT1 im Phloem der Blattadern 3. Ordnung (A, B) und der „minor veins“ (C, D). A: Querschnitt durch eine Blattader 3. Ordnung. Die abaxial gelegenen Zellen des Phloems sind durch FITC grünlich markiert. B: Gleicher Schnitt wie in A, jedoch ohne Behandlung mit anti-AmSUT1-N3-Antikörper (Negativkontrolle). C: Querschnitt durch eine „minor vein“. Die Zellen des Phloems sind markiert. D: Lichtmikroskopische Aufnahme von C. P

= Phloem, X = Xylem, LE = untere Epidermis; UE = obere Epidermis; Balken: A, B = 25 µm; C, D = 10 µm.

Abb. 30: Immunocytochemische Lokalisation von AmSUT1 im Phloem des Stengels von Alonsoa meridionalis. A: Querschnitt einer Stengelhälfte (Dunkelfeld-Aufnahme). B: Nachweis von AmSUT1 durch FITC-Fluoreszenz im Phloem (gleicher Schnitt wie in A). C: Stengelquerschnitt ohne Behandlung mit anti-AmSUT1-N3-Antikörper (Negativkontrolle). Die Phloemstränge sind hier nicht markiert. P = Phloem; X = Xylem; M = Markparenchym; Balken = 100 µm.

Auch der Stengel wurde immunohistochemisch auf das Vorkommen von AmSUT1 untersucht, da dieses Organ die höchste AmSUT1-Expression zeigte (3.3.2). Auch im Stengel konnte AmSUT1 im Phloem lokalisiert werden (Abb. 30). Der zwischen Xylem und Epidermis liegende Kranz aus Phloemzellen wurde deutlich grün markiert (B). Diese Markierung trat in der Negativkontrolle nicht auf (C).

Bei stärkerer Vergrößerung fiel auf, daß im Stengel ganze SE-CC-Komplexe durch FITC markiert wurden (Abb. 31). In den Geleitzellen war die Markierung über die ganze Zelle verteilt, wohingegen sie im zugehörigen Siebelement v.a. am Rand zu finden war.

Abb. 31: Immunocytochemische Lokalisation von AmSUT1 in Siebelementen und Geleitzellen des Phloems. A: Ausschnitt aus dem Stengelquerschnitt von Alonsoa meridionalis (Abb. 30). B: Zwei Siebelement-Geleitzellen-Komplexe aus A bei stärkerer Vergrößerung. Die Siebelemente sind nur am Rand markiert, während die zugehörigen Geleitzellen mehr oder weniger vollständig markiert sind. C:

Lichtmikroskopische Aufnahme von A. X = Xylem; _* = Siebelement (mit zugehöriger Geleitzelle);

Balken: A, C = 50 µm; B = 10 µm.

Diese Beobachtung wurde auch durch die Untersuchung von Stengel-Längsschnitten bestätigt. Diese wurden jeweils mit DAPI oder Anilinblau angefärbt. Da DAPI Zellkerne anfärbt, ist es ein Marker für Geleitzellen. Anilinblau färbt die Callose in den Siebplatten und markiert daher Siebelemente.

Abbildung 32 zeigt die immunocytochemische Lokalisation von AmSUT1 in Stengel-Längsschnitten von Alonsoa meridionalis. AmSUT1 befindet sich sowohl in Siebelementen (A) als auch in Geleitzellen (C). Ob es sich hierbei um Intermediärzellen oder gewöhnliche Geleitzellen handelt, konnte auch hier nicht eindeutig entschieden werden. AmSUT1 ist damit der erste Saccharose-Transporter, der in beiden Zelltypen, Siebelement und Geleitzelle, gleichzeitig lokalisiert werden konnte. Alle bisher immunolokalisierten Saccharose-Transporter wurden entweder nur in Geleitzellen

des Phloems von Blatt und Stengel (STADLER et al. 1995, STADLER und SAUER 1996) oder Siebelementen von Blattadern (KÜHN et al. 1997, BARKER et al. 2000, WEISE et al. 2000) detektiert.

Die aufgeführten Versuche zeigen erstmals, daß Oligosaccharid-transportierende Pflanzenarten mit offener Phloemanatomie ebenfalls Saccharose-H⁺-Symporter im Phloem exprimieren. Die Lokalisation von AmSUT1 im Phloem von Blattadern jeglicher Ordnung und im Stengel zeigt, daß dieser Transporter sowohl für die Beladung des Phloems mit Saccharose, als auch für die Wiederaufnahme von Saccharose während des Transports („retrieval“, GRIMM et al. 1990, 1997) verantwortlich ist.

Abb. 32: Immunocytochemische Lokalisation von AmSUT1 in Siebelementen (A) und Geleitzellen (C) des Phloems in Stengel-Längsschnitten von Alonsoa meridionalis. Zur Identifizierung des Zelltyps wurden die Gewebeschnitte zusätzlich zur Antikörperbehandlung entweder mit Anilinblau oder DAPI blau angefärbt. Anilinblau färbt die Callose in den Siebplatten der Siebelemente (A), während DAPI Zellkerne, d.h. Geleitzellen markiert (C). Die grünliche FITC-Markierung ist in Zellen, die als Siebelemente (A) oder Geleitzellen (C) identifiziert wurden, zu erkennen. B, D: Lichtmikroskopische Aufnahmen von A und C. X = Xylem; SE = Siebelement; SP = Siebplatte; CC = Geleitzelle; N = Nucleus; Balken: A, B = 50 µm; C, D = 10 µm.

4. Diskussion

4.1 Alonsoa meridionalis transportiert im Phloem vor allem Raffinose und Stachyose,