Das AmSUT1-Protein ist im Phloem von Alonsoa meridionalis lokalisiert

Das Vorhandensein von SUT-mRNA im Phloemsaft ist noch kein eindeutiger Beweis für eine Beteiligung der Saccharose-Transporter AmSUT1 bzw. AbSUT1 an der Phloembeladung. Um diesen Nachweis für den Saccharose-Transporter AmSUT1 zu erbringen, wurde er auf zellulärer und subzellulärer Ebene lokalisiert. Hierzu wurden polyklonale Peptid-Antikörper gegen sowohl den N-Terminus als auch den C-N-Terminus von AmSUT1 hergestellt (2.15.1). Die Herstellung von Antikörpern und anschließende immunocytochemische Lokalisierung erfolgte für den Saccharose-Transporter aus Alonsoa meridionalis, da diese Pflanzenart mit ihrer offenen Phloemanatomie und

hauptsächlich Raffinose-Oligosacchariden als Transportzucker die typischen Merkmale eines vermutlich symplastischen Phloembeladers zeigt.

4.6.1 AmSUT1 ist für die Phloembeladung von Saccharose verantwortlich

Es wird vermutet, daß alle identifizierten Saccharose-Transporter in der Plasmamembran lokalisiert sind (WILLIAMS et al. 2000), obwohl dies bisher nur für einige Transporter nachgewiesen wurde.

Durch ¹⁴C-Saccharose-Aufnahmetests konnte gezeigt werden, daß die in dieser Arbeit charakterisierten Saccharose-Transporter AmSUT1, AbSUT1 und AbSUT2 bei heterologer Expression in Hefe in die Plasmamembran sortiert werden. Durch Western-Blot Analyse wurde zudem belegt, daß AmSUT1 auch in Alonsoa in der Plasmamembran zu finden ist (Abb. 27).

Um nun den genauen Zelltyp zu identifizieren, in dem sich AmSUT1 befindet, wurden unterschiedliche Gewebe in Methacrylat eingebettet, geschnitten, und anschließend AmSUT1 immunohistochemisch primär durch den anti-AmSUT1-N3-Antikörper bzw. sekundär durch einen FITC-markierten Antikörper nachgewiesen (2.15.3). Die Einbettung in Methacrylat führte im Gegensatz zur Cryo-Ultramikrotomie (WINZER 1999) zu einer sehr guten Erhaltung des Gewebes und der Antigenizität von AmSUT1.

Der Saccharose-Transporter AmSUT1 ist in „minor veins“ und Blattadern 3. Ordnung im Phloem, vermutlich in den Intermediärzellen, lokalisiert (Abb. 29). Die genaue Zuordnung des Zelltyps ist bei diesen kleinen Blattadern lichtmikroskopisch nicht möglich. Hierzu wäre eine elektronen-mikroskopische Untersuchung mit Gold-konjugierten Antikörpern notwendig. In den Querschnitten von größeren Blattadern und speziell der Mittelrippe fällt die Bestimmung des Zelltyps jedoch leichter. So ist AmSUT1 in den Geleitzellen der Mittelrippe lokalisiert (Abb. 28). Diese Zellen zeichnen sich im Vergleich zu Siebelementen durch ein dichtes Cytoplasma aus. Es besteht lediglich die Frage, ob es sich beim markierten Geleitzelltyp um Intermediärzellen, gewöhnliche Geleitzellen oder beide Zelltypen handelt. Für die Beantwortung der Frage, ob in Pflanzen mit offener Phloemanatomie Saccharose-Transporter an der Phloembeladung beteiligt sind, ist dies aber von sekundärer Bedeutung. Die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse zeigen eindeutig, daß AmSUT1 das Phloem von Alonsoa meridionalis mit Saccharose belädt, da die „minor veins“ den Ort der Phloembeladung im Blatt darstellen.

Die Lokalisation von AmSUT1 in den Geleitzellen von Blattadern unterschiedlicher Größe deckt sich sehr gut mit den Ergebnissen, die für die Saccharose-Transporter AtSUC2 aus Arabidopsis und PmSUC2 aus Plantago (STADLER et al. 1995, STADLER und SAUER 1996) ermittelt wurden.

