2. Material und Methoden
2.10 DNA-Amplifikation
2.10.4 Amplifikation von cDNA-Enden (RACE)
Durch die RACE-Technik ("rapid amplification of cDNA ends", FROHMAN et al. 1988) ist es möglich, die vollständige Sequenz von cDNAs zu erhalten, falls schon ein Fragment dieser cDNA bekannt ist. Zum einen kann man die Sequenz zwischen Fragment und 3’-Ende und zum anderen zwischen Fragment und 5’-Ende erhalten, indem man durch PCR mit einem genspezifischen Primer und einem Oligo-dT-Primer die gesuchten Teilstücke amplifiziert.
2.10.4.1 3’-RACE
Das 3'-RACE funktioniert prinzipiell wie die RT-PCR (2.9; 2.10.2). Allerdings dienen als forward-Primer von cDNA-Fragmenten abgeleitete Oligonukleotide, als reverse-forward-Primer entweder MM3 oder MM4 (2.1.4).
Zunächst wurde Gesamt-RNA aus einem Gewebe isoliert, in dem die Expression des cDNA-Fragments, dessen 3'-Ende identifiziert werden sollte, am höchsten war. Anschließend wurde aus der Gesamt-RNA die mRNA gewonnen (2.8.1.4).
2.10.4.1.1 cDNA-Synthese
Die cDNA-Synthese im Zuge des 3'-RACE wurde mit einer besonderen Form von Reverser Transcriptase durchgeführt, die eine reverse Transkription bei Temperaturen bis zu 65°C erlaubt ("Thermoscript" Kit, Fa. Gibco BRL).
2 µl der isolierten mRNA (2.8.1.4) wurden mit 1 µl (50 µM) eines dT20-Primers und 7 µl H2O versetzt, 5 min auf 65°C erhitzt und anschließend für 5 min auf Eis gestellt.
Nun wurden folgende Komponenten hinzugefügt: 4 µl 5x RT-Puffer, 1 µl 100 mM DTT, 2 µl 10 mM dNTP, 1 µl H2O, 1 µl RNase-out (40 U/µl), 1 µl Thermoscript Reverse Transcriptase (15 U/µl).
Während einer Inkubation für 1 h bei 50°C erfolgte die Synthese der cDNA. Zur Inaktivierung der Reversen Transcriptase folgte ein Hitzeschock bei 85°C für 5 min. Nun wurde 1 µl RNase H (2 U/µl) zugegeben und 20 min bei 37°C inkubiert.
2.10.4.1.2 3’-RACE-PCR
Da es sich bei Saccharose-Transportern um Gene handelt, die nicht sehr stark exprimiert werden, wurde eine besondere PCR-Variante entwickelt. Diese berücksichtigte, daß einer der Primer (MM3) eine sehr ungünstige Annealing-Temperatur besitzt. Die einzige Möglichkeit, überhaupt Amplifikationsprodukte zu erhalten, begann mit einer ersten PCR, die sowohl im "Hot Start"-Verfahren als auch mit einem "Inversen Touchdown" durchgeführt wurde. Dabei wurde die Annealing-Temperatur in jedem Amplifikationsschritt um jeweils 1°C erhöht. Zusätzlich war noch eine anschließende PCR (Reamplifikation) nötig, um eine ausreichende Amplifikationsrate zu erzielen. In einen Gesamtansatz von 50 µl wurden folgende Komponenten pipettiert:
5 µl 10x Taq-Puffer (100 mM Tris/HCl pH 9.0; 500 mM KCl) 3-6 µl 25 mM MgCl2
1 µl 10 mM dNTP
1 µl genspezifischer Primer (10 pmol/µl) 1 µl MM3-Primer (10 pmol/µl)
2 µl cDNA-Synthese-Produkt (2.10.4.1.1) 1 µl Taq-Polymerase (Zugabe während der PCR) ad 50 µl H2O
Dieser Ansatz wurde gut gemischt und im Thermocycler die Amplifikationsreaktion gestartet.
1. PCR ("Hot Start" + "Inverser Touchdown")
94°C 5 min (Denaturierung)
80°C 3 min (Zugabe der Taq-Polymerase)
94°C 1 min (Denaturierung)
42-55°C 1 min (Annealing, + 1°C/Zyklus) 72°C 2.5 min (Elongation)
Dieser Zyklus wurde 13x wiederholt.
94°C 1 min (Denaturierung) 55°C 1 min (Annealing) 72°C 2.5 min (Elongation) Dieser Zyklus wurde 20x wiederholt.