Diese beiden Transporter waren ausschließlich in Geleitzellen nachweisbar.

4.6.2 Die Wiederaufnahme von Saccharose in das Phloem während des Ferntransports wird ebenfalls durch AmSUT1 bewirkt

Während die Beladung des Phloems in den Blattadern 4.-7. Ordnung erfolgen soll, findet in den Blattadern 2. und 3. Ordnung, der Mittelrippe und dem Stengel der eigentliche Phloemtransport statt (VAN BEL 1993). Der Saccharose-Transporter AmSUT1 ist auch in diesen Geweben im Phloem lokalisiert. Im Gegensatz zur Mittelrippe, wo er nur in den Geleitzellen zu finden ist (Abb. 28), befindet sich AmSUT1 im Phloem des Stengels sowohl in den Geleitzellen als auch in den Siebelementen (Abb. 31, 32). Hier erfüllt AmSUT1 vermutlich eine „retrieval“-Funktion für Saccharose, die während des Ferntransports aus dem Phloem austritt (GRIMM et al. 1990, 1997, ROTHE et al. 1999). Wie stark dieses Herauslecken tatsächlich ist, konnte bisher für keine Pflanzenart eindeutig bestimmt werden.

AmSUT1 ist der erste Saccharose-Transporter, der immunocytochemisch sowohl in Siebelementen als auch Geleitzellen lokalisiert werden konnte. Alle bisher im Phloem lokalisierten Saccharose-Transporter sind entweder Geleitzell-spezifisch (AtSUC2 und PmSUC2, STADLER et al. 1995, STADLER und SAUER 1996) oder Siebelement-spezifisch (LeSUT1, LeSUT2, LeSUT4, StSUT1 und StSUT4, KÜHN et al. 1997, BARKER et al. 2000, WEISE et al. 2000). Die Lokalisation des Proteins in Siebelementen und Geleitzellen bestätigt zudem den Nachweis von AmSUT1-mRNA im Phloemsaft.

Einige Saccharose-Transporter konnten bisher auch in anderen Geweben als dem Phloem durch Immunolokalisation nachgewiesen werden. So befindet sich AtSUC3 (= AtSUT2) in einer Zellschicht zwischen Phloem und Mesophyll und in einer subepidermalen Zellschicht des Karpells (MEYER et al.

2000). Der Saccharose-Transporter AtSUC1 konnte von STADLER et al. (1999) im Funiculus und Konnektiv von Antheren und in wachsenden Pollen detektiert werden, während PmSUC1 und PsSUT1 sich vor allem im entwickelnden Samen befinden (TEGEDER et al. 1999, R. STADLER, pers.

Mitteilung). Hier sind sie an der Pollen- bzw. Samenernährung beteiligt.

Kürzlich konnte eine weitere Funktion eines Saccharose-Transporters beschrieben werden, die eng mit der Regulation der Öffnungsweite von Plasmodesmata korreliert. RUAN et al. (2001) zeigten, daß das Streckungswachstum von Baumwollfasern durch den Eintransport von Saccharose und Kalium durch den Saccharose-Transporter GhSUT1 und den Kalium-Transporter GhKT1 bei gleichzeitigem Schließen der Plasmodesmata und Erweichung der Zellwand bewirkt wird. Zum Zeitpunkt der höchsten Saccharose-Transporter-Expression gingen die Plasmodesmata vom einfachen zum verzweigten Typ über, was eine drastische Verringerung der Durchlaßgröße zur Folge hatte. Der gleiche Übergang von einfachen zu verzweigten Plasmodesmata wurde auch beim Wechsel von Sink zu Source in Tabakblättern beobachtet (OPARKA et al. 1999). Während einfache Plasmodesmata

sogar den Transport von Proteinen, wie z.B. GFP zulassen, nimmt die Ausschlußgröße bei der Veränderung zu verzweigten Plasmodesmata rapide ab.

Da der erste Saccharose-Transporter erst Anfang der 90er Jahre isoliert wurde, steht die Funktionsanalyse für viele Mitglieder dieser Genfamilie noch aus. Daher werden in den nächsten Jahren vermutlich noch weitere Funktionen dieser Transporterfamilie aufgedeckt werden.