72°C 7 min (terminale Elongation)
Es folgte eine Reamplifikation, um die Spezifität des PCR-Produkts und dessen Menge durch Nutzung weiterer Primer zu erhöhen. Diese waren zum einen ein weiter innen liegender genspezifischer ("nested") Primer und zum anderen MM4, dessen Sequenz mit Ausnahme des Oligo-dT-Schwanzes der von MM3 entspricht.
2. PCR (Reamplifikation)
Versuchsansatz:
5 µl 10x Taq-Puffer (100 mM Tris/HCl pH 9.0; 500 mM KCl) 3-6 µl 25 mM MgCl2
1 µl 10 mM dNTP
1 µl "nested" Primer (10 pmol/µl) 1 µl MM4-Primer (10 pmol/µl) 0.5 µl PCR-Produkt der 1. PCR
1 µl Taq-Polymerase (Zugabe während der PCR) ad 50 µl H2O
Dieser Ansatz wurde gut gemischt und im Thermocycler die Amplifikationsreaktion gestartet.
Programmierung:
94°C 5 min (Denaturierung)
80°C 3 min (Zugabe der Taq-Polymerase)
94°C 1 min (Denaturierung) 58°C 1 min (Annealing) 72°C 2.5 min (Elongation) Dieser Zyklus wurde 25x wiederholt.
72°C 7 min (Denaturierung)
Durch eine TEA-Agarose-Gelelektrophorese (2.12.1) wurden die Amplifikationsprodukte analysiert.
2.10.4.2 5’-RACE
Das 5'-RACE ist methodisch wesentlich komplizierter als das 3'-RACE, da zusätzlich an das 5'-Ende der cDNA ein Oligo-dA-Schwanz synthetisiert werden muß. An diesen kann sich als Gegenprimer zum genspezifischen Primer ein modifizierter Oligo-dT-Primer anlagern (MM3, 2.1.4). Als Primer für die cDNA-Synthese dient ein genspezifischer Primer, der in dem Bereich des Transkripts liegt, der schon bekannt ist. Dieser Primer ist komplementär zum Transkript und mit seiner freien 3'-OH-Gruppe in Richtung des 5'-Endes des Transkripts orientiert. Daher wird bei der cDNA-Synthese der gesamte 5'-Bereich revers transkribiert.
Zunächst wurde Gesamt-RNA aus einem Gewebe isoliert, in dem die Expression des cDNA-Fragments, dessen 5'-Ende identifiziert werden sollte, am höchsten war. Anschließend wurde aus der Gesamt-RNA die mRNA gewonnen (2.8.1.4).
2.10.4.2.1 cDNA-Synthese
Die cDNA-Synthese im Zuge des 5'-RACE wurde mit einer besonderen Form von Reverser Transcriptase durchgeführt, die eine reverse Transkription bei Temperaturen bis zu 65°C erlaubt ("Thermoscript" Kit, Fa. Gibco BRL).
4 µl der isolierten mRNA (2.8.1.4) wurden mit 0.5 µl (100 pmol/µl) eines genspezifischen Primers und 6.5 µl H2O versetzt, 5 min auf 65°C erhitzt und anschließend für 5 min auf Eis gestellt.
Nun wurden folgende Komponenten hinzugefügt: 4 µl 5x RT-Puffer, 1 µl 100 mM DTT, 2 µl 10 mM dNTP, 1 µl RNase-out (40 U/µl), 1 µl Thermoscript Reverse Transcriptase (15 U/µl). Während einer Inkubation für 30 min bei 60°C erfolgte die Synthese der cDNA. Zur Inaktivierung der Reversen Transcriptase folgte ein Hitzeschock bei 85°C für 5 min. Nun wurde 1 µl RNase H (2 U/µl) zugegeben und 20 min bei 37°C inkubiert. Abschließend wurde der Ansatz mit H2O auf 100 µl aufgefüllt.
2.10.4.2.2 Isolierung der cDNA
Der Ansatz aus der cDNA-Synthese wurde von nicht eingebauten Nukleotiden gereinigt. Dieser Schritt war notwendig, da die Terminale Desoxynukleotidyl-Transferase (TdT) jedes freie Nukleotid an das 3'-Ende von cDNAs anhängen kann. Um freie von gebundenen Nukleotiden zu trennen, erfolgte eine Aufreinigung mit einem "High Pure PCR Product Purification Kit" (Fa. Roche, Mannheim). Das Prinzip der Aufreinigung bestand in der selektiven Bindung von Nukleinsäuren an die Oberfläche von Glasfasern in Anwesenheit eines chaotropen Salzes. Die Elution der cDNAs von den Glasfasern erfolgte mit 50 µl 1x TdT-Puffer (2.10.4.2.3).
2.10.4.2.3 Terminale Desoxynukleotidyl-Transferase-Reaktion
Die Terminale Desoxynukleotidyl-Transferase-Reaktion (TdT-Reaktion, ROYCHOUDHURY et al.
1976) katalysiert die Synthese von Nukleotiden an das freie 3'-Ende von DNA-Molekülen. In diesem Fall wurde ein Oligo-dA-Schwanz an das Ende einer zu amplifizierenden cDNA synthetisiert, um eine definierte Bindungsstelle für einen Gegenprimer (MM3, 2.1.4) zum genspezifischen Primer zur Durchführung einer PCR zu erhalten.
Die Reaktion lief in folgendem Ansatz ab: Zu 50 µl des Eluats aus 2.10.4.2.2 wurden 1 µl 5x TdT-Puffer, 1.5 µl 1 mM dATP, 1.5 µl H2O und 1 µl TdT (19 U/µl, Fa. Promega) gegeben. Der Ansatz wurde eine halbe Stunde bei 37°C inkubiert und anschließend für 5 min auf 70°C erhitzt. 5 µl aus dem Ansatz wurden für die 5’-RACE-PCR verwendet.
5x TdT-Puffer: 500 mM Cacodylat-Puffer pH 6.8 5 mM CoCl2
0.5 mM DTT
2.10.4.2.4 5’-RACE-PCR
Da es sich bei Saccharose-Transportern um Gene handelt, die nicht besonders stark exprimiert werden, wurde eine besondere PCR-Variante entwickelt. Diese berücksichtigte, daß einer der Primer (MM3) eine sehr ungünstige Annealing-Temperatur besitzt. Wie beim 3’-RACE wurde mit einer ersten PCR, die sowohl im "Hot Start"-Verfahren als auch mit einem "Inversen Touchdown" durchgeführt wurde, begonnen. Dabei wurde die Annealing-Temperatur in jedem Amplifikationsschritt um jeweils 1°C erhöht. Zusätzlich waren noch anschließende Reamplifikationen nötig, um eine genügende Amplifikationsrate zu erzielen. In einen Gesamtansatz von 50 µl wurden folgende Komponenten pipettiert:
5 µl 10x Taq-Puffer (100 mM Tris/HCl pH 9.0; 500 mM KCl) 3-6 µl 25 mM MgCl2
1 µl 10 mM dNTP
1 µl genspezifischer Primer (10 pmol/µl) 1 µl MM3-Primer (10 pmol/µl)
2 µl TdT-Produkt (2.10.4.2.3)
1 µl Taq-Polymerase (Zugabe während der PCR) ad 50 µl H2O
Dieser Ansatz wurde gut gemischt und im Thermocycler die Amplifikationsreaktion gestartet.
1. PCR ("Hot Start" + "Inverser Touchdown")
94°C 5 min (Denaturierung)
80°C 3 min (Zugabe der Taq-Polymerase)
94°C 1 min (Denaturierung)
42-55°C 1 min (Annealing, + 1°C/Zyklus) 72°C 1 min (Elongation)
Dieser Zyklus wurde 13x wiederholt.
94°C 1 min (Denaturierung) 55°C 1 min (Annealing) 72°C 1 min (Elongation) Dieser Zyklus wurde 20x wiederholt.
72°C 7 min (terminale Elongation)
Es folgte eine Reamplifikation, um die Spezifität des PCR-Produkts durch Nutzung weiterer Primer zu erhöhen. Diese waren zum einen ein weiter innen liegender genspezifischer ("nested") Primer und zum anderen MM4, dessen Sequenz mit Ausnahme des Oligo-dT-Schwanzes der von MM3 entspricht.
2. PCR (1. Reamplifikation)
Versuchsansatz:
5 µl 10x Taq-Puffer (100 mM Tris/HCl pH 9.0; 500 mM KCl) 3-6 µl 25 mM MgCl2
1 µl 10 mM dNTP
1 µl "nested" Primer (10 pmol/µl) 1 µl MM4-Primer (10 pmol/µl) 0.5 µl PCR-Produkt der 1. PCR
1 µl Taq-Polymerase (Zugabe während der PCR) ad 50 µl H2O
Dieser Ansatz wurde gut gemischt und im Thermocycler die Amplifikationsreaktion gestartet.
Programmierung:
94°C 5 min (Denaturierung)
80°C 3 min (Zugabe der Taq-Polymerase)
94°C 1 min (Denaturierung) 58°C 1 min (Annealing) 72°C 1 min (Elongation) Dieser Zyklus wurde 30x wiederholt.
72°C 7 min (Denaturierung)
Es folgte eine zweite Reamplifikation (3. PCR), um die Menge des PCR-Produkts so zu erhöhen, daß es gut zu isolieren war. Durch eine TEA-Agarose-Gelelektrophorese (2.12.1) wurden die Amplifikationsprodukte analysiert.